抗肿瘤药物和用途

摘要

本发明涉及抗肿瘤药物和用途，尤其涉及一种土贝母苷衍生物以及它们的新用途，特别涉及式Ⅰ所示的土贝母苷衍生物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用，其中，土贝母苷衍生物的结构如说明书中所示，该类化合物通过降低肿瘤细胞表面的PD‑L1来治疗肿瘤，同时可以增强免疫细胞的杀伤活性，且具有很好的体内活性且毒性低。

权利要求

1.式I化合物：

或其药学可接受的盐，

其中：

R1为卤素，

R2为C1‑6烷基，

R3为苯基，其任选被1 4个选自下列的基团取代：卤素、羟基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨~

基、硝基、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基。

2.根据权利要求1的化合物，其中所述卤素选自：氟、氯、溴。

3.根据权利要求1的化合物，其中所述C1‑6烷基选自：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。

4.根据权利要求1的化合物，其中所述C1‑6烷氧基是C1‑4烷氧基。

5.根据权利要求1的化合物，其中所述C1‑6烷氧基选自：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。

6.根据权利要求1的化合物，其为选自下列编号TBM‑01至TBM‑19的化合物：编号 R1 R2 R3TBM‑01 氟 甲基 对氯苯基TBM‑02 氟 甲基 对硝基苯基TBM‑03 氟 乙基 3‑甲基苯基TBM‑04 氟 丙基 4‑三氟甲氧基苯基TBM‑05 氟 甲基 4‑羟基苯基TBM‑06 氟 甲基 苯基TBM‑07 氯 甲基 苯基TBM‑08 氯 甲基 对氯苯基TBM‑09 氯 乙基 3‑氨基苯基TBM‑10 氯 丙基 3‑甲基苯基TBM‑11 氯 叔丁基 4‑三氟甲氧基苯基TBM‑12 氯 甲基 4‑羟基苯基TBM‑13 溴 甲基 对氯苯基TBM‑14 溴 甲基 3‑氨基苯基TBM‑15 溴 乙基 3‑甲基苯基TBM‑16 溴 丙基 4‑三氟甲氧基苯基TBM‑17 溴 叔丁基 4‑羟基苯基TBM‑18 溴 甲基 4‑乙基苯基TBM‑19 溴 甲基 苯基或其药学可接受的盐。

7.一种注射液，其包含：TBM‑19化合物10mg，50mg聚乙二醇200，酒石酸20mg，水适量加至1ml；所述TBM‑19化合物是权利要求6所述编号为TBM‑19的化合物。

8.根据权利要求7的注射液，其是照如下方法制备得到的：使TBM‑19化合物、聚乙二醇和酒石酸加至配液总体积80%的水中，搅拌使物料溶解，用1M盐酸或者1M氢氧化钠调节药液pH值=6.8，加水至全量，使所得药液过滤，分剂量分装并密封包装，对所得药液进行灭菌，即得注射液。

9.权利要求1‑6任一项所述化合物在制备用于治疗选自下列的癌症的药物中的用途：肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌。

10.根据权利要求9的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

说明书

抗肿瘤药物和用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种土贝母苷乙衍生物的新用途，特别涉及式I化合物所示的土贝母苷乙衍生物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐。本发明还涉及
式I化合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。本发明式I化合物的土贝母苷乙衍生物的
结构如说明书中所示，该类化合物通过降低肿瘤细胞表面的PD‑L1来治疗肿瘤，同时可以增
强免疫细胞的杀伤活性，且具有很好的体内活性且毒性低。

背景技术

[0002] 免疫检查点(Immune checkpoints)是指机体免疫系统中存在的一些抑制性信号分子，通过调节外周组织中免疫反应的强度和持续性来避免自身组织损伤。免疫检查点阻
断剂(Immune checkpoint inhibitors，ICIs)可阻断免疫检查点之间的相互作用，打破肿
瘤细胞免疫逃逸机制，使T细胞活化并杀死肿瘤细胞的同时，还可通过异位效应发挥抗肿瘤
作用。与化疗或者靶向治疗不同，ICIs可以在一定比例的患者中诱导持续性的免疫应答，甚
至在停止治疗后，可以产生持久的肿瘤特异性免疫记忆。因此，免疫检查点阻断疗法已成为
一种新的有效的肿瘤治疗方式。

[0003] PD‑L1(又称B7‑H1)，作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员，广泛地高表达于多种恶性肿瘤如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和肾小细胞癌细胞的表面。PD‑L1的高表达
与T细胞的增殖和杀伤活性密切相关。此外，PD‑1/PD‑L1相互作用还可诱导抗原特异性T细
+ +
胞凋亡，促进CD4T细胞向Foxp3 调节性T细胞分化，从而导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，
使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤。因此，PD‑1/PD‑L1信号通路已成为恶性肿瘤免疫治
疗的有效靶点。

[0004] 土贝母是一种传统中药，药用历史悠久，其味苦，性凉，具有清热解毒、抗炎消肿及抗肿瘤等药理作用。皂苷是土贝母中的主要活性成分，包括土贝母苷甲、苷乙和苷丙等，其
中土贝母苷乙(Tubeimoside II，TBM‑II)是土贝母中得率较高、水溶性和稳定性较好的活
性成分。

[0005] 土贝母苷乙早在1988年即有报道(孔凡华，等，土贝母化学成分的研究Ⅳ.土贝母苷乙、丙、丁的结构，化学学报，1988年04期)，其为白色粉末，分子式C63H98O30，[α]D—6.0
+
(c0.32，吡啶)，Mr1334(SIMS：m/z，1335[M+H])。苷元为远志酸，所含的糖为葡萄糖、鼠李糖、
13
阿拉伯糖和木糖，摩尔比为1:1:2:1.1。土贝母苷乙的 C NMR谱中显示五个糖端基碳信号(δ
106.4，104.8，103.2，100.8和94.3ppm)和3‑甲基‑3‑羟基戊二酸残基的特征信号(δ171.3，
171.2，70.2，47.1，46.8和26.2ppm)。土贝母苷乙的CAS No.115810‑12‑3，其化学结构式如
下：

[0006]

[0007] 土贝母苷乙含有独特的五环三萜类结构，它对多种肿瘤在体内外均具有明显的抑制作用，但恶心、呕吐以及胃肠道反应等副作用限制了其进一步在临床上的应用。

[0008] 因此，本领域仍然期待有新的治疗肿瘤的方法，例如通过对土贝母苷乙进行结构改造以提高其抗肿瘤活性和/或降低其毒副作用。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种新的治疗肿瘤的方法，例如通过对土贝母苷乙进行结构改造以提高其抗肿瘤活性和/或降低其毒副作用。已经出人意料地发现，本发明提供的土
贝母苷乙衍生物呈现一个或者多个方面的出人意料的技术效果，本发明基于此类发现而得
以完成。

[0010] 为此，本发明第一方面提供了如下式I化合物：

[0011]

[0012] 或其药学可接受的盐、光学异构体、溶剂合物，

[0013] 其中：

[0014] R1为卤素，

[0015] R2为C1‑6烷基，

[0016] R3为苯基，其任选被1～4个选自下列的基团取代：氢、卤素、羟基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、硝基、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基。

[0017] 根据本发明第一方面的化合物，其中所述卤素选自：氟、氯、溴。

[0018] 根据本发明第一方面的化合物，其中所述C1‑6烷基选自：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。

[0019] 根据本发明第一方面的化合物，其中所述C1‑6烷氧基选自：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。

[0020] 根据本发明第一方面的化合物，其中R3为氢或者1～3个选自下列的基团：卤素、羟基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、硝基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁
基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧
基。

[0021] 根据本发明第一方面的化合物，其为选自下列的化合物：

[0022]

[0023]

[0024] 或其药学可接受的盐、光学异构体、溶剂合物。

[0025] 进一步的，本发明第二方面提供了制备式I化合物或其药用盐的方法，其包括如下步骤：

[0026] 步骤(1)：将TBM‑Ⅱ溶于DMF中，加入NBS，随后加入催化量的AIBN，室温反应，待反应结束后，加入20ml水、30ml乙酸乙酯处理反应，收集水相，浓缩，干燥，得固体为TBM‑Ⅱ‑1；

[0027] 步骤(2)：将TBM‑Ⅱ‑1溶于DMF中，冰浴下加入咪唑、TIPDSCl2，室温反应，待反应结束，向体系中加入TBSOTf、咪唑，室温反应，反应结束后，用乙酸乙酯和水处理反应，有机相
干燥浓缩，得固体为TBM‑Ⅱ‑2；

[0028] 步骤(3)：将TBM‑Ⅱ‑2溶于ACOH：水：THF混合溶液中，室温搅拌，待反应结束，用乙酸乙酯和水处理反应，有机相浓缩，干燥，得固体为TBM‑Ⅱ‑3；

[0029] 步骤(4)：将TBM‑Ⅱ‑3溶于DMF中，在冰浴下加入苯磷酰二氯、四氮唑、DIPEA，待反应完全，加入丙氨酸甲酯，继续反应，TLC监控反应，待反应结束，向体系中加入TBAF，室温反
应，待反应结束，加水编目反应，剩余物经硅胶柱纯化，得固体的TBM‑19。

[0030] 根据本发明第二方面的方法，其具有如实施例1所述的操作过程。

[0031] 进一步的，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一项所述化合物或者本发明第二方面任一项所述方法制备的化合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。例如，所述
癌症例如但不限于肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌。

[0032] 进一步的，本发明第四方面提供了一种注射液，其包含：TBM‑19化合物10mg，50mg聚乙二醇200，酒石酸20mg，水适量加至1ml。

[0033] 进一步的，该注射液是照如下方法制备得到的：使TBM‑19化合物、聚乙二醇和酒石酸加至配液总体积80％的水中，搅拌使物料溶解，必要时用1M盐酸或者1M氢氧化钠调节药
液pH值＝6.8，加水至全量，使所得药液过滤，分剂量分装并密封包装，对所得溶液进行灭
菌，即得注射液。

[0034] 本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互
之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一
步的描述。

[0035] 本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和
短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和
短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表
述的含义为准。

[0036] 土贝母(Tubeimu)是葫芦科假贝属植物的干燥块茎，是一种传统中药，载于清代赵学敏编著的《本草纲目拾遗》。古代用它的块茎来治疗乳痈、乳腺增生和瘰疬等疾患，临床上
显示出明显的散结毒、消痈肿效果。土贝母苷乙是从中药土贝母中分离出来的一种单体有
效成分。土贝母苷乙与苷甲一样，水溶性好、稳定性强。

[0037] 已知土贝母苷乙具有明显的对体外人肿瘤细胞的抑制作用，多种人恶性肿瘤细胞株，如胰腺癌(PANC‑I)、胃癌(HCG‑27)、结肠癌(COLO320DM)、子宫颈癌(HeLacells)、神经母
细胞瘤(GOTO)、胶质母细胞瘤(A‑127)、早幼粒白血病(HL‑60)、低分化鼻咽癌(CNE‑2Z)都对
苷甲和苷乙敏感，尤以A‑127、GOTO、HL‑60等细胞为甚，其中GOTO和HL‑60细胞还能被诱导分
化。此外，有报道土贝母苷乙还对小鼠可移植性肿瘤生长有明显的抑制作用，土贝母苷甲和
土贝母苷乙对小鼠可移植性肿瘤Sl80，H22和艾氏腹水癌的生长都有明显的抑制效果，苷甲
剂量为4mg·kg‑1·d‑1(im，19d)时，其抑瘤率达59.0％；土贝母苷乙剂量为4mg·kg‑1·d‑
1(ip，16d)，其抑瘤率达71.5％，效果高于阳性对照药物氟尿嘧啶和环磷酰胺。定量构效关
系研究的结果表明，土贝母苷乙的抗瘤活性优于苷甲。此外，有报道土贝母苷乙还具有抗促
癌效果，土贝母苷甲和土贝母苷乙都有明显的抗癌效果，但土贝母苷乙的效果优于苷甲。苷
甲的局部用量在每耳100μg和50μg时对花生四烯酸(AA)和12‑O‑十四酚佛波‑13‑乙酸酯
(TPA)诱发的鼠耳水肿表现出量效依赖关系十分明显的抑制效果；苷甲具有抑制TPA增强3H
掺入C3H10Tl2克隆8细胞磷脂的作用，这一效果在苷甲浓度低至5μg·mL‑1仍可测出，而且
有显著的量效依赖关系；苷甲的局部应用能够完全抑制二甲基苯并蒽(DMBA)激发的、TPA促
进的小鼠皮肤乳头状瘤的发生。饮水中加入苷甲和苷乙能减少小鼠皮肤肿瘤的发生，但经
胃肠道应用的苷丙却促进小鼠皮肤肿瘤的发生。已知土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母
皂苷可用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物。土贝母甘乙明显抑制人脐静脉内
皮细胞ECV‑304的增殖，促进其凋亡；土贝母苷乙明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜的和肿瘤细胞在
鸡胚绒毛尿囊膜诱导的血管生成；土贝母苷乙明显抑制肿瘤组织微血管的生成；土贝母苷
乙明显抑制肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)的表达；土贝
母苷乙明显抑制小鼠B16黑色素瘤细胞的实验转移和Lewis肺癌细胞的自发转移；土贝母苷
乙诱导Lewis肺癌组织中促转移基因CD44v6和ErBb‑2的表达下调，抑转移基因nm23‑H1的表
达上调。土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷可用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和
转移的药物。土贝母苷乙可用于制备防治人和动物病毒性疾病的药物药饵。土贝母苷乙和
土贝母皂苷抑制人和动物病毒的复制，对人和动物病毒性疾病有预防和治疗效果，可用于
预防和治疗人和动物各种病毒性疾病。土贝母苷乙和皂苷表现了特别的抗炎症作用，能显
著抑制人恶性肿瘤细胞和小鼠移植性肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存期，对HL‑60细胞有诱
导分化效果，能对抗促癌剂对小鼠皮肤肿瘤发生的促进作用。

[0038] 本发明通过对土贝母苷乙进行结构改造，获得的衍生物呈现一个或者多个方面的效果。

附图说明

[0039] 图1：TBM‑19下调肿瘤细胞中PD‑L1的表达。人肺癌H460和H157细胞经不同浓度的TBM‑19处理24h后，western blot检测细胞中PD‑L1蛋白水平的变化。

[0040] 图2：TBM‑19诱导肿瘤细胞表面PD‑L1的表达下降。(A)为TBM‑19(5μM)处理H460细胞24h后，流式细胞术检测细胞膜表面PD‑L1蛋白表达的变化。(B)为TBM‑19(5μM)处理H460
细胞24h后，荧光显微镜观察H460细胞与PD‑1‑Fc之间的结合变化。

[0041] 图3：TBM‑19增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。(A)为T细胞与肿瘤细胞共培养示意图。(B)为人T细胞与DMSO或TBM‑19(5μM)处理后的H460细胞共培养，LDH法检测H460细胞
死亡率变化。(C)为人T细胞与DMSO或TBM‑19(5μM)处理后的H460细胞共培养，细胞阻抗实验
检测H460细胞死亡率变化。

[0042] 图4：TBM‑19抑制Lewis肺癌移植瘤生长。(A)为TBM‑19的体内Lewis肺癌移植瘤小6
鼠实验图，对照组和实验组各五只C57小鼠，每只接种2.5×10个肿瘤细胞，第3天开始腹腔
给药。(B)为TBM‑19能有效抑制Lewis移植瘤的生长。(C)为TBM‑19明显抑制Lewis移植瘤的
体积。(D)为TBM‑19显著抑制Lewis移植瘤的瘤重。(E)为TBM‑19给药期间，小鼠体重变化情
况。

[0043] 图5：TBM‑19增加肿瘤浸润性淋巴细胞并激活T细胞。小鼠瘤组织经Collagenase IV和DNase 1处理消化为单个细胞后，(A)为流式细胞术检测给药后免疫细胞占比和T细胞
﹢
激活的方法。(B)为流式细胞术检测肿瘤组织内免疫细胞(CD45)的占比情况。(C)为流式细
﹢ ﹢ ﹢ ﹢
胞术检测肿瘤浸润性T细胞(IFN‑γCD8CD3CD45)的激活情况。

具体实施方式

[0044] 通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以
对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性
和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，
但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

[0045] 实施例1：TBM‑19(R1＝溴，R2＝甲基，R3＝苯基)的制备

[0046] 示意性反应路线如下：

[0047]

[0048]

[0049] 步骤(1)：将TBM‑Ⅱ(2g、1.5mmol)溶于10mL DMF中，在0℃加入NBS(0.3g、1.65mmol)，随后加入催化量的AIBN，室温反应，TLC监控反应(氯仿：甲醇：水＝6：4：1)，反应
结束，加入20ml水，30ml乙酸乙酯处理反应，收集水相，浓缩，冻干，得1.8g黄色固体TBM‑Ⅱ‑
+
1(MS：m/z 1335[M+Na])。

[0050] 步骤(2)：将TBM‑Ⅱ‑1(1.6g、1.13mmol)溶于25ml DMF中，冰浴下加入咪唑(0.3g，、4.5mmol)，TIPDSCl2(0.4g、1.24mmol)，室温反应，TLC监控反应，待反应结束，向体系中加入
TBSOTf(4.5g、17mmol)，咪唑(1.23g，18mmol)，室温反应，TLC监控反应，反应结束，用乙酸乙
酯和水处理反应，有机相干燥浓缩，得2.5g类白色固体TBM‑Ⅱ‑2；

[0051] 步骤(3)：将TBM‑Ⅱ‑2(2.5g、0.8mmol)溶于15ml(ACOH：水：THF＝4：4：7)溶液中，室温搅拌，TLC监控，待反应结束，用乙酸乙酯和水处理反应，有机相浓缩旋干，得2.1g类白色
固体TBM‑Ⅱ‑3。

[0052] 步骤(4)：将TBM‑Ⅱ‑3(2g、0.6mmol)溶于10mlDMF中，在冰浴下加入苯磷酰二氯(0.17g、0.86mmol)、四氮唑18mg、DIPEA(0.22g、0.2mmol)，待反应完全，加入丙氨酸甲酯
(0.1g、0.1mmol)，继续反应，TLC监控反应，待反应结束，向体系中加入TBAF(2g、7.6mmol)，
室温反应，TLC监控反应，待反应结束，加水冻干反应体系，剩余物经硅胶柱纯化，得TBM‑19
+ 1
为类白色固体0.7g(C73H109BrNO33P，MS：m/z 1660[M+Na]))。H NMR(500MHz,Pyridiene‑D5/
D2O):δ7.24‑7.31(m,5H)，6.09(s,1H),6.01(d,1H),6.00(br,1H),5.48(br,1H),5.17(br,
1H),5.14(d,1H),5.08(d,1H),5.01(d,1H),4.82(dd,1H),4.74(m,1H),4.63‑4.60(m,2H),
4.55(dd,1H),4.50‑4.42(m,6H),4.36‑4.21(m,8H),4.17‑4.00(m,4H),3.93‑3.85(m,3H),
3.75(m,2H),3.65(s,3H),3.56(m,2H),3.36(d,1H),3.33(m,2H),3.23(d,1H),3.15‑3.12
(m,5H),3.04(d,1H),2.05(s,3H),1.66(s,3H),1.60‑1.57(m,6H)1.54(s,3H),1.53(d,3H),
1.45(m,4H)1.34(s,3H),1.28(s,3H),1.25(s,3H),0.95(m,1H)0.93(s,3H),0.87(s,3H)。
13
CNMR(125MHz,Pyridiene‑D5):δ176.3,171.5,171.2,170.8,144.3,134.2,131.1,131.1,
128.7,128.7,123.3,106.2,105.6,105.2,102.1,94.5,83.2,79.0,77.9,77.6,77.6,77.3,
76.7,75.3,75.0,74.9,73.5,73.3,73.2,72.0,71.7,71.5,70.9,70.7,70.2,68.8,67.9,
66.7,66.5,64.6,62.6,62.4,52.3,51.9,49.6,48.4,47.6,47.5,47.1,46.9,44.1,42.7,
42.3,41.5,39.7,36.9,34.1,33.3,33.0,32.1,30.7,28.9,26.0,25.7,23.9,23.4,22.8,
19.1,18.7,18.4,17.7,17.5,15.4。

[0053] 【高效液相色谱法A】或称为【HPLC法A】：

[0054] 1)照中国药典2010年版二部附录VD所载高效液相色谱法进行；

[0055] 2)色谱条件与系统适用性试验：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB‑C8，4.6*250mm，5μm色谱柱)；以0.1％磷酸溶液(用三乙胺调节pH值
至4.50±0.05)‑乙腈(40：60)为流动相；

[0056] 流速为每分钟1ml(TBM‑19峰的保留时间在8～9分钟范围内，检测波长为226nm，柱温30℃；

[0057] 取供试品溶液适量，于60℃处放置18～20小时，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，理论板数按TBM‑19峰计算应不低于3000，在相对TBM‑19峰保留时间约1.53处应出现杂
质峰(在本发明中可称为RRT1.53杂质)，与TBM‑19峰的分离度大于4，符合常规分析方法要
求。

[0058] 实施例1所得TBM‑19经测定，HPLC色谱纯度为99.26％，主成分对照法计算RRT1.53杂质的含量为0.272％，其余单一杂质均小于0.02％，除RRT1.53杂质之外的其余杂质总和
小于0.1％。这一结果表明实施例1所得TBM‑19表明纯度高，但存在一个典型杂质即RRT1.53
杂质。经初步分析，此RRT1.53杂质是TBM‑19之磷酰基团断裂所形成的下式所示土贝母类似
物：

[0059]

[0060] 实施例2：制备本发明呈注射液形式的药物组合物

[0061] 作为可用于抗肿瘤的药物，将其配制成注射液的形式是有益的。

[0062] 本实施例提供如下配方的注射液：

[0063] TBM‑19化合物：10mg，

[0064] 聚乙二醇200：50mg，

[0065] 酒石酸：20mg，

[0066] 水：适量，加至1ml；

[0067] 注射液制法：使TBM‑19化合物、聚乙二醇和酒石酸加至配液总体积80％的水中，搅拌使物料溶解，必要时用1M盐酸或者1M氢氧化钠调节药液pH值＝6.8，加水至全量，使所得
药液过滤，分剂量分装(5ml/瓶)并密封包装，对所得溶液进行灭菌(121℃，15min)，即得注
射液。

[0068] 实施例2a：制备TBM‑19化合物注射液

[0069] 参照实施例2的配方和制法，不同的仅是不添加聚乙二醇，得到注射液。

[0070] 实施例2b：制备TBM‑19化合物注射液

[0071] 参照实施例2的配方和制法，不同的仅是不添加酒石酸，得到注射液。

[0072] 实施例2c：制备TBM‑19化合物注射液

[0073] 参照实施例2的配方和制法，不同的仅是不添加聚乙二醇和酒石酸，得到注射液。

[0074] 实施例3：稳定性考察

[0075] 使TBM‑19化合物(粉末)、实施例2注射液、实施例2a注射液、实施例2b注射液、实施例2c注射液在密封条件下，在40℃温度下放置5个月，使用【HPLC法A】测定这些试样在0月时
以及5月时RRT1.53杂质的含量(相对于TBM‑19化合物而言)。

[0076] 对于各试样，用下式计算RRT1.53杂质的“高温增加百分数”，即RRT1.53杂质含量的高温增加百分数(％)，是指在40℃的高温条件下放置5个月，试样中该杂质5月含量减去
该杂质0月含量所得的差值除以该杂质0月含量再乘以100％，即以下式计算：

[0077]

[0078] 结果显示，实施例TBM‑19化合物的RRT1.53杂质高温增加百分数均在16.4％、。

[0079] 实施例2注射液的RRT1.53杂质高温增加百分数均在24.2％、实施例2a注射液的RRT1.53杂质高温增加百分数均在163.7％、实施例2b注射液的RRT1.53杂质高温增加百分
数均在211.6％、实施例2c注射液的RRT1.53杂质高温增加百分数均在231.4％。

[0080] 以上结果表明，在制备TBM‑19化合物的液体制剂特别是含水液体制剂时，仅在同时使用聚乙二醇和酒石酸的条件下，才能有效抑制活性成分的降解，它们在本发明中发挥
的作用是现有技术完全无法预见的。另外，计算5月时实施例2注射液中活性成分含量相对
于其在0月时的含量，即活性成分残余含量，结果为99.1％，表明该注射液的活性成分的含
量无明显变化，从而表明本发明注射液组合物是一种特别稳定的含水液体药物制剂。

[0081] 试验例1：细胞膜表面PD‑L1的表达分析

[0082] 将H460、MHCC97H、Panc‑1等肿瘤细胞以5×105/ml的浓度接种至6孔板，每孔1ml。于加药组中加入待测药物，使其终浓度为10μM，对照组中加入等量DMSO，于无菌培养箱内培
养24小时。细胞经0.25％胰酶消化后，用PBS洗涤2次，1500rpm，5分钟离心收获细胞。用200μ
l PBS重悬细胞后，取出100μl加入5μl PE标记的IgG抗体，剩余100μl细胞悬液加入5μl PE
标记的PD‑L1抗体，于4℃孵育30分钟。离心弃掉上清，用PBS洗涤两次，用500μl PBS重悬细
胞，经300目筛网过滤至流式管中，上机检测。

[0083] 结果：

[0084] (1)TBM‑19对肿瘤细胞中PD‑L1表达的下调作用：使用不同剂量(0.5、1、2.5、5、7.5μM)的TBM‑19处理人肺癌H460、H157细胞24h，通过Western blot检测肿瘤细胞中PD‑L1蛋白
表达的变化。结果表明，TBM‑19对PD‑L1蛋白水平的下调作用具有浓度依赖性，TBM‑19使用
浓度为5～10μM时即可明显降低肿瘤细胞中PD‑L1蛋白的表达水平。具体结果见图1，为TBM‑
19下调肿瘤细胞中PD‑L1的表达，显示了人肺癌H460和H157细胞经不同浓度的TBM‑19处理
24h后，western blot检测细胞中PD‑L1蛋白水平的变化。另外，对TBM01至TBM18进行测定，
可以得到与TBM基本一致的结论。

[0085] (2)TBM‑19对肿瘤细胞表面PD‑L1的下调作用：为分析TBM‑19是否也会引起细胞膜表面PD‑L1的下降，我们分别用TBM‑19处理H460，24h后通过流式细胞术检测细胞膜表面PD‑
L1蛋白表达的变化情况。此外，我们还将TBM‑19预处理24h后的H460细胞与重组的人PD‑1‑
Fc蛋白相互作用，利用荧光抗体标记Fc，在荧光显微镜下观察PD‑1与PD‑L1蛋白的结合情
况。流式细胞实验结果表明，TBM‑19可明显下调H460和MB231细胞膜表面PD‑L1的表达(参见
图2A，表明TBM‑19(5μM)处理H460细胞24h后，流式细胞术检测细胞膜表面PD‑L1蛋白表达的
变化)。荧光显微镜结果也证实，TBM‑19可减少H460细胞表面PD‑L1与PD‑1‑Fc的结合(参见
图2B，表明TBM‑19(5μM)处理H460细胞24h后，荧光显微镜观察H460细胞与PD‑1‑Fc之间的结
合变化)。

[0086] 试验例2：体外共培养细胞的激活分析

[0087] 将肿瘤细胞以5×104/ml的浓度接种于96孔细胞培养板，每孔100μl。于加药组加入终浓度为10μM的测试化合物(在本发明中，如未特别说明，所用溶剂为DMSO或水)，置37
5 5
℃，5％CO2的无菌培养箱内培养24小时。将激活的人T细胞或NK细胞以2.5×10/ml、5×10 /
ml的浓度接种于已铺有H460等肿瘤细胞的96孔板中共培养3小时。于最大LDH释放组中加入
20μl裂解液作用45分钟。取出96孔板，于1500rpm，离心5分钟，取50μl上清液于新的96孔板
中，加入50μl底物避光反应30min。再向每孔中加入50μl终止液，于492nm处测定吸收值。每
孔的吸收值与最大LDH释放组的吸收值的比值进行统计学计算。此外，按照多功能实时无标
记细胞分析仪(RTCA DP，ACEA Biosciences Inc.)的操作说明，向E‑Plate检测板加入100μ
4
l完全培养基培养基并测定背景阻抗值。然后以5×10 /ml的浓度接种H460细胞于E‑Plate
检测板中，放入检测台进行细胞增殖的实时动态检测，细胞培养6h后加入TBM‑19继续处理
24h，再加入激活的T/NK细胞进行共培养，继续进行细胞增殖的实时动态检测。

[0088] 结果：

[0089] TBM‑19促进共培养的T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性：我们将TBM‑19处理后的肿瘤细胞与IL‑2/anti‑CD3刺激后的T细胞共培养(图3A)，通过检测上清中LDH的释放量来判断T
细胞对肿瘤细胞杀伤活性的变化。LDH实验结果表明，使用TBM‑19处理细胞后，T细胞对H460
的杀伤活性明显增加，其效果要好于土贝母苷乙(图3B，显示人T细胞与DMSO或TBM‑19(5μM)
处理后的H460细胞共培养，LDH法检测H460细胞死亡率变化)。此外，利用实时无标记细胞分
析仪，通过细胞阻抗法(Cell index assay)我们还检测了T细胞对H460细胞的杀伤作用。结
果表明，TBM‑19处理H460细胞后可增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(图3C，显示人T细胞与
DMSO或TBM‑19(5μM)处理后的H460细胞共培养，细胞阻抗实验检测H460细胞死亡率变化)。

[0090] 试验例3：TBM‑19对Lewis肺癌移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用

[0091] 取6周龄雌性C57 BL/6小鼠(18‑22g，北京维通利华实验动物技术有限公司)作为实验对象，每组10只动物，腋下接种小鼠Lewis肺癌细胞。接种72小时后，腹腔给药，实验组
给药剂量分别为1、2、4mg/kg，空白对照组给予200μl生理盐水，每日给药一次，共给药18天。
接种后，每两天测量一次小鼠体重；给药第三天开始，每隔2天测量一次瘤体积。给药后第19
天处死小鼠，取瘤组织样本进行基因芯片，免疫组化等实验；分离肿瘤浸润T细胞和NK细胞，
流式细胞术检测T/NK细胞的激活；取心，肝，脾，肺，肾制作病理切片；取血液测定生化指标
的变化。

[0092] 结果：

[0093] TBM‑19抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长：利用小鼠肺癌移植瘤模型，我们探究了TBM‑19的体内抗肿瘤效果。将小鼠Lewis肺癌细胞注射至C57 BL/6小鼠的腋下成瘤，第3
天开始腹腔给药10mg/kg的TBM‑19(参见图4A，显示TBM‑19的体内Lewis肺癌移植瘤小鼠实
6
验图，对照组和实验组各五只C57小鼠，每只接种2.5×10 个肿瘤细胞，第3天开始腹腔给
药)，第18天给药结束。通过测定给药过程中荷瘤小鼠的体重、移植瘤体积的变化评价TBM‑
19的体内抗肿瘤效果。结果表明，TBM‑19可明显减缓移植瘤的生长(参见图4B，显示TBM‑19
能有效抑制Lewis移植瘤的生长。(C)为TBM‑19明显抑制Lewis移植瘤的体积)，给药结束后
可观察到TBM‑19对于移植瘤的瘤重和瘤体积均有明显的抑制作用(参见图4C、图4D，显示
TBM‑19显著抑制Lewis移植瘤的瘤重)。此外，给药期间TBM‑19不影响小鼠的体重(参见图
4E，显示TBM‑19给药期间，小鼠体重变化情况)。

[0094] 试验例4：肿瘤浸润免疫细胞分析

[0095] 首先制备肿瘤组织单细胞悬液：向6孔板中加入适量配置好的解离液(DMEM+400unis/mL Collagenase IV+100ug/mL DNase 1)，待用，将小鼠处死，分离肿瘤，称重、无
菌眼科剪剪碎，置于加好解离液的孔板中，将6孔板置于37℃摇床30‑60min，吸出解离后的
上清，经70μm尼龙筛网过滤后移入离心管。500g 5min离心，弃上清，用PBS 500uL重悬后再
次离心，离心后吸出上清液，加入PBS 100uL重悬，即为单细胞悬液。第二步将单细胞染色，
TM
向其中加入死活染料试剂，再向上述试剂中加入受体封闭试剂TruStain fcX (anti‑mouse 
CD16/32)Antibody，于4℃冰箱孵育15min。最后进行多色抗体染色，将孵育后的离心管取出
离心(350g‑500g，5min)，离心后弃上清液并加入Staining Buffer 100uL,摇晃或吹吸使细
胞重悬后再次离心，重复两次，离心后弃去上清液加入100μL Staining Buffer重悬，然后
分别根据计算所得稀释倍数依次添加流式抗体，将离心管置入4℃冰箱孵育15min，洗涤，上
机检测。

[0096] 结果：

[0097] TBM‑19激活肿瘤浸润性T细胞：为考察TBM‑19对肿瘤浸润性免疫细胞的影响，我们选取空白对照或TBM‑19处理过的肿瘤组织，经Collagenase IV和DNase 1处理消化为单个
细胞后，分离浸润性免疫细胞，用流式细胞仪分析了CD45阳性免疫细胞的比例和T细胞的激
活情况(参见图5A，显示流式细胞术检测给药后免疫细胞占比和T细胞激活的方法)。结果表
+
明，TBM‑19可使肿瘤组织中CD45免疫细胞的数量增加(参见图5B，显示流式细胞术检测肿
﹢ ﹢
瘤组织内免疫细胞(CD45)的占比情况)，同时还能激活肿瘤浸润性T细胞，表现为IFN‑γ
﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢
CD8CD3CD45比例增加(参见图5C，显示流式细胞术检测肿瘤浸润性T细胞(IFN‑γ CD8CD3
﹢ ﹢
CD45)的激活情况)。