与高原肺水肿发生相关的线粒体DNA单核苷酸多态性的应用

摘要

本发明公开了与高原肺水肿发生相关的线粒体DNA单核苷酸多态性的应用。本发明所保护的一个技术方案是检测人基因组线粒体DNA中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质在制备检测与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。可将检测rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质与其它物质(如检测其它的与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性或基因型(即等位基因)的物质)联合在一起制备筛查高原肺水肿患者的产品。

权利要求

1.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查高原肺水肿易感个体或非易感个体产品中的应用。

2.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测高原肺水肿易感性产品中的应用。

3.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测高原肺水肿患病风险产品中的应用。

4.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型的物质在制备评价或辅助评价高原肺水肿患病风险产品中的应用。

5.根据权利要求1‑4中任一所述的应用，其特征在于：所述rs2853817的多态性或基因型是T或C，所述T是rs2853817位点为T的多态性或基因型，所述C是rs2853817位点为C的多态性或基因型；所述rs2853817的多态性或基因型为C的个体的高原肺水肿患病风险高于或候选高于所述rs2853817的多态性或基因型为T的个体。

6.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查高原肺水肿易感基因型或高原肺水肿非易感基因型产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述高原肺水肿易感基因型为T，所述高原肺水肿非易感基因型为C；所述T是rs2853817位点为T的基因型，所述C是rs2853817位点为C的基因型。

8.根据权利要求1‑7中任一所述的应用，其特征在于：所述检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型的物质含有扩增包括rs2853817在内的人基因组DNA片段的PCR引物和/或单碱基延伸引物。

说明书

与高原肺水肿发生相关的线粒体DNA单核苷酸多态性的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及高原肺水肿发生的人群预防中的个体易感性检测领域中与高原肺水肿发生相关的线粒体DNA单核苷酸多态性的应用。

背景技术

[0002] 高原肺水肿(High altitude pulmonary edema，HAPE)是高原地区最常见的急性重型高原病，如不及时治疗将危及患者生命，也是困扰各国高原作战部队的一大难题。近年来，国内外对HAPE的发病机制进行了一系列的研究，遗憾的是，其发病机制仍不清楚，目前被较普遍接受的可能机制是：一方面，由于先天遗传或后天获得性因素导致敏感个体肺血管及肺泡呼吸上皮出现某些重要功能缺陷，在急性低氧暴露时可能导致过度的低氧性肺动脉高压，这是HAPE发生的最关键环节。另一方面，由于遗传缺陷和低氧对肺泡上皮钠转运的损伤作用，削弱了机体对肺泡液的清除能力，可能是促使HAPE发生的不可忽视的重要方面。

[0003] 众所周知，对于HAPE患者最有效的治疗方法是吸氧和转送平原地区,说明HAPE是一种对氧/能量代谢改变非常敏感的疾病,高原低氧所致的能量代谢改变可能是HAPE发病的始动因素和关键环节。高原环境影响机体的主要因素是缺氧，机体对高原环境的习服也主要是围绕氧的摄取‑运输‑利用这条轴线来进行的。线粒体是机体能量代谢的中心，是组织、细胞利用氧的关键场所，机体耗能的90％以上来自于线粒体的氧化磷酸化作用。因此，线粒体作为细胞的“动力工厂”，在低氧细胞损伤和组织、细胞对低氧环境的习服过程中有非常重要的作用。目前，关于线粒体适应的研究是高原医学研究的一个重点和热点。

[0004] 机体线粒体内含有多个遗传物质‑线粒体DNA(mtDNA)，且mtDNA为细胞核外环状双链DNA分子，由位于内侧的轻链(L)和外侧的重链(H)组成。人的mtDNA全长16,569bp，由编码区和非编码区组成，编码区的功能为编码13个与氧化磷酸化相关的多肽、2组rRNA和22个tRNA。因mtDNA无内含子，且mtDNA表现为母系遗传，无组蛋白进行结合保护其编码过程，因此极易突变，会对基因组内的某些重要片段所携带的遗传信息产生影响，最终导致疾病的发生。

[0005] 线粒体DNA T16172C单核苷酸多态性(rs2853817)是人线粒体DNA上的一个SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)。rs2853817位于MT：16172(GRCh38)，HGVS:NC_012920.1:m.16172T>C，位于MT‑D‑loop基因内。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何筛查高原肺水肿易感个体或如何预测人对高原肺水肿的易感性或如何筛查携带人高原肺水肿易感基因的个体或如何评价高原肺水肿患病风险。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明首先提供了下述A1‑A5任一种应用和A6的产品：

[0008] A1.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质在制备筛查或辅助筛查高原肺水肿易感个体或非易感个体产品中的应用。

[0009] A2.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质在制备检测或辅助检测高原肺水肿易感性产品中的应用。

[0010] A3.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质在制备检测或辅助检测高原肺水肿患病风险产品中的应用。

[0011] A4.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质在制备评价或辅助评价高原肺水肿患病风险产品中的应用。

[0012] A5.检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质在制备筛查或辅助筛查高原肺水肿易感基因型或高原肺水肿非易感基因型产品中的应用。

[0013] A6.含有检测人基因组中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质的产品，为a)‑d)中的任一产品：

[0014] a)检测与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性或基因型产品；

[0015] b)鉴定或辅助鉴定与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

[0016] c)筛查或辅助筛查高原肺水肿患者的产品；

[0017] d)检测或辅助检测高原肺水肿易感性的产品。

[0018] 上述应用和产品中，所述检测人基因组线粒体DNA中rs2853817的多态性或基因型具体可为检测rs2853817的核苷酸种类。所述rs2853817的多态性或基因型是T或C。所述T是rs2853817位点为T的基因型，所述C是rs2853817位点为C的基因型。所述rs2853817的多态性或基因型为C的个体的高原肺水肿患病风险高于或候选高于所述rs2853817的多态性或基因型为T的个体。

[0019] 上述应用和产品中，所述产品可适用于中国人，如平原地区的中国人。所述中国人可为汉族人，性别可为男。

[0020] 上述应用和产品中，检测人基因组线粒体DNA中rs2853817的多态性或基因型(即等位基因)的物质可为通过下述至少一种方法确定rs2853817的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

[0021] 上述应用和产品中，所述检测人基因组线粒体DNA中rs2853817的多态性或基因型的物质，可含有扩增包括rs2853817在内的人基因组DNA片段的PCR引物和/或单碱基延伸引物。

[0022] 其中，所述PCR引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs2853817在内的基因组DNA片段即可，如所述PCR引物可为序列表中序列1和序列2所示的单链DNA组成的引物对，或所述PCR引物也可为序列表中序列4和序列5所示的单链DNA组成的引物对。所述单碱基延伸引物可根据人基因组中rs2853817上游或下游(不包括该SNP位点)设计，所述单碱基延伸引物延伸的核苷酸对应于人基因组rs2853817位点的那个核苷酸，即所述单碱基延伸引物的3’末端核苷酸对应于人基因组rs2853817的相邻位核苷酸(即rs2853817的前一位核苷酸或rs2853817的后一位核苷酸)，如所述单碱基延伸引物具体可为序列表中的序列3所示的单链DNA。

[0023] 上述应用和产品中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由PCR引物、单碱基延伸引物和质谱仪组成的产品，由PCR引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测人基因组线粒体DNA中rs2853817的多态性或基因型的物质。

[0024] 本发明的一个实施例中，采用PCR引物扩增包括线粒体DNA rs2853817在内的基因组DNA片段，以得到的PCR扩增产物为模板，采用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，对得到的延伸产物的序列进行检测，确定rs2853817的多态性和基因型。

[0025] 实验证明，在由49个平原地区的血缘上无关的中国男性汉族高原肺水肿患者组成的病例群体和由58个平原地区的血缘上无关的中国男性汉族正常人组成的对照群体中，线粒体DNA的rs2853817多态性位点为C基因型在病例组的分布频率要显著高于对照组(p‑value＝0.016，df＝1)。通过Logistic回归分析校正后，发现C基因型会增加患高原肺水肿的概率(OR 4.701；95％CI，1.214‑18.204；p‑adjust＝0.035)。说明线粒体DNA rs2853817是与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性，携带T16172C(rs2853817)位点C等位基因的人群发生HAPE的风险显著高于携带T16172C(rs2853817)位点T等位基因的人群，rs2853817可用于筛查高原肺水肿易感个体、预测人对高原肺水肿的易感性、筛查携带人高原肺水肿易感基因的个体和评价高原肺水肿患病风险。在实际应用中，为了提高准确率，可将检测rs2853817多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查易患高原肺水肿个体的产品。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0027] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0029] 实施例1、检测线粒体DNA的rs2853817位点基因型方法的建立

[0030] rs2853817是人线粒体DNA上的一个SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)。rs2853817位于MT：16172(GRCh38)，HGVS:NC_012920.1:m.16172T>C，位于MT‑D‑loop基因内(NCBI Reference Sequence:NC_012920.1，31‑OCT‑2014)。rs2853817基因型是T或C。其中，T是rs2853817位点为T的基因型，C是rs2853817位点为C的基因型。

[0031] 1、基因组DNA的提取

[0032] 提取待测样品基因组DNA，以其为模板进行基因型检测。

[0033] 2、引物的设计与合成

[0034] 使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计rs2853817的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。检测线粒体DNA基因的rs2853817位点基因型的PCR扩增特异性引物对的序列为：正向引物：5’‑ACGTTGGATGCAGCCACC ATG AAT ATT GT ACG‑ 3’(序列 表中的 序列1) ；反向 引物 ：5’‑ACGTTGGATGGTACTTGCTTGTAAGCATGGG‑3’(序列表中的序列2)。用于单碱基扩增反应的单碱基延伸引物序列为5’‑CCTGTAGTACATAAAAACCCAA‑3’(序列表中的序列3)

[0035] 3、检测线粒体DNA rs28538174位点基因型方法的建立

[0036] 3.1PCR扩增

[0037] PCR扩增在384孔板中进行，每个反应体系除模板外总体积为4μL，按表1配制PCR反应体系。

[0038] 表1每个PCR反应体系的组分

[0039] 试剂 体积(μL)10×PCR缓冲液 0.5
MgCl2(25mM) 0.4
dNTP mix(25mM) 0.1
HotStar Taq酶(5U/μL) 0.1
超纯水 1.9
序列1所示的DNA 0.5
序列2所示的DNA 0.5
总体积 4

[0040] 取出上述1制备好的基因组DNA样品，调整加样体积为1μL，每个5μL PCR反应体系中包含模板DNA 20‑50ng，Hotstar Tag 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μL的25mM dNTPs。

[0041] PCR反应程序为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。

[0042] 得到PCR产物。

[0043] 3.2PCR产物碱性磷酸酶处理

[0044] 在PCR反应结束后，将上述3.1得到的PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs，按表2配制SAP反应体系。

[0045] 表2 SAP反应体系

[0046] 试剂 体积(μL)超纯水 1.53
10×SAP缓冲液 0.17
SAP酶(1.7U/ul) 0.3
PCR产物 5
总体积 7

[0047] 反应条件为：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持。

[0048] 得到碱性磷酸酶处理后产物。

[0049] 3.3单碱基延伸

[0050] 在碱性磷酸酶处理结束后进行单碱基延伸反应，按表3配制单碱基延伸反应体系。

[0051] 表3单碱基延伸反应体系

[0052]试剂 对每个反应，μL
水 1.53
10×单碱基延伸反应缓冲液 0.17
单碱基延伸反应酶(1.7U/ul) 0.3
碱性磷酸酶处理后产物 7
序列3所示的DNA分子 1
总体积 10

[0053] 反应条件为：

[0054] I.94℃30秒

[0055] II.94℃5秒

[0056] III.52℃5秒

[0057] IV.80℃5秒

[0058] V.回到III，4次循环

[0059] VI.回到II，39次循环

[0060] VII.72℃3分钟

[0061] VIII.4℃

[0062] 得到单碱基延伸产物。

[0063] 3.4树脂纯化

[0064] 将Clean Resin树脂(美国Sequenom公司)平铺到6mg的树脂板中；加16μl水到上述3.3得到的单碱基延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部，得到树脂纯化后的延伸产物。

[0065] 3.5芯片点样

[0066] 启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(SEQUENOM公司)，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片(SEQUENOM公司)上。

[0067] 3.6质谱检测

[0068] 将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI‑TOF分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

[0069] 实施例2、线粒体DNA的多态位点rs2853817与高原肺水肿易感性的分析该实施例用实施例1建立起来的方法，对参与者的线粒体DNA多态位点rs2853817基因型进行了分析。

[0070] 伦理声明

[0071] 每个参与者均签署知情同意书，本研究得到解放军第七医学中心和西藏解放军总医院医学伦理委员会的批准。

[0072] 研究对象

[0073] 研究对象是解放军第七医学中心从西藏解放军总医院2018年9月至2019年9月获得的两个群体，群体1由49例高原肺水肿患者(病例组)及58例正常人(对照组)组成；群体2(验证样本)由33例高原肺水肿患者(病例组)和19例正常人(对照组)的外周血样品。两组共82例高原肺水肿患者和77例正常人均是平原地区的血缘上无关的中国男性汉族人。82例高原肺水肿患者年龄19‑60岁，平均(30.7±10.7)岁；77例正常人来自于常规健康体检人群，年龄19‑55岁，平均(25.4±6.1)岁。所有的人均没有吸烟史，饮酒史，且都没有与线粒体相关的疾病，例如心血管疾病，糖尿病等，而且之前都没有高原旅行史，并且都是到达同一个海拔高度西藏拉萨(3658m)的人群。

[0074] 其中，高原肺水肿患者除了满足以上条件外，还需要符合高原肺水肿的诊断标准，即现场诊断标准和临床诊断标准。

[0075] 现场诊断标准：

[0076] (1)发病。近期抵达高原(一般在海拔3000m以上)。

[0077] (2)体征。静息时呼吸困难,胸闷压塞感，咳嗽,咳白色或粉红色泡沫状痰,无力或活动能力减低。

[0078] (3)体征。一侧或双侧肺野出现湿性啰音或喘鸣音,中央性紫绀,呼吸过速,心动过速。

[0079] 以上症状、体征各至少具两项始可作诊断。

[0080] 临床诊断标准：

[0081] (1)近期抵达高原(一般在海拔3000m以上),出现静息时呼吸困难、咳嗽,咳白色或粉红色泡沫状痰。

[0082] (2)中央性紫绀，肺部湿性啰音。

[0083] (3)胸部X线是诊断的主要依据,可见以肺门为中心向单侧或两侧肺野呈点片状或云絮状浸润阴影,常呈弥漫性、不规则性分布,亦可融合成大片状阴影；心影多正常,但亦可见肺动脉高压及右心增大征象。

[0084] (4)经临床及心电图等检查排除心肌梗死、心力衰竭等其它心肺疾患,并排除肺炎。

[0085] (5)经卧床休息、吸氧等治疗或低转,症状迅速好转,X线征象可于短期内消失。

[0086] 1、线粒体DNA多态位点rs2853817基因型的确定：

[0087] 按照实施例1的方法，分别提取群体1的49例高原肺水肿患者和58例正常人的外周血样品的基因组DNA，进行PCR扩增、单碱基延伸反应和基因分型。两组线粒体DNA的rs2853817多态性位点的基因型频率的分布，见表4。49例高原肺水肿患者中rs2853817基因型为C的个体为10例，基因型频率为20.4％；rs2853817基因型为T的个体为39例，基因型频率为79.6％。58例正常人中rs2853817基因型为C的个体为3例，基因型频率为5.2％；rs2853817基因型为T的个体为55例，基因型频率为94.8％。试验所有数据采用SPSS17.0(SPSS Inc.,USA)统计软件的独立样本Person检验进行处理统计。

[0088] 所有样本中，与对照组(58例正常人)比较，C基因型在病例组(49例高原肺水肿患者)的分布频率要显著高于对照组(p‑value＝0.016，df＝1),说明病例组和对照组之间C，T基因型的分布频率有显著性差异(p<0.05)。通过Logistic回归分析校正后，发现C基因型的增加会增加患HAPE的概率(OR 4.701；95％CI，1.214‑18.204；p‑adjust＝0.035)。以上结果说明，线粒体DNA多态位点rs2853817与高原肺水肿存在显著相关。携带T16172C(rs2853817)位点C等位基因的人群发生HAPE的风险显著高于携带T16172C(rs2853817)位点T等位基因的人群。

[0089] 表4病例组和对照组线粒体DNA的rs2853817多态性位点的基因型频率

[0090]

[0091] 注：p‑value：Personχ2 test，p‑adjust：adjust p‑value，OR：比值比，CI：置信区间。

[0092] 2、线粒体DNA多态位点rs2853817基因型的验证

[0093] 按照同样的原理和方法，再次选取了群体2的33例高原肺水肿患者和19例正常人，提取外周血样品的基因组DNA，以其为模板，使用正向引物：5’‑CAGCCACCATGAATATTGTACG‑3’(序列表中的序列4)；反向引物：5’‑GTTAGGCTGGTGTTAGGGTTC‑3’(序列表中的序列5)进行PCR扩增包括线粒体DNA基因的rs2853817位点在内的基因组DNA片段并测序，结果表明共得到两种PCR产物，两种PCR产物的序列为序列表中的序列6，序列6中，y为c或t。rs2853817位点位于序列6的第65位，该处核苷酸为C或T，当该处核苷酸为T时，rs2853817基因型为T，当该处核苷酸为C时，rs2853817基因型为C。两组线粒体DNA的rs2853817多态性位点的基因型频率的分布见表5。结果显示33例高原肺水肿患者中rs2853817基因型为C的个体为11例，基因型频率为33.3％；rs2853817基因型为T的个体为22例，基因型频率为66.7％。19例正常人中rs2853817基因型为C的个体为1例，基因型频率为5.3％；rs2853817基因型为T的个体为
18例，基因型频率为94.7％。数据采用SPSS17.0(SPSS Inc.,USA)统计软件的独立样本Person检验进行处理统计。

[0094] 表5病例组和对照组线粒体DNA的rs2853817多态性位点的基因型频率

[0095]

[0096] 注：p‑value：Personχ2 test，p‑adjust：adjust p‑value，OR：比值比，CI：置信区间。

[0097] 所有验证样本中，与对照组(19例正常人)比较，C基因型在病例组(33例高原肺水肿患者)的分布频率要显著高于对照组(p‑value＝0.021，df＝1),说明病例组和对照组之间C、T基因型的分布频率有显著性差异(p<0.05)。通过Logistic回归分析校正后，发现C基因型的增加会增加患HAPE的概率(OR 9.000；95％CI，1.059‑76.479；p‑adjust＝0.049)。以上结果说明，线粒体DNA多态位点rs2853817与高原肺水肿存在显著相关。与表4的结果一致。

[0098] 通过以上所有结果证实，携带T16172C(rs2853817)位点C等位基因的人群发生HAPE的风险显著高于携带T16172C(rs2853817)位点T等位基因的人群，rs2853817可用于筛查高原肺水肿易感个体、预测人对高原肺水肿的易感性、筛查携带人高原肺水肿易感基因的个体和评价高原肺水肿患病风险。