外泌体、其制备方法及其应用

摘要

本发明涉及外泌体的制备技术领域，具体而言，涉及外泌体、其制备方法及其应用。利用表型转换培养基培养心肌成纤维细胞，使得所述心肌成纤维细胞的表型发生转化，并获得外泌体，其中，所述表型转换培养基中不含有生长因子和外源外泌体，且所述表型转换培养基中血清的含量大于0％，且小于0.1％。该外泌体的制备利用不利于心脏修复的心肌成纤维细胞，实现了变废为宝，且利用表型转换培养基对心肌成纤维细胞进行培养，使其表型发生转换，继而使得形成的外泌体具有修复心脏的功效，并对心血管疾病有良好治疗作用。

权利要求

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括：利用表型转换培养基培养心肌成纤维细胞，使得所述心肌成纤维细胞向内皮细胞方向的表型转化，并获得外泌体，其中，所述表型转换培养基中不含有生长因子和外源外泌体，且所述表型转换培养基中血清的含量大于

0％，且小于0.1％；所述表型转换培养基包括IMDM和双抗；

在利用所述表型转换培养基培养所述心肌成纤维细胞之前，利用含有8-20％血清的预处理培养基培养所述心肌成纤维细胞12-18小时，而后将所述预处理培养基更换为所述表型转换培养基并进行培养；

制备所述预处理培养基的步骤包括：将IMDM、8-20％不含外源外泌体的血清和双抗混合形成不含外源外泌体和生长因子的所述预处理培养基；

在利用所述表型转换培养基处理所述心肌成纤维细胞后，收集上清液，而后对所述上清液进行分阶段离心；

分阶段离心的操作步骤包括：以400g-600g的离心速度离心5-10分钟；而后以2000g-

3000g的离心速度离心10-30分钟，再以10000g-15000g的离心速度离心30分钟-60分钟，接着，以不低于100000g的离心速度离心至少70分钟以上。

2.根据权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，不含外源外泌体的血清为不含外源外泌体的胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，制备不含外源外泌体的所述血清的步骤包括：对血清进行离心，形成不含外源外泌体的所述血清。

4.根据权利要求3所述的外泌体的制备方法，其特征在于，离心的条件为：离心时间不低于18小时，离心温度为4-8℃，离心转速不低于100000g。

5.根据权利要求1-4任一项所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述心肌成纤维细胞为处于对数生长期的心肌成纤维细胞。

6.根据权利要求1-4任一项所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述心肌成纤维细胞为第二代至第六代中的任意一代的心肌成纤维细胞。

7.根据权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述心肌成纤维细胞的制备步骤包括：利用扩增培养基对心肌成纤维细胞源进行扩增培养，且抑制其体外分化，所述扩增培养基含有FGF因子和LIF因子；所述扩增培养基包括IMDM、8-20％血清、双抗、FGF因子和LIF因子。

8.根据权利要求1-4任一项所述的外泌体的制备方法，其特征在于，利用所述表型转换培养基培养心肌成纤维细胞的条件为：培养时间为2-3天，培养温度为37±1℃，5±1％二氧化碳。

9.一种外泌体，其特征在于，其通过权利要求1-8任一项所述的外泌体的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的外泌体在制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物为促进血管生成的药物。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制心肌细胞肥厚和/或心肌细胞凋亡的药物。

13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物为促进miR-2137、miR-769、miR-1285、miR370、miR6240、miR193b、miR199a、miR21、miR12136、miR2904、miR31、miR339、let-7i、miR378a、miR146b、miR127、miR574、miR374a、miR100、miR26a和let-7g中至少一种表达的药物。

14.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制miR-1388、miR-6529、miR-380、miR122、miR412、miR142、miR451a、miR331、miR10b、miR1290、miR486、miR10a、miR543、miR423、miR192、miR1246、miR495、miR107、miR128、miR335、miR450b、miR92a、miR130a、miR320b、miR320c、miR323a、miR410和miR361中至少一种表达的药物。

说明书

外泌体、其制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及外泌体的制备技术领域，具体而言，涉及外泌体、其制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 外泌体(exosome)，是细胞主动分泌的大小较为均一，直径为30～150nm，密度为1.10～1.18g/ml的囊泡样小体。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其作为蛋白质、
非编码RNA (miRNA、lncRNA)、mRNA、脂质等功能物质的载体，在细胞间通讯中发挥重要作
用。现有技术中由干细胞分泌的外泌体已被发现可以刺激细胞或组织再生，并可用于广泛
的应用，如皮肤和头发。

[0003] 常规制备外泌体的方式分为两大类：一种是直接培养具有治疗潜力的细胞，收获其上清，进而提取其外泌体用于治疗，例如胚胎干细胞；另外一种是对有治疗作用的细胞在
培养时，给予刺激或处理，促进其释放外泌体，进而提取其外泌体用于治疗，例如低氧处理
促进脂肪间充质干细胞释放大量的外泌体。

[0004] 但是干细胞在获得、培养和量产方面不易，成本很高，利用其制备外泌体用于治疗试剂的价值和利益提高空间不大。

[0005] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供外泌体、其制备方法及其应用。本发明实施例提供一种外泌体，其利用不利于心脏损伤修复的心肌成纤维细胞通过一种简易方法诱导其转分化能够
变废为宝，改变其外泌体成分，使得获得外泌体可用于心血管疾病的无细胞治疗。

[0007] 心肌成纤维细胞是心脏中最丰富的细胞也最易获得分离的，尤其是损伤的心脏中，心肌成纤维细胞更是大量增值，然而成纤维细胞本身极容易导致心脏重构和纤维化，通
过旁分泌效应与心肌细胞相互作用，在心肌肥厚发生发展进而心衰中扮演关键角色。有研
究揭示其外泌体并不利于心脏损伤修复，反而会加重心脏的纤维化，而申请人发现，通过利
用无血清无生长因子无外源外泌体的表型转换培养基培养心肌成纤维细胞，可以使得心肌
成纤维细胞的表型发生转化，同时，形成的外泌体能够修复心脏，对心血管疾病有良好的治
疗效果。其中，无血清并不是绝对无血清，而是培养基中血清的含量大于0％，小于0.1％，属
于超低浓度血清，可以视为无血清。无生长因子是表型转换培养基中未添加FGF因子和LIF
因子，无外源外泌体最好是表型转换培养基中绝对无外源外泌体，但是在实际中不可能实
现绝对无外源外泌体，此处的无外源外泌体也是外源外泌体的含量极低，不会造成本发明
制备的外泌体的污染以及较大的副作用，相当于没有。

[0008] 具体地，本发明是这样实现的：

[0009] 第一方面，本发明实施例提供一种外泌体的制备方法，包括：利用表型转换培养基培养心肌成纤维细胞，使得所述心肌成纤维细胞的表型发生转化，并获得外泌体，其中，所
述表型转换培养基中不含有生长因子和外源外泌体，且所述表型转换培养基中血清的含量
大于0％，且小于0.1％。

[0010] 本发明实施例记载的表型转换培养基中血清的含量是相对IMDM的体积含量。

[0011] 本发明实施例记载的生长因子指的是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)，下文简称：FGF因子和白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)，
下文简称：LIF因子。一般生长因子是额外添加的，因此本发明实施例中不含有生长因子，也
就是不额外添加生长因子。

[0012] 本发明实施例记载的外源外泌体指的是血清中自带有的外泌体。且无外源外泌体最好是表型转换培养基中绝对无外源外泌体，但是在实际中很难或者基本不可能实现绝对
无外源外泌体，因此，本发明实施例记载的无外源外泌体也是外源外泌体的含量极低，不会
造成本发明制备的外泌体的污染以及较大的副作用，相当于没有。

[0013] 在可选的实施方式中，表型转换培养基包括IMDM和双抗。

[0014] 需要说明的是，在本发明实施例中双抗指的是抗链霉素的抗生素和抗青霉素的抗生素，本发明实施例中青霉素和链霉素在含有双抗的培养基中的最终浓度通常均为100-
150U/ml。

[0015] 进一步需要说明的是，本发明实施例虽然仅提供了IMDM一种培养基，但是现有技术中其他的能够培养心肌成纤维细胞的培养基也在本发明的保护范围内。

[0016] 在可选的实施方式中，所述外泌体的制备步骤还包括：在利用所述表型转换培养基培养所述心肌成纤维细胞之前，利用含有8-20％血清的预处理培养基培养所述心肌成纤
维细胞12-18小时，而后将预处理培养基更换为所述表型转换培养基并进行培养。

[0017] 在可选的实施方式中，制备预处理培养基的步骤包括：将IMDM、8-20％不含外源外泌体的血清和双抗混合形成不含外源外泌体和生长因子的所述预处理培养基；

[0018] 优选地，不含外源外泌体的血清为不含外源外泌体的胎牛血清。

[0019] 需要说明的是，本发明实施例记载的8-20％血清指的是不含外源外泌体的血清的添加量为IMDM的体积的8-20％。

[0020] 在可选的实施方式中，制备不含外源外泌体的所述血清的步骤包括：对血清进行离心，形成不含外源外泌体的所述血清；

[0021] 优选地，离心的条件为：离心时间不低于18小时，离心温度为4-8℃，离心转速不低于100000g。采用该离心条件制备得到的血清中外源外泌体极少，可视为不含外源外泌体。

[0022] 该不含外源外泌体的血清也可以是市面直接购买的去除其自身外泌体的血清。

[0023] 在可选的实施方式中，所述外泌体的制备步骤还包括：在利用所述表型转换培养基处理所述心肌成纤维细胞后，收集上清液，而后对所述上清液进行分阶段离心；

[0024] 优选地，分阶段离心的操作步骤包括：以400g-600g的离心速度离心5-10分钟；而后以2000g-3000g的离心速度离心10-30分钟，再以10000g-15000g的离心速度离心30-60分
钟，接着，以不低于100000g的离心速度离心至少70分钟以上。

[0025] 在可选的实施方式中，所述心肌成纤维细胞为第二代至第六代中的任意一代的心肌成纤维细胞；优选地，所述心肌成纤维细胞为处于对数生长期的心肌成纤维细胞。

[0026] 在可选的实施方式中，所述心肌成纤维细胞的制备步骤包括：利用扩增培养基对心肌成纤维细胞源进行扩增培养，且抑制其体外分化，所述扩增培养基含有FGF因子和LIF
因子；

[0027] 所述扩增培养基包括IMDM、8-20％血清、双抗、FGF因子和LIF因子。

[0028] 在本发明实施例中含有生长因子的培养基中FGF因子和LIF因子的添加终浓度均为10-50ng/ml。

[0029] 在可选的实施方式中，利用表型转换培养基培养心肌成纤维细胞的条件为：培养时间为2-3天，培养温度为37±1℃，5±1％二氧化碳。

[0030] 第二方面，本发明实施例提供一种外泌体，其通过前述实施方式任一项所述的外泌体的制备方法制备得到。

[0031] 第三方面，本发明实施例提供前述实施方式所述的外泌体在制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用；

[0032] 优选地，所述药物为促进血管生成的药物；

[0033] 优选地，所述药物为抑制心肌细胞肥厚和/或心肌细胞凋亡的药物；

[0034] 优选地，所述药物为促进miR-2137、miR-769、miR-1285、miR370、miR6240、miR193b、miR199a、miR21、miR12136、miR2904、miR31、miR339、let-7i、miR21、miR378a、
miR146b、miR127、miR574、miR374a、miR100、miR26a和let-7g中至少一种表达的药物；

[0035] 优选地，所述药物为抑制miR-1388、miR-6529、miR-380、miR122、miR412、miR142、miR451a、miR331、miR369、miR10b、miR1290、miR486、miR10a、miR543、miR423、miR192、
miR1246、miR495、miR107、miR128、miR335、miR450b、miR92a、miR130a、miR320b、miR320c、
miR323a、miR410和miR361中至少一种表达的药物。

[0036] 本发明实施例具有以下有益效果：本发明实施例通过利用含有特定含量的血清和生长因子的表型转换培养基对心肌成纤维细胞进行处理，使其表型发生转换，继而使得形
成的外泌体具有修复心脏的功效，并对心血管疾病有良好治疗作用，实现了变废为宝，且心
肌成纤维细胞容易获得，表型转换过程容易操作，能够降低外泌体的生产成本。

附图说明

[0037] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。

[0038] 图1为本发明实验例1的提供的检测结果；

[0039] 图2为本发明实验例2的提供的检测结果；

[0040] 图3为本发明实验例3的提供的检测结果；

[0041] 图4为本发明实验例4的提供的检测结果；

[0042] 图5为本发明实验例5的提供的miRNA差异表达的热图；

[0043] 图6为本发明实验例5的提供的miRNA下调的定量分析图；

[0044] 图7为本发明实验例5的提供的miRNA上调的定量分析图。

具体实施方式

[0045] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。

[0046] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0047] 本发明实施例提供一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：

[0048] 首先，利用扩增培养基对心肌成纤维细胞源进行扩增培养，且抑制其体外分化，所述扩增培养基含有FGF因子和LIF因子；

[0049] 所述扩增培养基包括IMDM、8-20％血清、双抗、FGF因子和LIF因子。双抗的浓度为100-150U/ml，FGF因子和LIF因子的添加终浓度均为10-50ng/ml。上述因子可以增加心肌成
纤维细胞的增殖，又可抑制其分化，保证后续形成外泌体的为心肌成纤维细胞而非心肌成
纤维细胞分化后的其他细胞，保证形成的外泌体的质量和性质。

[0050] 本发明实施例采用的IMDM为市面可直接购买的IMDM培养基。

[0051] 具体地，心肌成纤维细胞源可以直接从心脏组织中获得的原代心肌成纤维细胞，该获得方法可以采用现有技术中的方法，例如，无菌条件下，将心脏肌肉组织剪切至0.5～
1mm3左右的组织块。将组织块转移至50ml离心管，每0.1-0.3g(例如为0.1g、0.2g、0.15g、
0.25g以及0.3g)心脏组织添加5-10ml(例如5ml、10ml、8ml、6ml、7ml、9ml以及6.5ml等)37℃
预热的消化液，其中该所述消化液包含HBSS或者DPBS溶液，0.1-0.2％的胰酶和45-55U/ml
(例如45U/ml、46U/ml、47U/ml、48U/ml、49U/ml、50U/ml、52U/ml以及55U/ml等均可)的胶原
蛋白酶2，吹打8-12(例如8次、9次、10次、11次或者12次均可)次左右，于37℃摇床每分钟
100-150转速消化细胞，8-10min后将上清转移到新的离心管，以40um孔径的滤膜过滤，并用
初代培养基终止消化。其中，该初代培养基包括IMDM、双抗(终浓度不低于100U/ml)和10％
血清(含外源外泌体)。初代培养基也可以直接采用扩增培养基。

[0052] 将收集的消化多次后直至组织基本被消化掉(通常需消化3-6次)的上清液，以300-350g(可采用300g、310g、320g、330g、340g、350g、305g、325g以及335g等转速)的离心力
离心5-10min(可为5min、6min、7min、8min、9min以及10min中的任意一个时间数值)。去除上
清，以扩增培养基重悬细胞沉淀，并转移到细胞培养瓶中，于37℃含5％CO2的细胞培养箱中
培养2-8h(例如2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、2.5小时以及6.5小时等数
值中的任意一个时间值)后，更换扩增培养基。

[0053] 而后利用上述扩增培养基对原代心肌成纤维细胞进行扩增培养，扩增培养也为常规的细胞培养方式，本发明实施例便不再进行详述，一般常规的扩增培养条件下，人类原代
心肌成纤维细胞(Human cardiac Fibroblast)在体外条件可以传代至少6代以上，依旧保
持良好的状态和成纤维细胞特性。因此，本发明实施例采用的心肌成纤维细胞为第二代至
第六代中的任意一代的心肌成纤维细胞。

[0054] 在扩大培养时，原代心肌成纤维细胞前2代生长速度较快适用于冻存，制备种子细胞，便于后期复苏细胞进行扩增，得到第3-6代细胞，进行后续操作。且传代比例一般为1:2-
1：8，具体传代比例可以是1:2，1：4，1:6，1:8，1；3，1:5以及1；7等比例均可。

[0055] 或者心肌成纤维细胞源可以是复苏后的冻存种子细胞，而后再进行扩增，得到第3、第4、第5或者第6代细胞。复苏以及扩增方法与现有技术方法相同，本发明实施例不再进
行详述。

[0056] 而后制备不含外源外泌体的血清，具体操作如下：对血清进行离心，以去除血清中的外泌体，形成不含外源外泌体的所述血清；具体地，离心的条件为：离心时间不低于18小
时，离心温度为4-8℃，离心转速不低于100000g，例如，可以离心时间可以为18小时，20小
时，22小时，30小时等不低于18小时的时间数值，离心温度可以是4℃、5℃、6℃、7℃以及8℃
等4-8℃之间的任意温度值，离心转速可以是100000g、150000g、500000g、200000g、305000g
以及420000g等现有技术可以实现的不低于100000g的任意离心转速。不含外源外泌体最好
是完全去除外泌体的血清，但是实际操作中极难或者基本不能实现完全去除血清中的外泌
体，采用上述离心时间和离心转速，基本可以去除血清中的外泌体，即使有极少量的外泌体
存在，也不会影响本发明所需外泌体的形成，且不会影响本发明制备得到的外泌体的性能，
可视为无外源外泌体。而控制离心温度能够防止血清变质，保证后续形成的外泌体的品质。

[0057] 本发明实施例中采用的血清为胎牛血清，采用现有技术中其他血清也可，采用胎牛血清更容易获得，降低外泌体制备的成本。

[0058] 而后制备预处理培养基，具体操作如下：将IMDM、8-20％不含外源外泌体的血清和双抗混合形成不含外源外泌体和生长因子的所述预处理培养基。

[0059] 接着将上述扩增培养至第2代至第6代中的任意一代的心肌成纤维细胞(例如可选择第2代、第3代、第4代、第5代以及第6代中任意一代的心肌成纤维细胞)中的扩增培养基，
替换为上述预处理培养基，并培养12-18小时(例如，可为12小时、13小时、14小时、15小时、
16小时、17小时、18小时、13.5小时、15.5小时以及16.5小时等时间中的任意时间点值)，采
用此不含外源外泌体以及生长因子的预处理进行培养，去除血清中自带的外泌体以及生长
因子对本发明制备的外泌体的影响，减少二者对表型转换的影响，保证本发明实施例制备
得到的外泌体为心肌成纤维细胞表型转换后形成的外泌体，提升外泌体的质量。

[0060] 且第2代至第6代中的任意一代的心肌成纤维细胞为处于生长对数期的心肌成纤维细胞，继而能够进一步保证细胞活性，促进表型转换的进行，有利于外泌体的形成。

[0061] 而后将预处理培养基更换为表型转换培养基并继续培养心肌成纤维细胞，发明人特定地发现，采用所述表型转换培养基培养心肌成纤维细胞能够使得心肌成纤维细胞的表
型向内皮细胞方向的表型转化，而后获得内皮细胞表型特征，同时，外泌体也发生变换，原
来的心肌成纤维细胞的外泌体不利于心脏修复，可能加重心脏的纤维化，而心肌成纤维细
胞表型转换后的内皮细胞表型特征的外泌体具有保护心肌细胞、促进血管新生从而修复心
脏损伤的作用。

[0062] 具体地，表型转换培养基包括IMDM、双抗、血清的含量大于0％，小于0.1％，表型转换培养基不添加生长因子，也不含有外源外泌体。若表型转换培养基为上述成分的培养基，
在利用表型转换培养基更换预处理培养基时，则需要利用DPBS清洗细胞，保证不会有残留
的预处理培养基残留，保证血清含量不会超过界限，不会影响心肌成纤维细胞的表型转换。

[0063] 若采用的培养基仅仅是IMDM和双抗形成的培养基，那么在利用该培养基替换预处理培养基时，则仅吸掉预处理培养基，不需要利用DPBS清洗细胞，而后直接补充由IMDM和双
抗混合形成的培养基，使得细胞生长的环境内仍然有微量的血清(小于0.1％)的存在(此时
培养细胞的依然为表型转换培养基，该表型转换培养基中含有IMDM、双抗、血清的含量大于
0％，小于0.1％，不添加生长因子，也不含有外源外泌体)。表型处理培养基中也不能绝对无
血清，若细胞生长环境绝对无血清则细胞会凋亡。

[0064] 且利用表型转换培养基培养心肌成纤维细胞的条件为：培养时间为2-3天，培养温度为37±1℃，5±1％二氧化碳。采用上述方法能够充分保证心肌成纤维细胞的表型进行转
换，保证外泌体的形成。

[0065] 培养后，收集上清液，并对上清液进行分阶段离心，分阶段离心可以去除不同的杂质，继而保证形成的外泌体的纯度，降低其副作用，具体地，以400g-600g(例如可采用400g、
500g、600g、450g、550g、420g、560g以及580g等数值中的任意数值)的离心速度离心5-10分
钟(例如5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟以及10分钟中数值中的任意点值)去除死亡细
胞；而后以2000g-3000g(例如可采用2000g、2500g、2200g、2800g、3000g、2150g、2750g以及
2550g等数值中的任意数值)的离心速度离心10-30分钟(例如可采用10分钟、15分钟、20分
钟、30分钟、25分钟、28分钟、13分钟、24分钟以及18分钟等数值中的任意数值)，再以
10000g-15000g(例如可采用10000g、11000g、12000g、13000g、14000g、15000g、以及13500g
等数值中的任意数值)的离心速度离心30分钟-60分钟(例如30分钟、40分钟、50分钟、60分
钟、35分钟、42分钟、45分钟、58分钟、以及55分钟等数值中的任意时间值)，接着，以不低于
100000g(例如可采用100000g、500000g、300000g、150000g、850000g以及450000g等不低于
100000g的任意数值)的离心速度离心至少70分钟(例如可采用70分钟、90分钟、120分钟以
及180分钟等至少70分钟的任意时间点值)以上。且整个分阶段离心过程的温度为4-8℃，保
证外泌体不会因为温度过高或过低发生变化。

[0066] 且离心后离心管底部的沉淀物即为本发明实施例所需的外泌体。当需要使用外泌体时再将其进行重悬，或者可以将该外泌体制备为对应的细胞药物。

[0067] 本发明实施例还提供一种外泌体，其通过上述方法制备得到。

[0068] 本发明实施例还提供一种上述外泌体新的应用，具体为在制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用；优选地，所述药物为促进血管生成的药物；优选地，所述药物为抑制心
肌细胞肥厚和/或心肌细胞凋亡的药物，药物为促进促进miR-2137、miR-769、miR-1285、
miR370、miR6240、miR193b、miR199a、miR21、miR12136、miR2904、miR31、miR339、let-7i、
miR21、miR378a、miR146b、miR127、miR574、miR374a、miR100、miR26a和let-7g中至少一种表
达的药物；所述药物为抑制miR-1388、miR-6529、miR-380、miR122、miR412、miR142、
miR451a、miR331、miR369、miR10b、miR1290、miR486、miR10a、miR543、miR423、miR192、
miR1246、miR495、miR107、miR128、miR335、miR450b、miR92a、miR130a、miR320b、miR320c、
miR323a、miR410和miR361中至少一种表达的药物。

[0069] 实施例1

[0070] 本实施例提供一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：

[0071] 步骤一：细胞的原代分离

[0072] 无菌条件下，将约0.15g心脏肌肉组织剪切至1mm3左右的组织块。将组织块转移至50ml离心管，添加5ml37℃预热的消化液，其中该所述消化液包含0.1％的胰酶和50U/ml的
胶原蛋白酶2的HBSS溶液，吹打10次左右，于37℃摇床每分钟150转速消化细胞，10min后将
上清转移到新的离心管，以40um孔径的无菌滤膜过滤，并扩增培养基终止消化，消化三次后
心脏组织基本被消化掉，将收集的上清液，以300g的离心力离心5min。去除上清，再以扩增
培养基重悬细胞沉淀，并转移到细胞培养瓶中，于37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养2h后，
更换扩增培养基。其中，扩增培养基包括IMDM、10％含外泌体血清，100U/ml双抗、10ng/ml 
FGF因子和10ng/ml LIF因子。

[0073] 步骤二：细胞的扩增培养

[0074] 而后每2天更换一次扩增培养基当细胞汇合度达到90％左右时，丢去上清，用DPBS清洗细胞两次，弃清洗液，加入温的0.05％胰酶+0.02％EDTA溶液，消化2-3min时，于显微镜
下观察细胞变圆即将脱离贴壁，终止消化，将原代细胞以1：4的比例传代，即可获得大量的
P2(第二代)心肌成纤维细胞。而后继续采用相同方式进行处理并进行培养，得到P6(第六
代)。

[0075] 步骤三：无外源外泌体无生长因子预处理培养基的制备

[0076] 于4℃利用贝克曼超高速离心机以100，000g的条件下对胎牛血清离心处理18小时形成无外源外泌体血清，而后将IMDM、10％上述不含外源外泌体的血清和100U/ml双抗混合
形成不含外源外泌体和生长因子的预处理培养基。

[0077] 步骤四：表型转换并收集外泌体

[0078] 将上述P6的扩增培养基替换为该预处理培养基，并在37℃含5％CO2的条件下培养15小时，而后再更换为表型转换培养基，将预处理培养基吸掉，不进行DPBS清洗，直接补充
由IMDM与100U/ml双抗形成的培养基，此时，培养细胞的表型转换培养基中，不含外源外泌
体和生长因子，血清含量低于0.1％，但高于0％，100U/ml双抗和IMDM；而后在37℃含5％CO2
的条件下培养2天，收集上清，4℃400g离心10min，4℃2000g离心10min，4℃10000g离心
30min，4℃100,000g离心70min，取超速离心管底部沉淀。

[0079] 实施例2

[0080] 采用实施例1提供的方法进行细胞的原代分离和扩增培养，最终采用的心肌成纤维细胞为第2代处于生长对数期的心肌成纤维细胞。

[0081] 制备不含外源外泌体的血清时，离心时间为18小时，离心温度为4℃，离心转速为100000g。

[0082] 预处理培养基培养时间为12小时。

[0083] 更换预处理培养基，替换为仅由IMDM与100U/ml双抗形成的培养基后，替换后形成的培养细胞的表型转换培养基中血清含量0.01％；而后分阶段离心的过程如下：400g的离
心速度离心5分钟；而后以2000g的离心速度离心10分钟，再以10000g的离心速度离心30分
钟，接着，以100000g的离心速度离心,70分钟。

[0084] 实施例3

[0085] 采用实施例1提供的方法进行细胞的原代分离和扩增培养，最终采用的心肌成纤维细胞为第6代处于生长对数期的心肌成纤维细胞。

[0086] 制备不含外源外泌体的血清时，离心时间为30小时，离心温度为8℃，离心转速为120000g。

[0087] 预处理培养基培养时间为18小时。

[0088] 更换预处理培养基，替换为仅由IMDM与100U/ml双抗形成的培养基后，替换后形成的培养细胞的表型转换培养基中血清含量0.1％；而后分阶段离心的过程如下：600的离心
速度离心10分钟；而后以3000g的离心速度离心30分钟，再以15000g的离心速度离心60分
钟，接着，以120000g的离心速度离心90分钟。

[0089] 实施例4

[0090] 采用实施例1提供的方法进行细胞的原代分离和扩增培养，最终采用的心肌成纤维细胞为第5代处于生长对数期的心肌成纤维细胞。

[0091] 制备不含外源外泌体的血清时，离心时间为25小时，离心温度为6℃，离心转速为110000g。

[0092] 预处理培养基培养时间为16小时。

[0093] 更换预处理培养基，替换为仅由IMDM与100U/ml双抗形成的培养基后，替换后形成的培养细胞的表型转换培养基中血清含量0.05％；而后分阶段离心的过程如下：500g的离
心速度离心7分钟；而后以2500g的离心速度离心15分钟，再以11000g的离心速度离心40分
钟，接着，以110000g的离心速度离心80分钟。

[0094] 实验例1

[0095] 利用Real time PCR检测实施例1中表型转换后的心肌成纤维细胞，检测结果参见图1。其中，(a)表型转换后的心肌成纤维细胞中内皮细胞关键标志基因的表达水平增加(通
过多个内皮细胞关键标志基因表达水平的提高，可用来鉴定细胞表型转换是否成功发生，
可做为未来外泌体是否可以进一步收集制备的快速判断手段或标准)；(b)表型转换后的心
肌成纤维细胞标志基因以及肌成纤维细胞标志基因的表达，该结果说明所述表型转化培养
基不能诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞等方向转分化(****p<0.0001,**p<0.01，对
10％血清,n＝3,图表为平均数±标准误差)；(c)表型转换前后相关内皮细胞标志基因和心
肌成纤维标志基因表达比较图；(d)表型转换后，与内皮相关GO功能富集分析。(FBS：胎牛血
清)。根据图1可知，心肌成纤维细胞的表型发生了转换，形成了内皮细胞表型特征。

[0096] 实验例2

[0097] 利用Real time PCR检测实施例1中表型转换后的心肌成纤维细胞经过冻存和多次传代扩增培养后，表型转化能力的变化，检测结果参见图2。其中，a)扩增培养早期第2代
心肌成纤维细胞，表型转换后的心肌成纤维细胞中内皮细胞关键标志基因的表达水平增
加；(b)经过冻融储存并继续扩增培养至第6代的心肌成纤维细胞，表型转换后的心肌成纤
维细胞中内皮细胞关键标志基因的表达水平也能有效增加；(*P<0.05,**P<0.01,***P<
0.001,****P<0.0001vs 10％FBS,Unpaired t-test，每个组的0.05％FBS(黑色)与各自的
10％FBS(白色)进行比较，n＝3,图表为平均数±标准误差)；图2结果说明经过冻融储存并
多次传代扩增培养至少第6代的心肌成纤维细胞，其依然保持很高的通过本技术发生表型
转换的能力。

[0098] 实验例3

[0099] 以实施例1制备得到的外泌体为实验组(编号为Exosome fom  Cardiac Fibroblasts undergoing MEndoT)，以表型未转化的心肌成纤维细胞的外泌体为对照组
(编号为Exosome fom Cardiac Fibroblasts)进行检测，检测结果参见图3，其中图3中(a)
为外泌体共有特征蛋白的Western Blot检测；(b)电镜检测外泌体形态特征；(c)Nanosight
检测外泌体粒径大小组成。根据图3可知，实施例1形成的外泌体与表型未转化的心肌成纤
维细胞的外泌体都具有外泌体典型特征，但在粒径大小组成上存在细微不同。

[0100] 实验例4

[0101] 利用TAC诱导心脏压力超负荷心肌肥厚，以实施例1制备的外泌体为实验组(编号为TAC+MEndoT-derived cells exosome)，以未转化的心肌成纤维细胞的外泌体为对照组
(编号为TAC+Fibroblast exosome)，实验组和对照组外泌体的用量为200ug/只鼠，即8mg/
kg/只。而后进行检测，检测结果参见图4，其中，图4中(a)为M型超声心动图；(b-e)心脏功能
的超声心动图(ECHO)评估分析；(f)TAC 14天后，马松三色染色心脏组织纤维化面积的定量
(n＝4只动物/组)。图表显示平均值±S.E.M.；*p<0.05，采用单因素方差分析和事后检验。
根据图4可知以实施例1制备的外泌体可用于治疗心肌肥厚，可以减少纤维化发生，并抑制
心肌肥厚发生和保护心功能。

[0102] 实验例5

[0103] 以实施例1制备得到的外泌体为实验组(编号为Exosome fom  Cardiac Fibroblasts undergoing MEndoT)，以表型未转化的心肌成纤维细胞的外泌体为对照组
(编号为Exosome fom Cardiac Fibroblasts)进行miRNA测序分析，检测结果参见图5-图7。
其中，图5中(a)为差异表达显著下调miRNA热图(p<0.05)；(b)为差异表达显著上调miRNA热
图(p<0.05)；(c)为差异表达miRNA Top GO功能富集分析(n＝3)。图6为miRNA显著下调的定
量分析，图7为miRNA显著上调的定量分析。

[0104] 综上所述，本发明实施例通过利用表型转换培养基对心肌成纤维细胞进行表型转换，同时使得表型转换后的细胞形成的外泌体具有修复心脏并促进血管新生的作用。

[0105] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。