一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用，通过筛选合适的纤维素酶，首次实现了对羧甲基纤维素（CMC）的高效转化生产乙醇，其产量达到5.1 g/L。此外，将毕赤酵母工程菌冷冻干燥后可作为复合纤维素酶直接使用，其生物安全性高，并显著降低了现有商品化复合纤维素酶的生产成本。

权利要求

1.一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法，包括下述步骤：（1）将n个IM7基因串联整合到毕赤酵母基因组中，构建重组酵母Y-IMn；所述的n为2或

3，所述的IM7基因序列为SEQ ID NO.6所示；

（2）将重组酵母Y-IMn与CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM混合，孵育；

所述的CL7-CBHI的序列为SEQ ID NO.7所示、CL7-CEL9D的序列为SEQ ID NO.8所示、CL7-BGL的序列为SEQ ID NO.9所示、CL7-CBM的序列为SEQ ID NO.10所示；

（3）纤维素加入到步骤（2）的混合物中，进行厌氧发酵，即得乙醇；

所述的纤维素为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素或羧甲基纤维素。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM的摩尔比为1:1:1:1或2:4:2:7。

4.利用权利要求1所述的方法在厌氧发酵羧甲基纤维素制备乙醇中的应用。

说明书

一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种毕赤酵母表面展示纤维小体工程菌的构建方法，以及在发酵纤维素生产生物乙醇领域的应用。

背景技术

[0002] 随着传统不可再生的化石燃料日渐枯竭，人们迫切需要开发新型可再生清洁能源，如生物乙醇。然而，受全球粮食危机的影响，各国科研人员亟需研发出利用非粮食为原料生产的第二代生物乙醇。目前，使用低成本、环境友好的纤维素生产生物乙醇已经成为生物能源领域的研究热点。首先，纤维素底物需要经过水解糖化才能被微生物利用，进行乙醇发酵。传统工艺使用商品化纤维素酶降解纤维素，因其酶活性偏低、消耗量大而导致生产过程耗时长、生产成本高、产品缺乏市场竞争力。为了解决上述瓶颈问题，近年来人们致力于开发联合生物加工(CBP)的方法—即通过微生物细胞工厂将纤维素水解和乙醇发酵过程统一起来。

[0003] Colicin E7(CE7)是DNase型E群大肠杆菌素之一，其能与大肠杆菌素免疫蛋白相互作用，例如CE7与其免疫蛋白IM7之间的解离常数Kd达到10-14～10-17M，并且通过与大肠杆菌素免疫蛋白的结合大肠杆菌素会失去其生物毒性。异源表达CE7蛋白会因其携带的DNase活性使得表达宿主致死，难以利用CE7蛋白、IM7蛋白之间的强相互作用。2017年Marina N.Vassylyevaa等人基于分子建模设计对CE7蛋白进行了改造，将其命名为CL7蛋白。CL7蛋白完美的保留了与IM7蛋白的超强结合活性，并同时失去了DNA酶活性。

[0004] 目前常见的酵母表面展示系统主要有两种，根据直接展示所用的甘露糖蛋白的不同可分为凝集素表面展示系统以及絮凝素表面展示系统，其中根据凝集素的不同又可分为a-凝集素展示系统与α-凝集素展示系统。酿酒酵母表面直接展示纤维素酶主要是α-凝集素展示系统，其由两个亚单位的糖蛋白组成，725个氨基酸残基的Aga1亚单位通过β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上，69个氨基酸残基的Aga2亚单位通过二硫键与Aga1亚单位连接。纤维素酶融合在Aga2蛋亚基后得以展示。纤维素酶在酿酒酵母上的间接表面展示是指在酵母细胞表面模拟天然纤维小体的结构，首先模拟出不具有催化活性的支架蛋白，该支架蛋白上拥有多个来源于厌氧纤维素水解菌的粘连蛋白以及纤维素结合结构域，然后使用与该粘连蛋白特异性亲附的对接蛋白与纤维素酶融合组成催化域。其中粘连蛋白对(cohesin-dockerin)一般来源于含有天然纤维小体的嗜热细菌或古菌。通过粘连蛋白与对接蛋白的相互作用将纤维素酶嵌合至支架蛋白上，组成一种含有多种纤维素酶空间立体的复合物，这个复合物与AGA2亚基连接，利用二硫键与AGA1亚基连接，实现复合体于酿酒酵母细胞表面的锚定，从而形成人造纤维小体。

[0005] 酿酒酵母因其高乙醇生产率和强乙醇耐受性，被认为是一种理想的CBP产乙醇微生物。含有纤维小体的酿酒酵母能够转化Avicel和磷PASC生成乙醇，但是产量较低(约2g/L)。并实现了利用微晶纤维素(Avicel)或磷酸膨胀纤维素(PASC)底物产乙醇。

[0006] 但是，目前仍未见酵母成功转化羧甲基纤维素(CMC)产乙醇的案例，其原因可能是CMC的超高粘度会削弱水解产物的扩散，进而影响酿酒酵母发酵过程中对还原糖的有效利用。为了实现酵母菌高效转化纤维素生产乙醇在工业领域的应用，还有很长的路要走。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种毕赤酵母表面展示纤维小体工程菌的构建方法，以及在发酵纤维素生产生物乙醇领域的应用。该方法构建的表面展示有纤维小体的毕赤酵母工程菌，酶活性高，耐热性好，可有效催化多种纤维素底物产乙醇，并首次实现了高效转化羧甲基纤维素(CMC)生产乙醇，产量达到5.1g/L。将毕赤酵母工程菌冷冻干燥后可作为复合纤维素酶直接使用，其生物安全性高，生产成本低，有很好的应用前景。

[0008] 为实现本发明的目的，提供了如下技术方案：

[0009] 一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法，包括下述步骤：

[0010] (1)将n个IM7基因串联后整合到毕赤酵母基因组中，构建重组酵母Y-IMn；所述的n为1-5中的任意自然数，所述的IM7基因序列为SEQ ID NO.6所示；

[0011] (2)将重组酵母Y-IMn与CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM混合，孵育；

[0012] 所述的CL7-CBHI的序列为SEQ ID NO.7所示、CL7-CEL9D的序列为SEQ ID NO.8所示、CL7-BGL的序列为SEQ ID NO.9所示、CL7-CBM的序列为SEQ ID NO.10所示；

[0013] (3)纤维素加入到步骤(2)的混合物中，进行厌氧发酵，即得乙醇；

[0014] 所述的纤维素为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素。

[0015] 以上所述的方法中，优选的，所述的n为2或3；

[0016] 以上所述的方法中，优选的，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115；

[0017] 以上所述的方法中，优选的，CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM的摩尔比为1:1:1:1或2:4:2:7；

[0018] 以上所述的方法中，优选的，所述的纤维素为羧甲基纤维素。

[0019] 一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法的应用，包括利用上述方法，通过将纤维素进行厌氧发酵制备乙醇。

[0020] 与现有技术相比，本发明能产生的有益效果包括：

[0021] 本发明通过在毕赤酵母表面高效组装纤维小体，通过筛选合适的纤维素酶，首次实现了对羧甲基纤维素(CMC)的高效转化生产乙醇。获得的毕赤酵母工程菌可冷冻干燥后制备成复合纤维素酶，其生物安全性高，生产成本低，在畜牧养殖业等纤维素酶需求量巨大的行业具有广泛的应用前景。

附图说明

[0022] 图1CL7融合蛋白的纯化结果。

[0023] 图2前30分钟内纤维素底物水解活性测定。

[0024] 图3纤维素厌氧发酵产乙醇及最高产量比较。

具体实施方式

[0025] 为了使本发明的目的、技术路线及优点更加清楚明白，下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

[0026] 如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

[0027] 实施例1：

[0028] 带有CL7标签蛋白的融合蛋白的筛选和构建：

[0029] 通过生物信息学平台，对不同种属来源的纤维二糖水解酶(CBHI)、内切葡聚糖酶(CEL9D)、β-葡萄糖苷酶(BGL)，以及纤维素结合结构域(CBM)基因进行挖掘和序列分析，最终确定了四种基因：来源于Yarrowia lipolytica的纤维二糖水解酶(CBHI，SEQ ID NO.1所示)、Thermoanaerobacterium的内切葡聚糖酶(CEL9D，SEQ  ID NO.2所示)，以及Thermobifida fuscaAvicel的β-葡萄糖苷酶(BGL，SEQ ID NO.3所示)和纤维素结合结构域(CBM，SEQ ID NO.4所示)。

[0030] 此外，申请人还挑选了Xunthomonas multophilia、Aeromonus hydrophila、Seudomonas、Fluvobucterium等微生物中的相关纤维素酶，按照下述实验进行了组合酶活的测定，但效果只有本发明选取的组合酶活的30％-40％。

[0031] 将上述蛋白酶分别在N端融合CL7标签蛋白(SEQ ID NO.5所示)，得到四种融合蛋白：CL7-CBHI(SEQ ID NO.7所示)、CL7-CEL9D(SEQ ID NO.8所示)、CL7-BGL(SEQ ID NO.9所示)、CL7-CBM(SEQ ID NO.10所示)；

[0032] 本发明获得以上融合蛋白的具体方法是将N端融合CL7标签蛋白的纤维二糖水解酶(CBHI)、内切葡聚糖酶(CEL9D)、β-葡萄糖苷酶(BGL)，以及纤维素结合结构域(CBM)的融合基因，构建于pET-23a表达载体。通过大肠杆菌BL31(DE3)表达上述蛋白，并利用镍柱亲和纯化，获得纯度大于80％的蛋白(图1)。本领域技术人员还可采用其他现有的技术获得该融合蛋白，例如人工合成的方式或其他的蛋白表达方式。采用如下方法对酶活进行测定：

[0033] 将四种融合蛋白稀释到统一摩尔浓度5μM，设计实验如表1所示，A、B两组反应温度为50℃，C组反应温度为30℃，每组组合酶投入到三种不同纤维素中进行水解糖化反应。A、B、C各组设有三组平行。

[0034] 表1组合酶酶活的测定

[0035]

[0036] 实验组A底物为微晶纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.123；底物为磷酸膨胀纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.37；底物为羧甲基纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.39。

[0037] 实验组B底物为微晶纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.22；底物为磷酸膨胀纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.53；底物为羧甲基纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.72。

[0038] 实验组C底物为微晶纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.15；底物为磷酸膨胀纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.14；底物为羧甲基纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.33。

[0039] 计算得出酶活：实验组A底物分别为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素时，生成葡萄糖为2.24mg、2.38mg、0.74mg；实验组B底物分别为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素时，生成葡萄糖为5.26mg、7.2mg、2.15mg；实验组C底物分别为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素时，生成葡萄糖为1.46mg、3.3mg、1.5mg。

[0040] 对比实验组A与实验组B实验结果得出，无论是哪种纤维素作为底物当加入CL7-CBM蛋白时纤维素酶体系的总酶活相较于不加入CL7-CBM蛋白都大大提高，也就是说本实验纯化的CL7-CBM蛋白具有碳水化合物结合活性；对比实验组B与实验组C实验结果得出无论是哪种纤维素作为底物，当水解温度由50℃下降为30℃时，组合酶酶活性均下降。

[0041] 实施例2：

[0042] 展示纤维小体的毕赤酵母工程菌的构建：

[0043] IM7基因序列为SEQ ID NO.6所示。多拷贝IM7蛋白之间采用GGGSG柔性多肽进行串联连接。根据支架蛋白的表面展示效率、纤维小体的组装效率对多拷贝IM7支架蛋白的拷贝数进行了筛选，最终选择效果最好的两拷贝和三拷贝的IM7进行毕赤酵母工程菌的制备。

[0044] 具体为：分别将两拷贝IM7和三拷贝IM7菌株的质粒构建到载体质粒pPICZαA的Xho I和Xba I之间转入大肠杆菌克隆菌株DH5α，扩大培养后抽提质粒并测得浓度，将质粒使用Pme1限制性核酸内切酶线性化后通过电击穿孔将目的基因整合到毕赤酵母GS115基因组中，构建重组酵母Y-IM2(含有两拷贝IM7)、Y-IM3(含有三拷贝IM7)，通过PCR鉴定整合成功，并通过流式细胞仪和免疫荧光对其进行鉴定。将成功构建的重组毕赤酵母保存并进行摇瓶培养以获得后续实验材料。其中两拷贝的表面展示效率达到85％、三拷贝的表面展示效率达到93％。

[0045] 按照上述步骤，也制备了含有一拷贝IM7毕赤酵母，IM7的表面展示效率的检测，为78％。

[0046] 因此，本发明采用含有二拷贝和三拷贝的IM7的重组毕赤酵母，用于以下实施例。

[0047] 实施例3：

[0048] 纤维小体组分自组装比例优化：

[0049] 称取0.1g于28℃培养箱中培养48h后的重组毕赤酵母(湿菌)于1.5mL容量EP管中，置于冰水混合物上备用；然后根据表2中(表2中的蛋白比例指得是摩尔比，依次是CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBD的摩尔比例)所述方法计算出各组实验中CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL、CL7-CBD蛋白应投入体积，均匀混合蛋白，加入装有0.1g重组酵母的容量EP管中；最后加入具有10mM CaCl2(pH 8.0)的100mM Tris-HCl缓冲液定容自组装体系至1mL(四个蛋白的总量在体系中的浓度是5μM)，将酵母细胞轻轻吹打悬起混匀后，把1.5mL容量EP管置于静音混合器上孵育2h，孵育温度为4℃。

[0050] 表2高效自组装实验组与对照组

[0051]

[0052] 测酶活时使用的纤维素底物包括：微晶纤维素(Avicel)、磷酸膨胀纤维素(PASC)、羧甲基纤维素(CMC)三种。每个实验组与对照组包含三组平行实验。实验结果如图2所示，实验结果显示按照1:1：1：1和2:4:2:7比例混合后的初始酶活没有影响并有部分提升，可用于后续发酵生产乙醇实验。

[0053] 实施例4：

[0054] 一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法，包括下述步骤：

[0055] 本实施例涉及到的Y-IM0酵母细胞即为野生型毕赤酵母GS115。

[0056] (1)将诱导后的重组酵母Y-IM2、Y-IM3与野生型毕赤酵母Y-IM0菌液分装于灭菌后的50mL容量的离心管中，使用封口膜将离心管口周围封住后，放入冷冻高速离心机6000rpm 5min，除去上清后洗涤酵母细胞2次，置于4℃备用。

[0057] (2)按融合目的蛋白CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBD摩尔比1：1：1：1以及2：4：2：7将组合酶分别与重组毕赤酵母(Y-IM2和Y-IM3)混合(四个蛋白的总量在体系中的浓度是2.5μM)，混合后液体酵母浓度为OD600＝100，于4℃环境混合孵育2h，完成融合纤维素酶(蛋白)与重组酵母Y-IM2、Y-IM3的自组装。同时将Y-IM0酵母细胞与融合目的蛋白CL7-BGL、CL7-CBHI、CL7-CEL9D和CL7-CBD按摩尔比1：1：1：1混合孵育，作为对照组。

[0058] (3)吸取配制好的2×YPA液体培养基、2×YPC液体培养基、2×YPP液体培养基25mL分别置于灭菌烘干后的厌氧瓶中，加入制备的已组装好的重组酵母菌液25mL至厌氧瓶中与培养基混合均匀。厌氧发酵总体积为50mL，OD600＝50。详细厌氧发酵实验中的实验组与对照组如表3所示。

[0059] 配制好发酵液后，将厌氧瓶瓶塞扣紧，使用铝盖钳口密封。然后使用真空泵将厌氧瓶中气体抽尽后，利用充气设备将厌氧瓶中充满氮气，这一过程重复三次后进行厌氧发酵。

[0060] 厌氧发酵在28℃220rpm条件下进行，每12小时使用5mL一次性注射器取样1mL置于1.5mL容量EP管中，12000rpm 5min超速离心后将上清转移至新的1.5mL容量EP管中(注意：
转移时不要吸取到沉淀菌体)。最后使用封口膜将EP管管口封好，保存于-80℃冰箱等待72h样品收集完成后同时测得乙醇浓度。

[0061] (4)从-80℃冰箱中取出厌氧发酵0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取样的发酵液样品，置于室温条件下缓慢溶解，溶解过程中不要打开样品EP管，当样品温度到达室温后使用0.22μm孔径滤膜进行过滤。从4℃冰箱中取出配置好的乙醇(0.5％)定标液升温至室温后使用。将样品稀释到乙醇含量0～1.0g/L，并控制pH值为中性。

[0062] 使用谢尔曼科技有限公司出产的生物传感器M-100进行乙醇浓度的测定，首先放置定标液于定标样品槽中进行定标，定标通过后重复定标三次，然后进行发酵液样品中所含乙醇浓度的测定，每个样品重复测量三次，最后将三次数据求平均值，作为该发酵液中乙醇浓度最终值。实验结果如图3所示。

[0063] 表3厌氧发酵生产乙醇实验的实验组与对照组

[0064]

[0065] 打钩处表示加入相应的组分

[0066] 含有人造纤维小体酵母菌Y-IM2利用微晶纤维素厌氧发酵时，当CL7-CEL9D：CL7-CBHI：CL7-BGL：CL7-CBD为1:1:1:1时乙醇产量最高可达2.5g/L；Y-IM2利用磷酸膨胀纤维素厌氧发酵时，CL7-CEL9D：CL7-CBHI：CL7-BGL：CL7-CBD为2:4:2:7时，乙醇产量最高为1.2g/L；Y-IM3利用羧甲基纤维素厌氧发酵时，CL7-CEL9D：CL7-CBHI：CL7-BGL：CL7-CBD为1:1:1:1时，乙醇产量最高可达5.1g/L。

[0067] 以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。