一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法转让专利
申请号 : CN202010473998.2
文献号 : CN111676265B
文献日 : 2021-06-15
发明人 : 王明义 , 刘鹏 , 丛海燕
申请人 : 威海市立医院
摘要 :
权利要求 :
1.一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,所述中性粒细胞的吞噬能力为中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力,所述第一感染信号为被微需氧的细菌感染,所述第二种病原菌为活的异养需氧菌;
其检测方法具体步骤包括:
步骤(1)采用体外共培养方法,将中性粒细胞经第一感染信号刺激:在微需氧条件下,采用体外共培养技术将所述微需氧的细菌和中性粒细胞进行共培养,中性粒细胞和微需氧的细菌共同培养相互发生作用后,中性粒细胞经第一感染信号刺激,即得到中性粒细胞被第一感染信号微需氧的细菌感染刺激后的体外共培养体系;
步骤(2)二次加菌体外共培养,中性粒细胞经步骤(1)中的被第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬作用:在正常有氧条件培养,将第二种病原菌活菌和步骤(1)的体外共培养体系,进行共培养1h后,步骤(1)体外共培养体系中的微需氧的细菌暴露在此有氧条件下
1h便会失去活性,因此继续在有氧条件培养1h,不会干扰被微需氧的细菌感染刺激后的中性粒细胞对第二种病原菌的吞噬及培养分析;
步骤(3)评价中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力方法,即检测被第一感染信号微需氧的细菌感染后的中性粒细胞吞噬第二种病原菌的能力的方法:采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,所述第一感染信号为被幽门螺杆菌感染,所述第二种病原菌为活的大肠埃希菌、或葡萄球菌、或链球菌。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,具体步骤包括:
步骤(1)采用体外共培养方法,将中性粒细胞经第一感染信号刺激:在微需氧条件下,采用体外共培养技术将幽门螺杆菌和中性粒细胞进行共培养,中性粒细胞和幽门螺杆菌共同培养相互发生作用后,中性粒细胞经第一感染信号刺激,即得到中性粒细胞被第一感染信号幽门螺杆菌感染刺激后的体外共培养体系;
步骤(2)二次加菌体外共培养,中性粒细胞经步骤(1)中的被第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬作用:在正常有氧条件培养,将第二种病原菌活菌和步骤(1)的体外共培养体系,进行共培养1h后,步骤(1)体外共培养体系中的幽门螺杆菌暴露在此有氧条件下1h便会失去活性,因此继续在有氧条件培养1h,不会干扰被幽门螺杆菌感染刺激后的中性粒细胞对第二种病原菌的吞噬及培养分析;
步骤(3)评价中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力方法,即检测被第一感染信号幽门螺杆菌感染后的中性粒细胞吞噬第二种病原菌的能力的方法:采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目。
4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述采用体外共培养方法具体步骤为:将幽门螺杆菌接种于有活的中性粒细胞的孔板内;幽门螺杆菌浓度为1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL,中性粒细胞浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL。
5.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,所述第二种病原菌为大肠埃希菌;所述中性粒细胞和幽门螺杆菌的浓度以1:10、中性粒细胞和大肠埃希菌的浓度以1:10共培养。
6.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述二次加菌体外共培养具体步骤为:将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(1)中有幽门螺杆菌的孔板内,大肠埃希菌浓度均为:1.0×10E6—2.0×
10E7CFU/mL。
7.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,在步骤(3)中,所述采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目,具体步骤为:
在步骤(2)二次加菌体外共培养的已加入第二种病原菌大肠埃希菌的共培养组细胞中,加入一定浓度的抗生素作用,杀灭培养基中的细胞外细菌后,收集细胞用无菌PBS洗涤一次,再加入无菌水,震荡混匀裂解中性粒细胞,取裂解液涂布接种血平板,培养过夜、计数菌落数。
8.根据权利要求7所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,所述抗生素为抗生素青链双抗(青霉素链霉素)。
9.根据权利要求7所述的一种非诊断目的的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其特征在于,在步骤(3)中,所述计数菌落数方法为:釆用Microsoft Excel、GraphPad Prism
5.0软件进行统计学分析,吞噬系数 = 菌落数目x 5 ÷ 细胞计数,组间两两比较符合正态分布,釆用LSD‑t检验。
说明书 :
一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法
技术领域
背景技术
性粒细胞在机体抵御病原微生物的入侵中起着重要作用。中性粒细胞“身兼”有趋化、吞噬、
杀菌等多种功能,在机体被病原体感染后,多种趋化因子作用于中性粒细胞,滚动、粘附并
越过内皮屏障,顺着趋化剂的梯度逐渐向感染部位迁移,进入感染灶,通过其一系列的杀菌
功能杀伤致病体以维持机体健康,例如通过“呼吸爆发”、脱颗粒、NETs等途径对病原体进行
诱杀,因此其免疫调节作用十分重要。其中吞噬作用是中性粒细胞发挥免疫功能的重要功
能之一,中性粒细胞通过吞噬细菌及异物并触发呼吸爆发或氧爆发,产生活性氧簇和多种
溶酶体酶有效杀伤吞噬的微生物。
胞的吞噬率、吞噬指数是目前常用的评价中性粒细胞吞噬功能的两个指标。常用方法为
Wirhgt‑Gemsa复合染色法染色,先低倍镜观察血涂片,再与油镜下观察100个中性粒细胞吞
噬病原菌的情况。根据公式计算吞噬率、吞噬指数。吞噬率=100个中性粒细胞中吞噬细菌
的细胞数/100*100%。吞噬指数=100个中性粒细胞中吞噬细菌的总数/100。但此方法需要
染色,还需在显微镜下辨认细胞结构、吞噬细菌与否、计数细胞与细菌,实验结果的准确性
与操作人员的辨识水平相关性较大,实验结果不稳定。现有技术中,吞噬实验一般是应用单
一的常见条件致病病原菌(比如大肠埃希菌)或荧光微球(颗粒)作为被吞噬物。但是,临床
常见多种菌(二种、三种)并发感染情况,所以现有的吞噬实验检测数据结果与实际临床数
据结果相比差异比较大,且并发感染时检测吞噬能力,需要针对多种菌使用多种抗生素,造
成检测的中性粒细胞的吞噬能力不准确。而后出现的荧光显微镜下观察中性粒细胞吞噬法
和流式细胞仪检测中性粒细胞吞噬功能法,需要荧光染料和特殊仪器,成本较高,不适合普
及。中性粒细胞的吞噬率、吞噬指数是目前常用的评价中性粒细胞吞噬功能的两个指标。但
此方法需要特殊染色,还需在显微镜下辨认细胞结构、吞噬细菌与否、计数细胞与细菌,实
验结果的准确性与操作人员的辨识水平相关性较大,实验结果不稳定。
发明内容
吞噬实验提供新的实验方法与思路的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法。
需氧的细菌感染,第二种病原菌为活的异养需氧菌。
菌共同培养相互发生作用后,中性粒细胞经第一感染信号刺激,即得到中性粒细胞被第一
感染信号幽门螺杆菌感染刺激后的体外共培养体系;
共培养体系,进行共培养1h后,步骤(1)体外共培养体系中的幽门螺杆菌暴露在此有氧条件
下1h便会失去活性,因此继续在有氧条件培养1h,不会干扰被幽门螺杆菌感染刺激后的中
性粒细胞对第二种病原菌的吞噬及培养分析;
法:采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目。
浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL。
×10E7CFU/mL。
涤一次,再加入无菌水,震荡混匀裂解中性粒细胞,取裂解液涂布接种血平板,培养过夜、计
数菌落数。
正态分布,釆用LSD‑t检验。
希菌活菌),幽门螺杆菌为微需氧菌,暴露在空气中1h左右失去活性,因此有氧条件下不会
干扰细胞对第二种病原菌的吞噬及培养分析,不需要额外添加抗生素杀灭幽门螺杆菌,避
免了此时添加的抗生素对第二种病原菌大肠埃希菌存活的影响,可以准确评价中性粒细胞
在第一感染信号(幽门螺杆菌感染)刺激后对第二种病原菌(活的大肠埃希菌)的吞噬能力,
可以准确评价中性粒细胞在吞噬能力,具有检测成本低,操作简便、简单易行,实验结果更
接近临床数据、且重复性好,为吞噬实验提供新的实验方法与思路,具有显著的进步。
性粒细胞的吞噬能力的检测方法,采用两种病原物,意在模拟多种菌感染情况,且无需用抗
生素对第一感染信号菌体进行杀灭,因此,本发明的检测方法检测出来的中性粒细胞的吞
噬性能,更接近实际临床情况,检测数据结果更准确,且重复性好。
出中性粒细胞对第二种菌的吞噬情况,具有检测成本低,操作简便、简单易行,且实验结果
更接近临床数据。
附图说明
具体实施方式
规的市售产品。
菌感染,第二种病原菌为活的异养兼性厌氧菌。第一感染信号为被幽门螺杆菌感染,第二种
病原菌为活的大肠埃希菌。
(H.pylori)与血清共孵育30min,采用体外共培养技术将幽门螺杆菌和中性粒细胞进行共
培养,继续培养1h;中性粒细胞和幽门螺杆菌共同培养相互发生作用后,中性粒细胞经第一
感染信号刺激,即得到中性粒细胞被第一感染信号幽门螺杆菌感染刺激后的体外共培养体
系;
养体系中,具体接种步骤为;
在此有氧条件下1h便会失去活性,因此继续在有氧条件培养1h,不会干扰被幽门螺杆菌感
染刺激后的中性粒细胞对第二种病原菌大肠埃希菌的吞噬及培养分析;
的能力的方法:采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目。
素链霉素)作用30min,杀灭培养基中的细胞外细菌(大肠埃希菌),收集细胞用1ml无菌PBS
洗涤一次,再加入无菌水0.5mL,震荡混匀裂解中性粒细胞10min,取0.1mL裂解液涂布接种
血平板,培养过夜、计数菌落数。
可以为吞噬实验提供新的实验方法与思路。
门螺杆菌接种于有活的中性粒细胞的孔板内;幽门螺杆菌浓度为1.0×10E6—2.0×
10E7CFU/mL,中性粒细胞浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL;在步骤(2)中,二次加菌体外
共培养具体步骤为:将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(1)中有幽门螺杆菌的孔
板内,大肠埃希菌浓度均为:1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL,实验组为:中性粒细胞和幽门
螺杆菌的浓度以1:10、中性粒细胞和大肠埃希菌的浓度以1:10共培养组;对照组为:中性粒
细胞与大肠埃希菌以1:10共培养组;均可以实现本发明的中性粒细胞的吞噬能力的检测方
法。
板购自郑州安图生物工程股份有限公司;
胞进行实验。
螺杆菌为4.0×10E6CFU/mL,中性粒细胞为4.0×10E5个/mL,500μL/孔;
0.1mL裂解液涂布接种血平板,培养过夜、计数菌落数;
为差异有统计学意义。
希菌的数目为10个,在实验组与对照组中,中性粒细胞吞噬大肠埃希菌的数量差异无统计
学意义。与现有技术中的评价中性粒细胞的吞噬能力的常用指标为吞噬率和吞噬指数,其
常用检测方法为Wirhgt‑Gemsa复合染色法染色,需要操作人员的辨识水平常导致实验结果
不稳定相比,本发明的方法的实验结果的准确性显著提高,而且本发明中的检测方法不需
要特殊染色,不添加对第一感染信号菌体进行杀灭的抗生素,不需要显微镜下辨认细胞与
细菌,只需裂解细胞涂布接种、计数细菌菌落数,省时省力,误差小,准确性高,对于医学检
测技术领域具有巨大影响。
进入感染灶,通过其一系列的杀菌功能杀伤致病体以维持机体健康。其中吞噬作用是中性
粒细胞发挥免疫功能的重要功能之一,中性粒细胞通过吞噬细菌及异物并触发呼吸爆发或
氧爆发,产生活性氧簇和多种溶酶体酶有效杀伤吞噬的微生物。
菌。第一感染信号为被幽门螺杆菌感染,第二种病原菌为活的大肠埃希菌。
氧或缺氧的情况下,都可以进行相应的生活活动;幽门螺杆菌为微需氧菌,暴露在空气中1
小时便会失去活性,因此二次加菌培养时,在有氧条件下不会干扰中性粒细胞对第二种病
原菌(大肠埃希菌)的吞噬及培养分析,因此使用幽门螺杆菌模拟第一感染信号相比于其他
致病菌,不需要添加对第一感染信号菌体进行杀灭的抗生素,不会影响第二种病原菌(活的
大肠埃希菌)的存活,可以准确评价中性粒细胞在第一感染信号(幽门螺杆菌感染)刺激后
对第二种病原菌(活的大肠埃希菌)的吞噬能力。现有技术中评价中性粒细胞的吞噬能力的
常用指标为吞噬率和吞噬指数,其常用检测方法为Wirhgt‑Gemsa复合染色法染色,先低倍
镜观察血涂片,再与油镜下观察100个中性粒细胞吞噬病原菌的情况,再根据公式计算吞噬
率、吞噬指数(吞噬率=100个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/100*100%。吞噬指数=100
个中性粒细胞中吞噬细菌的总数/100)。但此方法需要染色,染色质量的高低与操作人员的
专业技术水平相关性大,还需在显微镜下辨认细胞结构、吞噬细菌与否、计数细胞与细菌,
因此实验结果的准确性与操作人员的辨识水平相关性较大,常导致实验结果不稳定。但本
发明中的检测方法不需要特殊染色,不需要显微镜下辨认细胞与细菌,只需裂解细胞涂布
接种、计数细菌菌落数,误差小,准确性高。
本发明的检测方法中采用两种病原物,意在模拟多种菌感染情况。因此,与现有技术中的吞
噬实验结果相比,本发明的检测方案更接近实际临床情况,检测中性粒细胞的吞噬结果更
接近与实际临床情况,检测数据结果更准确、误差小。
细胞对第二种菌的吞噬情况,整体操作简便、省时省力,结果统计更直观,通用性强。
据结果更准确、误差小,可普及型强,为吞噬实验提供新的实验方法与思路。
体外共培养方法具体步骤为:将幽门螺杆菌接种于有活的中性粒细胞的孔板内;幽门螺杆
菌浓度为1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL,中性粒细胞浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL;
在步骤(2)中,二次加菌体外共培养具体步骤为:将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步
骤(1)中有幽门螺杆菌的孔板内,大肠埃希菌浓度均为:1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL,实
验组为:中性粒细胞和幽门螺杆菌的浓度以1:10、中性粒细胞和大肠埃希菌的浓度以1:10
共培养组;对照组为:中性粒细胞与大肠埃希菌以1:10共培养组;均可以实现本发明的中性
粒细胞的吞噬能力的检测方法。
明权利要求书涵盖之范畴。