苄丝肼、及与氟康唑的组合物在制备抗真菌产品中的应用转让专利
申请号 : CN202010782426.2
文献号 : CN111700885B
文献日 : 2021-06-04
发明人 : 孙淑娟 , 陈雪琪 , 鲁春燕 , 闫海英 , 任洪耀
申请人 : 山东省千佛山医院
摘要 :
本发明具体涉及苄丝肼、及与氟康唑的组合物在制备抗真菌产品中的应用。近些年来，真菌感染率及其导致的死亡率呈现上升趋势，其中以念珠菌对于人身威胁最为严重。目前唑类药物是抗真菌治疗的一线药物，但由于耐药菌的不断出现导致治疗效果不甚理想。针对该现状，本发明提供苄丝肼的抗真菌作用，丰富了具有抗真菌作用的化合物实体，进一步的，本发明研究还表明，苄丝肼能够与氟康唑协同，对于白色念珠菌、克柔念珠菌及光滑念珠菌等危害性较大的念珠菌具有良好的抑制效果，提高耐药株的药物敏感性，降低药物用量。
权利要求 :
1.苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌(Candida albicans)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)。
2.如权利要求1所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌产品包括但不限于抗真菌药物、抗真菌洗护用品或抗真菌纺织品。
3.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物中包括所述苄丝肼及药学上所必须的辅料。
4.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物用于白色念珠菌时，苄丝肼的最低抑菌浓度为8‑32μg/mL；其中，对于对氟康唑敏感的白色念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为8‑32μg/mL，对于对氟康唑耐药的白色念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为16‑32μg/mL。
5.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物用于克柔念珠菌时，苄丝肼的最低抑菌浓度为2‑8μg/mL。
6.如权利要求5所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述克柔念珠菌为对氟康唑呈低耐药的克柔念珠菌。
7.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物用于光滑念珠菌时，苄丝肼的最低抑菌浓度为2‑32μg/mL。
8.如权利要求7所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，对氟康唑呈剂量依赖性敏感的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为4‑32μg/mL，对于对氟康唑耐药的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2μg/mL。
9.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型。
10.如权利要求9所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物可以是口服的片剂、胶囊、丸剂、粉剂、缓释制剂、溶液和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软膏、乳膏或凝胶剂，或者用于直肠给药的栓剂。
11.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌洗护产品包括但不限于洗发产品、洗手产品及洁阴产品。
12.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌洗护产品中，包括所述苄丝肼，还包括酮康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑中的一种或几种的混合。
13.如权利要求2所述苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌纺织品包括但不限于毛巾、家纺或内衣。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括苄丝肼及三唑类抗真菌药物。
15.如权利要求14所述药物组合物，其特征在于，所述三唑类抗真菌药物为氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和拉夫康唑。
16.如权利要求15所述药物组合物，其特征在于，所述三唑类抗真菌药物为氟康唑。
17.如权利要求14所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由苄丝肼和氟康唑组成；其中，苄丝肼的最低抑菌浓度为4‑8μg/mL，氟康唑的最低抑菌浓度为0.125‑0.5μg/mL。
18.权利要求14‑17任一所述药物组合物在制备抗真菌产品中的应用。
说明书 :
苄丝肼、及与氟康唑的组合物在制备抗真菌产品中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于抗真菌药物技术领域，具体涉及一种苄丝肼、以及苄丝肼和氟康唑构成的药物组合物在制备抗真菌产品中的应用。
背景技术
[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技
术。
术。
[0003] 近年来，由于广谱抗生素的使用、器官移植和导管留置等技术的开展、癌症放疗化疗的增多等，使得免疫功能低下患者不断增多，深部真菌感染率大幅上升。尽管有抗真菌药
物的治疗，但真菌菌血症的病死率仍高，特别是念珠菌菌血症的病死率高达40％‑80％(王
斌，曾明，王雪松，袁静.白色念珠菌毒力因子的蛋白质组学研究进展[J].中国医药生物技
术，2010，5(5)：377‑380.)。白色念珠菌(Candida albicans,CA)是引起免疫低下宿主感染
的重要条件致病真菌，导致的感染率和病死率约占医源性感染的50％，非白色念珠菌种属
如克柔念珠菌(Candida krusei,CK)和光滑念珠菌(Candida glabrata,CG)等导致的念珠
菌血症的发病率也在逐年增长。据文献报道,在器官移植的患者中非白色念珠菌的分离率
也逐年上升，甚至在某些地区非白色念珠菌的分离率高于白色念珠菌。由于念珠菌容易出
现药物外排增强与基因靶标改变等问题，使得对抗真菌药物的耐药率不断增加。非白色念
珠菌对氟康唑(fluconazole，FLC)耐药率已达57.5％,其中热带念珠菌和光滑念珠菌对氟
康唑耐药性达19.4％,克柔念珠菌对氟康唑耐药率达100％。除此之外，非白色念珠菌对氟
康唑、伊曲康唑等药物出现了不同程度的交叉耐药，交叉耐药性高于白色念珠菌。因此，非
白色念珠菌引起的感染给临床带来了极大挑战，引起了人们的重视。
物的治疗，但真菌菌血症的病死率仍高，特别是念珠菌菌血症的病死率高达40％‑80％(王
斌，曾明，王雪松，袁静.白色念珠菌毒力因子的蛋白质组学研究进展[J].中国医药生物技
术，2010，5(5)：377‑380.)。白色念珠菌(Candida albicans,CA)是引起免疫低下宿主感染
的重要条件致病真菌，导致的感染率和病死率约占医源性感染的50％，非白色念珠菌种属
如克柔念珠菌(Candida krusei,CK)和光滑念珠菌(Candida glabrata,CG)等导致的念珠
菌血症的发病率也在逐年增长。据文献报道,在器官移植的患者中非白色念珠菌的分离率
也逐年上升，甚至在某些地区非白色念珠菌的分离率高于白色念珠菌。由于念珠菌容易出
现药物外排增强与基因靶标改变等问题，使得对抗真菌药物的耐药率不断增加。非白色念
珠菌对氟康唑(fluconazole，FLC)耐药率已达57.5％,其中热带念珠菌和光滑念珠菌对氟
康唑耐药性达19.4％,克柔念珠菌对氟康唑耐药率达100％。除此之外，非白色念珠菌对氟
康唑、伊曲康唑等药物出现了不同程度的交叉耐药，交叉耐药性高于白色念珠菌。因此，非
白色念珠菌引起的感染给临床带来了极大挑战，引起了人们的重视。
[0004] 唑类是目前临床主要使用的抗真菌药物，其中氟康唑安全、有效且价格低廉，在临床上使用广泛，但随之而来不断出现的耐药性使得寻找新的抗真菌手段迫在眉睫。开发新
的抗真菌药物和药物的联合使用克服真菌耐药均是抗真菌的有效途径，然而开发新的抗真
菌药物需要巨额的资金投入，强大的科研队伍及较长的研究周期，而联合用药克服真菌耐
药投入少且效果显著，因此成为研究热点。
的抗真菌药物和药物的联合使用克服真菌耐药均是抗真菌的有效途径，然而开发新的抗真
菌药物需要巨额的资金投入，强大的科研队伍及较长的研究周期，而联合用药克服真菌耐
药投入少且效果显著，因此成为研究热点。
[0005] 苄丝肼(Benserazide，BEH)是外周多巴脱羧酶抑制剂，在临床上与左旋多巴联合应用组成复方制剂多巴丝肼，治疗帕金森综合症，可减少左旋多巴的用量，增强其疗效并减
少其外周不良反应。
少其外周不良反应。
发明内容
[0006] 面对临床应用中抗真菌药物较少且耐药现象频出的现状，研制新型的抗真菌药物是解决这一问题的途径之一，同时探寻非抗真菌药物与抗真菌药物联合用药也是一个较好
的选择。为了解决该技术问题，本发明研究提供了苄丝肼单独使用时具有抗真菌活性，与氟
康唑联用抗白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌时也能显著降低氟康唑的MIC值，降低氟
康唑的用量。
的选择。为了解决该技术问题，本发明研究提供了苄丝肼单独使用时具有抗真菌活性，与氟
康唑联用抗白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌时也能显著降低氟康唑的MIC值，降低氟
康唑的用量。
[0007] 基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明第一方面，提供苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用。
[0009] 念珠菌，也称假丝酵母菌属(Candida species)，可侵犯皮肤、粘膜和内脏，表现为急性、亚急性或慢性炎症，大多为继发性感染。假丝酵母菌种类很多，但能对人致病的仅有
几种，其中以白假丝酵母菌即白色念珠菌最常见，致病力也最强，其他常见类型中还包括克
柔念珠菌及光滑念珠菌。依据本发明的研究结果，苄丝肼单独使用对白色念珠菌、克柔念珠
菌、光滑念珠菌都有良好的抗菌活性，包括对于上述菌株的敏感菌和耐药菌都能够体现出
抑制作用。本发明的结果提供了苄丝肼的临床新应用，依据本领域的常规研究思路，苄丝肼
可单独作为活性成分与辅料配合用于制备抗真菌产品，还可以与其他具有抗真菌活性的成
分联合应用于抗真菌产品。基于该研究思路，本发明进一步研究了苄丝肼与抗真菌活性成
分的联合使用效果，并且发现，苄丝肼与三唑类药物联合能够起到协同效果，有效降低MIC
剂量，提高菌株对药物的敏感性。
几种，其中以白假丝酵母菌即白色念珠菌最常见，致病力也最强，其他常见类型中还包括克
柔念珠菌及光滑念珠菌。依据本发明的研究结果，苄丝肼单独使用对白色念珠菌、克柔念珠
菌、光滑念珠菌都有良好的抗菌活性，包括对于上述菌株的敏感菌和耐药菌都能够体现出
抑制作用。本发明的结果提供了苄丝肼的临床新应用，依据本领域的常规研究思路，苄丝肼
可单独作为活性成分与辅料配合用于制备抗真菌产品，还可以与其他具有抗真菌活性的成
分联合应用于抗真菌产品。基于该研究思路，本发明进一步研究了苄丝肼与抗真菌活性成
分的联合使用效果，并且发现，苄丝肼与三唑类药物联合能够起到协同效果，有效降低MIC
剂量，提高菌株对药物的敏感性。
[0010] 本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括苄丝肼及三唑类抗真菌药物。
[0011] 本发明第三方面，提供第二方面所述药物组合物在制备抗真菌产品中的应用。
[0012] 以上一个或多个技术方案的有益效果是：
[0013] 1.本发明定量评价了临床常用抗帕金森病药物苄丝肼单用的抗真菌作用，以及与氟康唑的联合抗真菌作用，证实了苄丝肼对氟康唑的增敏效果，丰富了苄丝肼的临床使用
目的，进一步提升了苄丝肼的经济价值。
目的，进一步提升了苄丝肼的经济价值。
[0014] 2.真菌耐药机制十分复杂，本领域目前对于该机制并不完全明确，不同药物联合之后的抗菌作用难以进行有效的预期。本发明研究发现，苄丝肼与氟康唑联合应用时，对耐
药白色念珠菌呈现强协同作用，氟康唑从大于512μg/mL降低至0.125‑0.5μg/mL。
药白色念珠菌呈现强协同作用，氟康唑从大于512μg/mL降低至0.125‑0.5μg/mL。
[0015] 苄丝肼对白色念珠菌敏感株、克柔念珠菌、光滑念珠菌来说无协同作用，但也降低了氟康唑的最低有效抑菌浓度，不同药物的抗菌作用难以进行有效预期。本发明研究结果
对于进一步明确真菌耐药机制、研究药物之间协同增进作用，减少药物耐药情况的发生具
有重要意义。
对于进一步明确真菌耐药机制、研究药物之间协同增进作用，减少药物耐药情况的发生具
有重要意义。
[0016] 3.白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌对于人体健康威胁较大，本发明研究提供了苄丝肼或与氟康唑联合对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的抑制作用，MIC值分别
为8‑32μg/mL、2‑8μg/mL、2‑32μg/mL；有效降低了减少抗真菌药物氟康唑的用药量，从而降
低药物的不良反应的发生，克服临床上真菌耐药问题。氟康唑可明显增强苄丝肼抗真菌作
用，并且降低了苄丝肼的最低有效浓度，减少了苄丝肼的用药量。
为8‑32μg/mL、2‑8μg/mL、2‑32μg/mL；有效降低了减少抗真菌药物氟康唑的用药量，从而降
低药物的不良反应的发生，克服临床上真菌耐药问题。氟康唑可明显增强苄丝肼抗真菌作
用，并且降低了苄丝肼的最低有效浓度，减少了苄丝肼的用药量。
具体实施方式
[0017] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常
理解的相同含义。
理解的相同含义。
[0018] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0019] 正如背景技术所介绍的，针对不断出现的真菌耐药现象，为了解决如上的技术问题，本发明提出了苄丝肼的抗真菌作用，以及苄丝肼对氟康唑的协同增进作用。
[0020] 本发明第一方面，提供苄丝肼在制备抗真菌产品中的应用。
[0021] 优选的，所述真菌为念珠菌。
[0022] 进一步优选的，所述念珠菌包括但不限于为白色念珠菌(Candida albicans)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)。
[0023] 优选的，所述抗真菌产品包括但不限于抗真菌药物、抗真菌洗护用品或抗真菌纺织品。
[0024] 进一步优选的，所述抗真菌药物中包括所述苄丝肼及药学上所必须的辅料。
[0025] 上述优选的技术方案中一些实施方式中，所述苄丝肼占抗真菌药物总量的1～99％，所述抗真菌药物为适合单次施予精确剂量的单位剂型。
[0026] 在该系列的实施方式中，所述抗真菌药物用于白色念珠菌时，苄丝肼的最低抑菌浓度为8‑32μg/mL；其中，对于对氟康唑敏感的白色念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为
8‑32μg/mL，对于对氟康唑耐药的白色念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为16‑32μg/mL。
8‑32μg/mL，对于对氟康唑耐药的白色念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为16‑32μg/mL。
[0027] 在该系列的实施例中，所述抗真菌药物用于克柔念珠菌时，苄丝肼的最低抑菌浓度为2‑8μg/mL；进一步的，所述克柔念珠菌为对氟康唑呈低耐药的克柔念珠菌。
[0028] 在该系列实施例中，所述抗真菌药物用于光滑念珠菌时，苄丝肼的最低抑菌浓度为2‑32μg/mL；进一步的，对氟康唑呈剂量依赖性敏感的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑
菌浓度为4‑32μg/mL，对于对氟康唑耐药的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2μg/
mL。
菌浓度为4‑32μg/mL，对于对氟康唑耐药的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2μg/
mL。
[0029] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量在约0.001mg/kg体重/天‑约1000mg/kg体重/天的范围内。
[0030] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量的范围为约0.5mg/kg体重/天‑约50mg/kg体重/天。
[0031] 在一些实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.001g/天‑约7g/天。
[0032] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.002g/天‑约6g/天。
[0033] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.005g/天‑约5g/天。
[0034] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.01g/天‑约5g/天。
[0035] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.02g/天‑约5g/天。
[0036] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.05g/天‑约2.5g/天。
[0037] 在其它实施方式中，所述抗真菌药物的量为约0.1g/天‑约1g/天。
[0038] 在其它实施方式中，低于上述范围下限的剂量水平可能已经是足够的。
[0039] 在其它实施方式中，可能需要高于上述范围上限的剂量水平。
[0040] 进一步优选的，所述抗真菌药物为包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型；进一步优选的，所述药物组合物可以是口服的片剂、胶囊、丸剂、粉
剂、缓释制剂、溶液和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软
膏、乳膏或凝胶剂，或者用于直肠给药的栓剂。
剂、缓释制剂、溶液和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软
膏、乳膏或凝胶剂，或者用于直肠给药的栓剂。
[0041] 在上述优选技术方案的一些实施方式中，所述抗真菌药物为软膏、乳膏或凝胶剂，所述苄丝肼与适宜基质混均后制成具有一定稠度的半固体外用制剂。
[0042] 所述抗真菌药物应用于多毛发、多皮肤褶皱部位时，所述抗真菌药物为乳膏或凝胶剂。所述抗真菌药物应用于较为平滑的皮肤表面，例如手掌、脚掌、四肢表面等部位，所述
真菌药物为软膏。
真菌药物为软膏。
[0043] 进一步优选的，所述抗真菌洗护产品包括但不限于洗发产品、洗手产品及洁阴产品等。
[0044] 上述优选的技术方案的一些具体实施方式中，所述抗真菌洗护产品中，包括所述苄丝肼，还包括酮康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑中的一种或几种的混合。
[0045] 进一步优选的，所述抗真菌纺织品包括但不限于毛巾、家纺或内衣。
[0046] 本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括苄丝肼及三唑类抗真菌药物。
[0047] 优选的，所述三唑类抗真菌药物为氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和拉夫康唑。
[0048] 进一步优选的，所述三唑类抗真菌药物为氟康唑。
[0049] 在上述优选技术方案的一些实施方式中，所述药物组合物由苄丝肼和氟康唑组成。
[0050] 在该系列的实施方式中，苄丝肼的最低抑菌浓度为4‑8μg/mL，氟康唑的最低抑菌浓度为0.125‑0.5μg/mL。
[0051] 上述最低抑菌浓度视为活性成分作用于真菌时的浓度，该药物组合物中两种成分的配比依据本领域技术人员所掌握的现有技术，可以通过计算或常规实验手段获得。
[0052] 本发明第三方面，提供第二方面所述药物组合物在制备抗真菌产品中的应用。
[0053] 与第一方面所述抗真菌产品相同，所述抗真菌产品包括但不限于抗真菌药物、抗真菌洗护用品或抗真菌纺织品。所述抗真菌药物、抗真菌洗护用品或抗真菌纺织品药物组
合物的用量、剂型和使用形式与第一方面中所提及的抗真菌产品相似，本领域技术人员可
借鉴第一方面的记载获得一种包括该药物组合物的抗真菌产品。
合物的用量、剂型和使用形式与第一方面中所提及的抗真菌产品相似，本领域技术人员可
借鉴第一方面的记载获得一种包括该药物组合物的抗真菌产品。
[0054] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0055] 实施例1
[0056] 1.材料
[0057] 1.1药品与试剂
[0058] 氟康唑(fluconazole，FLC)，大连美仑生物技术有限公司；
[0059] 苄丝肼(Benserazide，BEH)，大连美仑生物技术有限公司；
[0060] 科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；
[0061] TTC‑沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；
[0062] 酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；
[0063] 蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；
[0064] 葡萄糖，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0065] 琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0066] PBS磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0067] 氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；
[0068] 磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132；
[0069] RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；
[0070] 3‑(N‑吗琳代)丙磺酸(MOPS)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0071] 甲萘醌(Menadione)，美国Sigma公司；
[0072] XTT(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；
[0073] 乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；
[0074] 丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；
[0075] XTT‑甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100mL已高压灭菌的林格氏液配成0.5mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭菌；加入10μL的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(即
取甲萘醌0.0860g溶解于5mL丙酮),使其终浓度为1μmol/L，摇匀，4℃避光保存。
取甲萘醌0.0860g溶解于5mL丙酮),使其终浓度为1μmol/L，摇匀，4℃避光保存。
[0076] 药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/mL的储备液,过滤分装；苄丝肼用无菌蒸馏水溶解，配成1024μg/mL的储备液，过滤分装。所有药液保存于‑20℃冰箱,备用。
[0077] PBS缓冲液：称取12g PBS磷酸盐缓冲剂至1L容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸馏水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保
存。
存。
[0078] 酵母浸膏‑蛋白胨‑葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500mL锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌，冷却后4℃冰箱保存备用。
[0079] RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含L‑谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40mL(含糖终浓度2％)及MOPS粉6.906g，加蒸馏水至约为200mL，混合
均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭
菌。
均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭
菌。
[0080] 1.2仪器
[0081]
[0082]
[0083] 1.3实验菌株
[0084] 质控菌株：白念菌株ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；
[0085] 实验菌株：千佛山临床分离的白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌，经科玛嘉显色鉴别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养。
[0086] 白色念珠菌编号为CA10、CA16、CA103、CA137、CA632、CA20003、CA4、CA8、CA14、CA20、CA19、CA129，克柔念珠菌编号为CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK9、CK10，光滑念珠菌编
号为CG1、CG2、CG3、CG4、CG5、CG8、CG9、CG10。
号为CG1、CG2、CG3、CG4、CG5、CG8、CG9、CG10。
[0087] 2.内容与方法
[0088] 2.1实验菌株敏感性的确定
[0089] 根据NCCLS推荐的M27‑A3方案进行氟康唑的药敏试验来选择不同敏感性的白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌。96孔板加好后，恒温35℃培养24h。然后加入XTT‑甲萘醌溶
液避光培养2h,用酶标仪在429nm处测OD值。根据在24h判读折点的最新标准(对于CA：MIC≤
2μg/mL为敏感菌株S，MIC≥8μg/mL为耐药菌株R；对于CK：为天然耐药菌株R；对于CG：MIC≤
32μg/mL为剂量依赖性敏感菌株SDD，MIC≥64μg/mL为耐药菌株R),选取的白色念珠菌为
CA10(R)、CA16(R)、CA103(R)、CA137(R)、CA632(R)、CA20003(R)、CA4(S)、CA8(S)、CA14(S)、
CA20(S)、CA19(S)、CA129(S)；克柔念珠菌CK1(低耐药)、CK2(低耐药)、CK3(低耐药)、CK4(低
耐药)、CK5(低耐药)、CK6(低耐药)、CK9(高耐药)、CK10(高耐药)；光滑念珠菌为CG1(SDD)、
CG2(R)、CG3(R)、CG4(SDD)、CG5(SDD)、CG8(SDD)、CG9(SDD)、CG10(SDD)。
液避光培养2h,用酶标仪在429nm处测OD值。根据在24h判读折点的最新标准(对于CA：MIC≤
2μg/mL为敏感菌株S，MIC≥8μg/mL为耐药菌株R；对于CK：为天然耐药菌株R；对于CG：MIC≤
32μg/mL为剂量依赖性敏感菌株SDD，MIC≥64μg/mL为耐药菌株R),选取的白色念珠菌为
CA10(R)、CA16(R)、CA103(R)、CA137(R)、CA632(R)、CA20003(R)、CA4(S)、CA8(S)、CA14(S)、
CA20(S)、CA19(S)、CA129(S)；克柔念珠菌CK1(低耐药)、CK2(低耐药)、CK3(低耐药)、CK4(低
耐药)、CK5(低耐药)、CK6(低耐药)、CK9(高耐药)、CK10(高耐药)；光滑念珠菌为CG1(SDD)、
CG2(R)、CG3(R)、CG4(SDD)、CG5(SDD)、CG8(SDD)、CG9(SDD)、CG10(SDD)。
[0090] 2.2菌液制备
[0091] ‑20℃下保存的菌株室温下解冻，接种到TTC‑沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24‑48h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。挑取单个较
大菌落用PBS缓冲液配成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样
6
品管与标准管浊度一致，此时菌浓度约为1×10CFU/mL，以RPMI 1640液体培养基将其稀释
3
使96孔平板内工作菌液浓度为2×10CFU/mL，并以活菌计数进行浓度验证工作菌液浓度。
大菌落用PBS缓冲液配成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样
6
品管与标准管浊度一致，此时菌浓度约为1×10CFU/mL，以RPMI 1640液体培养基将其稀释
3
使96孔平板内工作菌液浓度为2×10CFU/mL，并以活菌计数进行浓度验证工作菌液浓度。
[0092] 2.3苄丝肼单用或与氟康唑联合抗真菌作用测定
[0093] 2.3.1苄丝肼单用抗真菌作用研究
[0094] 根据美国临床与试验标准化协会CLSI M27‑A3方案，测定苄丝肼单用时对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，
MIC)。采用二倍稀释法配制苄丝肼浓度为64‑0.5μg/mL。利用96孔培养板进行测定，每行的
第一列作为空白对照，药物浓度为0，最后一列为200μL 1640液体培养基对照。用微量移液
器吸取50μL的苄丝肼溶液分别加入到96孔培养板的第2‑11列中，再用微量移液器吸取50μL
的RPMI 1640液体培养基加入96孔培养板，每个孔中加入时事先配制好的终浓度为2×
3
10CFU/mL的菌液。不足200μL的用RPMI 1640液体培养基补足。将96孔板置35℃恒温培养箱
中培养24h后，用XTT负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。
MIC)。采用二倍稀释法配制苄丝肼浓度为64‑0.5μg/mL。利用96孔培养板进行测定，每行的
第一列作为空白对照，药物浓度为0，最后一列为200μL 1640液体培养基对照。用微量移液
器吸取50μL的苄丝肼溶液分别加入到96孔培养板的第2‑11列中，再用微量移液器吸取50μL
的RPMI 1640液体培养基加入96孔培养板，每个孔中加入时事先配制好的终浓度为2×
3
10CFU/mL的菌液。不足200μL的用RPMI 1640液体培养基补足。将96孔板置35℃恒温培养箱
中培养24h后，用XTT负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。
[0095] 用上述方法测定苄丝肼单用抗真菌作用。
[0096] 2.3.2苄丝肼联合氟康唑抗真菌的静态作用研究
[0097] 根据美国临床与试验标准化协会CLSI M27‑A3方案，测定苄丝肼与氟康唑联用时对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的MIC。经前期实验条件摸索，各菌株工作菌液浓度
3
为2×10CFU/mL，氟康唑的浓度设计为128‑0.25μg/mL，苄丝肼的浓度设计为32‑0.5μg/mL。
按浓度从低到高的顺序吸取苄丝肼药液50μL，分别加入96孔平板的第G‑A行，按浓度从低到
高的顺序吸取氟康唑药液50μL，分别加入96孔平板的第2‑11列，上述已加药的每个孔再各
加100μL菌液使得每个孔加液体积为200μL，其余不足200μL的孔用RPMI 1640培养液补足。
第12列的每个孔分别加200μL RPMI 1640培养液，作为空白对照组；H1为生长对照组，只含
100μL菌液和100μL RPMI 1640培养液。将96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，用XTT
负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。
3
为2×10CFU/mL，氟康唑的浓度设计为128‑0.25μg/mL，苄丝肼的浓度设计为32‑0.5μg/mL。
按浓度从低到高的顺序吸取苄丝肼药液50μL，分别加入96孔平板的第G‑A行，按浓度从低到
高的顺序吸取氟康唑药液50μL，分别加入96孔平板的第2‑11列，上述已加药的每个孔再各
加100μL菌液使得每个孔加液体积为200μL，其余不足200μL的孔用RPMI 1640培养液补足。
第12列的每个孔分别加200μL RPMI 1640培养液，作为空白对照组；H1为生长对照组，只含
100μL菌液和100μL RPMI 1640培养液。将96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，用XTT
负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。
[0098] 2.3.3苄丝肼与氟康唑联用抗白色念珠菌生物膜最小抑菌浓度(Sessile minimum inhibitory concentrations,SMIC)的测定
[0099] 根据前期的实验，1×103CFU/mL浓度的白色念珠菌4小时就能形成生物膜，所以本实验选取4h、8h、12h和24h形成的生物膜，使用氟康唑单用、苄丝肼单用和氟康唑/苄丝肼联
用进行干预，测定SMIC值以确定药物对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。用微量移液器
3
吸取提前配制的浓度为1×10 CFU/mL白色念珠菌混悬液200μL加入到96孔培养板的1‑11
列，第12列为200μL RPMI 1640液体培养空白对照组。把96孔板放入35℃分别恒温培养4h、
8h、12h和24h，制得4h、8h、12h和24h生物膜。在以上时间点分别用微量移液器轻轻吸取96孔
培养板每孔的菌液，注意防止触碰孔板底部生物膜，再用200μL PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗96
孔板三次以去除浮游菌。
用进行干预，测定SMIC值以确定药物对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。用微量移液器
3
吸取提前配制的浓度为1×10 CFU/mL白色念珠菌混悬液200μL加入到96孔培养板的1‑11
列，第12列为200μL RPMI 1640液体培养空白对照组。把96孔板放入35℃分别恒温培养4h、
8h、12h和24h，制得4h、8h、12h和24h生物膜。在以上时间点分别用微量移液器轻轻吸取96孔
培养板每孔的菌液，注意防止触碰孔板底部生物膜，再用200μL PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗96
孔板三次以去除浮游菌。
[0100] 将工作浓度为1024μg/mL的苄丝肼溶液二倍浓度稀释后按照由低到高的浓度顺序加入到96孔板的第G‑A行，2560μg/mL的氟康唑溶液二倍浓度稀释后按照由低到高的浓度顺
序加入到96孔板的第2‑11列，每孔100μL。不足200μL的孔用RPMI 1640液体培养基补齐，恒
温箱培养24h后，将预先配置好的XTT溶液加入到96孔培养板中，恒温培养箱中35℃避光培
养2h，用酶标仪检测96孔培养板每个孔的OD值，对实验结果进行评价。数据取重复3次实验
的平均值。以FICI法评价苄丝肼与氟康唑的协同抗白色念珠菌生物膜作用。
序加入到96孔板的第2‑11列，每孔100μL。不足200μL的孔用RPMI 1640液体培养基补齐，恒
温箱培养24h后，将预先配置好的XTT溶液加入到96孔培养板中，恒温培养箱中35℃避光培
养2h，用酶标仪检测96孔培养板每个孔的OD值，对实验结果进行评价。数据取重复3次实验
的平均值。以FICI法评价苄丝肼与氟康唑的协同抗白色念珠菌生物膜作用。
[0101] 2.4评价方法与结果判定
[0102] 2.4.1 LA理论：Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析
方法为分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index,FICI)，表述
如下：
方法为分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index,FICI)，表述
如下：
[0103] ΣFIC＝FICA+FICB＝CA/MICA+CB/MICB
[0104] MICA和MICB分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，CA和CB为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI≤0.5定义为协同作用，0.5＜FICI≤1定义为相加作用，1＜FICI
≤2为无关作用，FICI>2为拮抗作用。
≤2为无关作用，FICI>2为拮抗作用。
[0105] 2.4.2 XTT法(二甲氧唑黄比色法)
[0106] 在取样时间点将各体系在蜗旋振荡器上混匀，吸取100μL某体系内的菌悬液加入到96孔平底培养板内，在以100μL无菌RPMI 1640液体培养基为空白对照的情况下，再分别
向每个加样后的孔内加入配制好的XTT‑甲萘醌溶液，培养板在35℃避光培养2h，酶标仪设
置单孔空白，在492nm处测各孔的OD值，每个体系做三组，取平均值记录结果，试验重复3次。
向每个加样后的孔内加入配制好的XTT‑甲萘醌溶液，培养板在35℃避光培养2h，酶标仪设
置单孔空白，在492nm处测各孔的OD值，每个体系做三组，取平均值记录结果，试验重复3次。
[0107] 3结果
[0108] 3.1苄丝肼单用抗真菌作用结果
[0109] 苄丝肼单用对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌都有良好的抗菌活性。对于不同敏感性的白色念珠菌包括敏感株和耐药株，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为8‑32μg/mL。对
于对氟康唑呈低耐药的克柔念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2‑8μg/mL。对于不同敏
感性的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2‑32μg/mL(表1)。
于对氟康唑呈低耐药的克柔念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2‑8μg/mL。对于不同敏
感性的光滑念珠菌，苄丝肼单用的最低抑菌浓度为2‑32μg/mL(表1)。
[0110] 表1苄丝肼抗真菌静态作用研究
[0111]
[0112] 注解：CA：白色念珠菌；CK：克柔念珠菌；CG：光滑念珠菌；药物最小抑菌浓度(MIC)：与空白对照孔进行对比，可以抑制真菌80％生长的最低的药物浓度；FLC：氟康唑；BEH：苄丝
肼。
肼。
[0113] 3.2苄丝肼与氟康唑的联合抗真菌作用结果
[0114] 三次重复性实验所得结果见表2。由测定结果可见，BEH与FLC联合应用时，对耐药白色念珠菌的FICI≤0.5，呈现协同作用。而对敏感白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的
FICI值大多在0.5和1之间，呈现相加作用，少数呈现无关作用，但联用后二者的MIC值均有
降低。
FICI值大多在0.5和1之间，呈现相加作用，少数呈现无关作用，但联用后二者的MIC值均有
降低。
[0115] 表2以FICI法评苄丝肼与氟康唑联合用药抗真菌作用
[0116]
[0117]
[0118] 注解：CA：白色念珠菌；CK：克柔念珠菌；CG：光滑念珠菌；药物最小抑菌浓度(MIC)：与空白对照孔进行对比，可以抑制真菌80％生长的最低的药物浓度；MICFLC：药物单用时氟
康唑的最低抑菌浓度；MICBEH：药物单用时苄丝肼的最低抑菌浓度；CFLC：药物联用时氟康唑
的最低抑菌浓度；CBEH：药物联用时苄丝肼的最低抑菌浓度。
康唑的最低抑菌浓度；MICBEH：药物单用时苄丝肼的最低抑菌浓度；CFLC：药物联用时氟康唑
的最低抑菌浓度；CBEH：药物联用时苄丝肼的最低抑菌浓度。
[0119] 3.3苄丝肼与氟康唑联用对白色念珠菌生物膜的FICI值
[0120] 三次重复性实验所得结果见表3。由测定结果可见，氟康唑与苄丝肼联合应用时，对白色念珠菌的4h和8h的生物膜的作用FICI＜0.5，呈现协同作用。而对CA10,CA16和CA4的
12h和24h的生物膜FICI则在0.5和1之间，呈现相加作用。对CA8的12h和24h的生物膜FICI则
在1和2之间，呈现无关作用。
12h和24h的生物膜FICI则在0.5和1之间，呈现相加作用。对CA8的12h和24h的生物膜FICI则
在1和2之间，呈现无关作用。
[0121] 表3 SMIC值
[0122]
[0123]
[0124] 注解：CA：白色念珠菌；时间：指的是白色念珠菌生物膜形成时间；SMIC80的终点判读标准为，与生长对照孔相比，使白色念珠菌生物膜生长受到80％抑制的最低药物浓度；
MICFLC：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；MICBEH：药物单用时苄丝肼的最低抑菌浓度；
CFLC：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；CBEH：药物联用时苄丝肼的最低抑菌浓度。
MICFLC：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；MICBEH：药物单用时苄丝肼的最低抑菌浓度；
CFLC：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；CBEH：药物联用时苄丝肼的最低抑菌浓度。
[0125] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。