基于MassArray核酸质谱平台的遗传性耳聋筛查的方法及其应用转让专利
申请号 : CN202010427809.8
文献号 : CN111705122B
文献日 : 2021-03-23
发明人 : 曹尚志 , 虞梦寂 , 卜范峰 , 丁然 , 吴炳耀 , 郑媛媛 , 李诗濛 , 任用
申请人 : 江苏先声医学诊断有限公司 , 江苏先声医疗器械有限公司 , 南京先声医学检验有限公司
摘要 :
本发明提供一种基于MassArray核酸质谱平台的遗传性耳聋筛查的引物组、方法及其应用。本发明基于MassArray核酸质谱平台设计检测遗传性耳聋相关SNP位点的引物组及其检测体系，可以对遗传性耳聋疾病相关的点突变、缺失突变及线粒体点突变等突变类型进行准确分型，实现对遗传性耳聋疾病快速有效的检测。
权利要求 :
1.一种用于检测遗传性耳聋相关SNP位点的引物组，其特征在于，所述引物组针对如下SNP位点：rs111033367、rs372347027、rs375668376、rs397518039、rs369522997、rs111033199、rs111033242、rs111033220、rs111033313、rs145254330、rs786204730、rs104894408、rs72474224、rs80338942、rs80338943、rs104894396、rs35887622、rs80338939、rs267606617、rs267606618、rs267606619、rs28937588、rs956666801、rs28938175、rs876657754、rs777465132、rs201895089和rs727504567；所述引物序列分别如SEQ_ID NO.1‑84所示。
2.权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组进一步分为如下两组：第一组包括针对rs956666801、rs80338942、rs80338943、rs876657754、rs375668376、rs111033367、rs267606618、rs397518039、rs267606619、rs111033242、rs777465132、rs111033199、rs72474224、rs372347027、rs28937588、rs267606617和rs104894408的引物；
第二组包括针对rs28938175、rs111033220、rs145254330、rs201895089、rs80338939、rs104894396、rs35887622、rs727504567、rs369522997、rs786204730和rs111033313的引物。
3.权利要求1‑2任一所述的引物组在制备筛查遗传性耳聋产品中的应用。
4.一种用于遗传性耳聋筛查的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1‑2任一所述的引物组。
5.一种用于遗传性耳聋筛查的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1‑2任一所述的引物组。
6.一种用于遗传性耳聋筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1‑2任一所述的引物组。
说明书 :
基于MassArray核酸质谱平台的遗传性耳聋筛查的方法及其
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于MassArray核酸质谱平台的遗传性耳聋筛查的方法及其应用。
背景技术
[0002] 据估算，我国出生缺陷总发生率约5.6％，出生缺陷严重影响儿童的生存和生活质量，给患儿及其家庭带来巨大痛苦和经济负担。
[0003] 据《中国出生缺陷防治报告(2012)》数据显示，听力障碍是我国第二大出生缺陷疾病，听力残疾占先天性残疾的24.97％。我国现有听力残疾人2054万，其中0‑6岁儿童超过80
万人，且每年新增3万聋儿，新增听障儿童总计超过6万例。在治疗方面，除昂贵的人工耳蜗
植入外，重度耳聋尚无法治疗。因此，早期诊聋防聋至关重要。
万人，且每年新增3万聋儿，新增听障儿童总计超过6万例。在治疗方面，除昂贵的人工耳蜗
植入外，重度耳聋尚无法治疗。因此，早期诊聋防聋至关重要。
[0004] 在中国，普通人群携带高风险基因突变的比例为4.37％，意味着几乎每20个人里就有1个人携带高风险的耳聋基因突变。假设中国目前有15亿人口，则携带人群高达6000‑
7500万人左右。这一数据和听力学家推断的中国听损人口现状相近。
7500万人左右。这一数据和听力学家推断的中国听损人口现状相近。
[0005] 2018年国家卫生健康委员会办公厅发布《全国出生缺陷综合防治方案》，要求全面开展苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能减低症和听力筛查(两筛，听筛)，县级应当开展产前筛
查、新生儿遗传代谢性疾病筛查、新生儿听力筛查。地市级原则上至少有1个新生儿听力筛
查中心。
查、新生儿遗传代谢性疾病筛查、新生儿听力筛查。地市级原则上至少有1个新生儿听力筛
查中心。
[0006] 基因突变等遗传因素导致的耳聋，根据致病方式和发病时间可分为先天性耳聋、迟发性耳聋和药物敏感性耳聋三种类型。我国新生儿常规听力筛查的耳声发射法(OAE)和
脑干听觉诱发电位法(BAEP)两种方法，可以有效的筛查出先天性耳聋患儿，但是对于迟发
性耳聋和药物敏感性耳聋两种类型只有通过耳聋基因检测方法才可筛查。因此联合筛查更
有助于全面评估患病风险，并采取具有针对性的预防及治疗措施。
脑干听觉诱发电位法(BAEP)两种方法，可以有效的筛查出先天性耳聋患儿，但是对于迟发
性耳聋和药物敏感性耳聋两种类型只有通过耳聋基因检测方法才可筛查。因此联合筛查更
有助于全面评估患病风险，并采取具有针对性的预防及治疗措施。
[0007] 目前检测手段众多且各具特色，微阵列芯片法，操作简便，快速，但是通量有限、灵敏度一般。而高通量基因检测技术，解决了通量的局限，但其成本高、检测周期长，且对实验
操作及数据分析人员的技术要求门槛高，因此尚未得到普及性地应用于临床检测。
操作及数据分析人员的技术要求门槛高，因此尚未得到普及性地应用于临床检测。
[0008] 综上，在目前全国新生儿听力残疾占先天性残疾较大比例的情况下，为了更全面的评估新生儿耳聋患病的风险。因此，亟需一种经济、快速、易操作的检测方法，已达到精准
的用药和治疗需求。早发现、早干预对提高患儿的健康质量有着重要意义。
的用药和治疗需求。早发现、早干预对提高患儿的健康质量有着重要意义。
[0009] 有鉴于此，提出本发明。
发明内容
[0010] 本发明要解决的技术问题是寻求适于遗传性耳聋的筛查方法，因此本发明的目的如下：
[0011] 本发明的第一目的是提供一种用于检测遗传性耳聋相关SNP位点的引物组。
[0012] 本发明的第二目的是提供一种上述用于检测遗传性耳聋相关SNP位点的引物组在遗传性耳聋筛查中的应用。
[0013] 本发明的第三目的是提供一种遗传性耳聋的筛查方法。
[0014] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0015] 本发明提供了一种用于检测遗传性耳聋相关SNP位点的引物组，所述的遗传性耳聋包括：先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋。
[0016] 进一步的，所述引物组针对USH2A，SLC26A4，GJB2，CDH23，MT‑ND1，KCNQ4，COCH和MYO6基因的点突变、缺失突变以及线粒体点突变进行检测分型。
[0017] 进一步的，所述引物组针对的SNP位点包括：rs111033367、rs372347027、rs375668376、rs397518039、rs369522997、rs111033199、rs111033242、rs111033220、
rs111033313、rs145254330、rs786204730、rs104894408、rs72474224、rs80338942、
rs80338943、rs104894396、rs35887622、rs80338939、rs267606617、rs267606618、
rs267606619、rs28937588、rs956666801和rs28938175、rs876657754、rs777465132、
rs201895089、rs727504567。
rs111033313、rs145254330、rs786204730、rs104894408、rs72474224、rs80338942、
rs80338943、rs104894396、rs35887622、rs80338939、rs267606617、rs267606618、
rs267606619、rs28937588、rs956666801和rs28938175、rs876657754、rs777465132、
rs201895089、rs727504567。
[0018] 优选的，所述引物序列分别如SEQ_ID NO.1‑56所示，或者与SEQ_ID NO.1‑56具有至少85％同一性。
[0019] 优选的，所述引物组进一步包括延伸引物，所述延伸引物序列如SEQ_ID NO.57‑84所示，或者与SEQ_ID NO.57‑84具有至少85％同一性。
[0020] 进一步的，所述引物组可分为如下两组：
[0021] 第一组包括针对rs956666801、rs80338942、rs80338943、rs876657754、rs375668376、rs111033367、rs267606618、rs397518039、rs267606619、rs111033242、
rs777465132、rs111033199、rs72474224、rs372347027、rs28937588、rs267606617和
rs104894408的引物。
rs777465132、rs111033199、rs72474224、rs372347027、rs28937588、rs267606617和
rs104894408的引物。
[0022] 第二组包括针对rs28938175、rs111033220、rs145254330、rs201895089、rs80338939、rs104894396、rs35887622、rs727504567、rs369522997、rs786204730和
rs111033313的引物。
rs111033313的引物。
[0023] 本发明还提供一种上述的引物组在制备筛查遗传性耳聋产品中的应用。
[0024] 本发明还提供一种上述的引物组在核酸质谱检测中的应用。
[0025] 本发明还提供一种用于遗传性耳聋筛查的组合物/产品/试剂盒，其特征在于，所述组合物/产品/试剂盒包括权利要求上述述的引物组。
[0026] 进一步的，所述组合物/产品/试剂盒还包括用于检测SNP位点的试剂和/或软件；更优选地，所述软件包括MassARRAY软件。
[0027] 本发明还提供一种筛查遗传性耳聋相关SNP位点的方法，或遗传性耳聋的筛查方法，其特征在于，所述方法包括应用上述所述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷
酸序列进行检测。
酸序列进行检测。
[0028] 进一步的，所述筛查基于MassARRAY平台。
[0029] 更进一步的，应用上述的用于筛查精神及神经类疾病相关SNP位点的引物组对待测对象基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应，再应用MassARRAY平台对反应产物进行筛
查，确定所述待测对象基因组中SNP位点的基因型。
查，确定所述待测对象基因组中SNP位点的基因型。
[0030] 本发明的有益技术效果：
[0031] 1)本发明提供的遗传性耳聋相关SNP位点的引物组，是通过大样本测试筛选得到，能够实现对点突变、缺失突变以及线粒体点突变三种突变类型样本进行准确的分型，同时
达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY系统对待测样品的遗传性耳聋疾病进行快
速有效的筛查。
达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY系统对待测样品的遗传性耳聋疾病进行快
速有效的筛查。
[0032] 本发明提供的遗传性耳聋相关SNP位点的引物组，覆盖先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋等常见的4大类遗传性耳聋突变位点，能够更有效进行遗
传性耳聋筛查。
传性耳聋筛查。
[0033] 本发明提供的用于为遗传性耳聋疾病筛查的产品，能够对遗传性相关的位点突变实现特异性检测，与目前市面上的检测方法相比，见下表，具有准确性强、灵敏度高、重复性
好以及成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等优势。目前已投放市场，且经市场检
验效果显著，获得极大商业上的回报，具有极大临床应用价值及更开阔的市场推广。
好以及成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等优势。目前已投放市场，且经市场检
验效果显著，获得极大商业上的回报，具有极大临床应用价值及更开阔的市场推广。
[0034]
[0035] 本发明可应用于8个遗传性耳聋相关基因和28个多态性位点的检测，极大提高了检测效率，特别适用于批量检测。除了表现出听力损害为唯一表型的非综合征性耳聋，可导
致新生儿多系统异常的综合征类耳聋超过400种。但常见检测的目标均为非综合征性耳聋，
对引起多系统疾病的综合征类耳聋设计较少。本发明的待测位点中包含常见综合征性耳聋
的热点位点，不仅关注听力发育情况，也对各系统发育提出针对性建议。例：Usher综合症可
导致3％‑6％的儿童患先天性听力损害，同时导致视力发育不良，在青春期开始后易出现进
行性视力损伤。因此主要致病基因USH2A具有检测意义。
致新生儿多系统异常的综合征类耳聋超过400种。但常见检测的目标均为非综合征性耳聋，
对引起多系统疾病的综合征类耳聋设计较少。本发明的待测位点中包含常见综合征性耳聋
的热点位点，不仅关注听力发育情况，也对各系统发育提出针对性建议。例：Usher综合症可
导致3％‑6％的儿童患先天性听力损害，同时导致视力发育不良，在青春期开始后易出现进
行性视力损伤。因此主要致病基因USH2A具有检测意义。
[0036] 本发明克服了现有技术中一次性检测SNP位点较少的缺陷，且成本低廉，适用于广泛推广；本发明所需样本的适应性强，外周血和干血斑均能较好的检出；本发明适用于新生
儿、儿童及需要生育者，不仅可以提供受检者及亲属生活注意事项和氨基糖苷类药物风险
提示，还可以帮助有疑似家族史的受检者筛查致病位点，评估致病效力，辅助再生殖；高风
险携带者可及早采取针对性措施，提升治疗效果，避免语前聋。为遗传性耳聋的防治提供有
效的科学参考。
儿、儿童及需要生育者，不仅可以提供受检者及亲属生活注意事项和氨基糖苷类药物风险
提示，还可以帮助有疑似家族史的受检者筛查致病位点，评估致病效力，辅助再生殖；高风
险携带者可及早采取针对性措施，提升治疗效果，避免语前聋。为遗传性耳聋的防治提供有
效的科学参考。
附图说明
[0037] 图1为本发明实施例2提供的rs35887622位点优化前位点的聚类图
[0038] 图2为本发明实施例2提供的rs35887622位点优化后位点的聚类图
[0039] 图3为本发明实施例2提供的rs786204730位点优化前位点的峰图
[0040] 图4为本发明实施例2提供的rs786204730位点优化后位点的峰图
[0041] 图5为本发明实施例2提供的并孔后rs267606617位点的聚类图
[0042] 图6为本发明实施例2提供的并孔后rs267606618位点的聚类图
[0043] 图7为本发明实施例2提供的并孔后rs267606619位点的聚类图
[0044] 图8为本发明实施例3提供的rs956666801位点的聚类图；
[0045] 图9为本发明实施例3提供的rs80338943位点的聚类图；
[0046] 图10为本发明实施例4提供的rs72474224位点的聚类图
[0047] 图11为本发明实施例4提供的rs35887622位点的聚类图
[0048] 图12为本发明实施例4提供的rs104894408位点的聚类图
[0049] 图13为本发明实施例4提供的rs80338939位点的聚类图
[0050] 图14为本发明实施例4提供的rs80338942位点的聚类图
[0051] 图15为本发明实施例4提供的rs104894396位点的聚类图
[0052] 图16为本发明实施例4提供的rs80338943位点的聚类图
[0053] 图17为本发明实施例4提供的rs201895089位点的聚类图
具体实施方式
[0054] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
[0055] 除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员
很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
[0056] 如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为
是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方
案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方
案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
[0057] 在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
[0058] 本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
[0059] 此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在
适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其
它顺序实施。
适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其
它顺序实施。
[0060] 以下仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
[0061] 本发明所述的用于检测遗传性耳聋相关SNP位点的引物组，是针对与遗传性耳聋相关的主要突变位点进行设计，可以对遗传性耳聋相关的位点突变实现特异性检测，准确
性高，且检测结果覆盖了先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋等常见
的4大类遗传性耳聋的突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本。此外，本发
明提供的引物组是通过更改优化及大样本测试筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准
确分型，同时也能够达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY平台对遗传性耳聋进行
快速有效的检测。
性高，且检测结果覆盖了先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋等常见
的4大类遗传性耳聋的突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本。此外，本发
明提供的引物组是通过更改优化及大样本测试筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准
确分型，同时也能够达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY平台对遗传性耳聋进行
快速有效的检测。
[0062] 在一些优选的实施方式中，所述遗传性耳聋对应的SNP位点包括：rs111033367、rs372347027、rs375668376、rs397518039、rs369522997、rs111033199、rs111033242、
rs111033220、rs111033313、rs145254330、rs786204730、rs104894408、rs72474224、
rs80338942、rs80338943、rs104894396、rs35887622、rs80338939、rs267606617、
rs267606618、rs267606619、rs28937588、rs956666801和rs28938175、rs876657754、
rs777465132、rs201895089、rs727504567。
rs111033220、rs111033313、rs145254330、rs786204730、rs104894408、rs72474224、
rs80338942、rs80338943、rs104894396、rs35887622、rs80338939、rs267606617、
rs267606618、rs267606619、rs28937588、rs956666801和rs28938175、rs876657754、
rs777465132、rs201895089、rs727504567。
[0063] 在一些优选的实施方式中，所述引物组序列如SEQ_ID NO.1‑56所示，或者与SEQ_ID NO.1‑56具有至少85％同一性。
[0064] 可以理解的是，本发明中所述的引物对为PCR引物对。
[0065] 需要进行说明的是，术语“同一性”指的是序列的相似性。“同一性”包括与本发明所述的SEQ_ID NO.1～SEQ_ID NO.56所示的单链DNA具有至少85％(例如可以为，但不限于
85％、90％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
85％、90％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
[0066] 在一些优选的实施方式中，当实际应用需要延伸引物时，所述引物组还包括SEQ_ID NO.57‑84所示的28个延伸引物，或者与SEQ_ID NO.57‑84具有至少85％同一性的延伸引
物。
物。
[0067] 可以理解的是，本发明中引物对和延伸引物一一对应，且对应的引物对和延伸引物用于检测同一位点的核苷酸。例如，第一引物对包括如SEQ_ID NO.1所示的核苷酸序列的
上游引物、如SEQ_ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ_ID NO.57所示的核苷酸
序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第二引物对包括如SEQ_ID NO.3
所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ_ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ_ID
NO.58所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第三引物对
包括如SEQ_ID NO.5所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ_ID NO.6所示的核苷酸序列的下
游引物和如SEQ_ID NO.59所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的
核苷酸等。
上游引物、如SEQ_ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ_ID NO.57所示的核苷酸
序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第二引物对包括如SEQ_ID NO.3
所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ_ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ_ID
NO.58所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第三引物对
包括如SEQ_ID NO.5所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ_ID NO.6所示的核苷酸序列的下
游引物和如SEQ_ID NO.59所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的
核苷酸等。
[0068] 可以理解的是，引物对及延伸引物的编号与上述SNP位点的顺序对应，即第一引物对及第一延伸引物对应检测rs956666801位点，第二引物对及第二延伸引物对应检测
rs80338942位点，第三引物对及第三延伸引物对应检测rs80338943位点。
rs80338942位点，第三引物对及第三延伸引物对应检测rs80338943位点。
[0069] 根据本发明的第二方面，本发明还提供了上述的用于遗传性耳聋检测相关SNP位点的引物组在制备遗传性耳聋检测产品中的应用。
[0070] 根据本发明的第三方面，提供了一种用于遗传性耳聋检测的组合物/产品/试剂盒，所述组合物/产品/试剂盒包括上述的引物组。
[0071] 该组合物/产品/试剂盒能够对与检测遗传性耳聋相关的位点突变实现特异性检测，检测成本低、周期短、操作简单且准确度高，具有极大的临床应用价值及非常开阔的市
场推广前景。
场推广前景。
[0072] 在一些优选的实施方式中，用于检测遗传性耳聋的组合物/产品/试剂盒还包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备。
[0073] 可以理解的是，所述用于检测SNP位点的试剂和/或设备可以是可通过市售购得的、本领域用于检测SNP位点核苷酸的常规通用试剂和/或设备，例如，可以是用于检测SNP
位点核苷酸的试剂或试剂盒，或者为用于检测SNP位点核苷酸的包括试剂的试剂盒。
位点核苷酸的试剂或试剂盒，或者为用于检测SNP位点核苷酸的包括试剂的试剂盒。
[0074] 在一些优选的实施方式中，所述试剂包括10×PCR Buffer、dNTP Mix、MgCl2、Primer Mix、PCR Enzyme和超纯水等；
[0075] 优选地，所述设备包括应用MassARRAY对SNP位点核苷酸进行检测的设备，优选地，所述设备包括MassARRAY CPM。
[0076] 另外，本发明还提供了一种检测遗传性耳聋相关SNP位点的方法，所述方法包括应用上述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸进行检测。
[0077] 该方法应用本发明提供的引物组能够对先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋等常见的4大类遗传性耳聋相关的8个遗传性耳聋相关基因的28个SNP位
点进行检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信
介入等特点。
点进行检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信
介入等特点。
[0078] 可以理解的是，本发明可以对待测样品的全基因组进行检测，也可以筛选特定基因进行检测(例如对rs111033367、rs372347027、rs375668376、rs397518039、rs369522997、
rs111033199、rs111033242、rs111033220、rs111033313、rs145254330、rs786204730、
rs104894408、rs72474224、rs80338942、rs80338943、rs104894396、rs35887622、
rs80338939、rs267606617、rs267606618、rs267606619、rs28937588、rs956666801和
rs28938175、rs876657754、rs777465132、rs201895089、rs727504567特定的基因进行检
测)，当对特定的基因进行检测时，干扰更小，检测结果更加精确。
rs111033199、rs111033242、rs111033220、rs111033313、rs145254330、rs786204730、
rs104894408、rs72474224、rs80338942、rs80338943、rs104894396、rs35887622、
rs80338939、rs267606617、rs267606618、rs267606619、rs28937588、rs956666801和
rs28938175、rs876657754、rs777465132、rs201895089、rs727504567特定的基因进行检
测)，当对特定的基因进行检测时，干扰更小，检测结果更加精确。
[0079] 在一些优选的实施方式中，应用上述的引物组对待测样品基因组进行PCR扩增和碱基延伸反应，然后应用MassARRAY系统对反应得到的产物进行检测，确定所述待测样品基
因组中SNP位点的核苷酸。
因组中SNP位点的核苷酸。
[0080] MassARRAY基因分析技术基于MALDT‑TOF飞行时间质谱技术，先通过PCR扩增目标序列，然后根据需要加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上进行单个碱基的延伸。该技术
应用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，能够有效将仅有一个不同碱基的两段基因序
列区别开，进而推测出SNP分型。
应用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，能够有效将仅有一个不同碱基的两段基因序
列区别开，进而推测出SNP分型。
[0081] 在本发明的优选实施方式中采用MassARRAY系统进行检测，实现了运用单一平台对多基因位点的检测方法，极大的提高了检测效率，特别适用于批量检测，为遗传性耳聋筛
查提供了参考。并且，所需样本的适应性强，外周血和干血斑均能较好的检出。
查提供了参考。并且，所需样本的适应性强，外周血和干血斑均能较好的检出。
[0082] 本领域可以理解，所述方法还可以包括在碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤。具体地，使用虾碱性磷酸酶对PCR产物进行去磷酸化。
[0083] 优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应后对所述反应产物进行纯化的步骤，然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。具体地，可使用树脂盐脱的方式对反应产物进行纯
化。
化。
[0084] 在一些优选的实施方式中，将所述引物组分为如下2组：
[0085] 第一组包括检测rs956666801、rs80338942、rs80338943、rs876657754、rs375668376、rs111033367、rs267606618、rs397518039、rs267606619、rs111033242、
rs777465132、rs111033199、rs72474224、rs372347027、rs28937588、rs267606617和
rs104894408的引物组。
rs777465132、rs111033199、rs72474224、rs372347027、rs28937588、rs267606617和
rs104894408的引物组。
[0086] 第二组包括检测rs28938175、rs111033220、rs145254330、rs201895089、rs80338939、rs104894396、rs35887622、rs727504567、rs369522997、rs786204730和
rs111033313的引物组；
rs111033313的引物组；
[0087] 该分组综合考虑到延伸引物大小等因素，保证了每组内引物间互相无干扰。
[0088] 本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述的附图和实施例只是为了例证本发明的特定实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。
[0089] 本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
[0090]
[0091]
[0092] 本发明实施例中用到的主要仪器信息如下：
[0093]
[0094] 实施例1检测位点的论证与筛选
[0095] 虽然现有技术中已公开与耳聋检测相关的位点，但选择或组合真正具有临床意义且筛查有效性的位点并不容易。本发明的待测位点选择需具备：1)位点的突变型可产生明
确的致病作用；2)突变型具有中国人群的检测意义，在中国耳聋患者中高频携带。本发明参
考了ACMG、ExAC，1000Genomes，dbSNP，ClinVar，HGMD等数据库，初步筛选了具有中国耳聋患
者高频携带的致病位点。
确的致病作用；2)突变型具有中国人群的检测意义，在中国耳聋患者中高频携带。本发明参
考了ACMG、ExAC，1000Genomes，dbSNP，ClinVar，HGMD等数据库，初步筛选了具有中国耳聋患
者高频携带的致病位点。
[0096] 本发明随后通过医学端验证，确立了涵盖已得到临床认可的“致病性”“疑似致病性”的位点，同时补充了药物致聋致病证据等级较高的线粒体位点，位点设置更具筛查检测
意义，临床有效性，阳性检出对预后、临床治疗、生活指导更具提示作用。例如：KCNQ4是一种
与常染色体显性耳聋2A型相关的显性致病基因，突变携带者可在出生时听力筛查正常，随
着年龄增长在成年后可发展为全频率重度‑极重度听力损失。目前该基因热点位点与疾病
的相关性已得到验证，致病证据充足，具有较强检测意义。同时，常见panel中部分基因致病
性被证明支持证据不足，如经过长期临床检测，常见检测中GJB3基因的临床致病作用证据
力并未得到充分验证，尚不具备广泛筛查意义。
意义，临床有效性，阳性检出对预后、临床治疗、生活指导更具提示作用。例如：KCNQ4是一种
与常染色体显性耳聋2A型相关的显性致病基因，突变携带者可在出生时听力筛查正常，随
着年龄增长在成年后可发展为全频率重度‑极重度听力损失。目前该基因热点位点与疾病
的相关性已得到验证，致病证据充足，具有较强检测意义。同时，常见panel中部分基因致病
性被证明支持证据不足，如经过长期临床检测，常见检测中GJB3基因的临床致病作用证据
力并未得到充分验证，尚不具备广泛筛查意义。
[0097] 同时，兼顾检测和筛查的有效性，本发明通过大样本测试筛选，最终获得能够实现对点突变、缺失突变以及线粒体点突变三种突变类型样本进行准确分型的位点。这些位点
覆盖了先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋等常见的4大类遗传性耳
聋突变位点，可检测6种遗传性耳聋疾病，包括Usher综合征2A型、大前庭水管综合征、常染
色体隐性耳聋1A型、氨基糖苷类药物诱导性耳聋、常染色体显性耳聋2A型与常染色体显性
耳聋9型，为遗传性耳聋筛查提供科学参考。具体的基因和位点见下表：
覆盖了先天性耳聋、迟发性耳聋、综合征性耳聋和药物敏感性耳聋等常见的4大类遗传性耳
聋突变位点，可检测6种遗传性耳聋疾病，包括Usher综合征2A型、大前庭水管综合征、常染
色体隐性耳聋1A型、氨基糖苷类药物诱导性耳聋、常染色体显性耳聋2A型与常染色体显性
耳聋9型，为遗传性耳聋筛查提供科学参考。具体的基因和位点见下表：
[0098] 表1各位点基因型对应表
[0099] 位点/variant 基因/gene 基因型 位点/variant 基因/gene 基因型rs111033367 USH2A CT/Del rs72474224 GJB2 G/T/A
rs372347027 USH2A A/G rs80338942 GJB2 T/Del
rs375668376 USH2A G/A rs80338943 GJB2 C/Del
rs397518039 USH2A A/G rs104894396 GJB2 G/A
rs369522997 USH2A A/C rs35887622 GJB2 T/C/G
rs111033199 SLC26A4 G/T rs80338939 GJB2 G/Del
rs111033242 SLC26A4 C/G rs267606617 MT‑ND1 A/G
rs111033220 SLC26A4 C/T rs267606618 MT‑ND1 T/C
rs111033313 SLC26A4 A/G rs267606619 MT‑ND1 C/T
rs145254330 SLC26A4 C/T rs28937588 KCNQ4 G/T/A
rs786204730 SLC26A4 Del/T rs956666801 KCNQ4 G/C
rs104894408 GJB2 C/G/T rs28938175 COCH C/T
rs876657754 CDH23 A/G rs201895089 GJB2 T/G
rs777465132 USH2A G/T rs727504567 MYO6 C/T
rs372347027 USH2A A/G rs80338942 GJB2 T/Del
rs375668376 USH2A G/A rs80338943 GJB2 C/Del
rs397518039 USH2A A/G rs104894396 GJB2 G/A
rs369522997 USH2A A/C rs35887622 GJB2 T/C/G
rs111033199 SLC26A4 G/T rs80338939 GJB2 G/Del
rs111033242 SLC26A4 C/G rs267606617 MT‑ND1 A/G
rs111033220 SLC26A4 C/T rs267606618 MT‑ND1 T/C
rs111033313 SLC26A4 A/G rs267606619 MT‑ND1 C/T
rs145254330 SLC26A4 C/T rs28937588 KCNQ4 G/T/A
rs786204730 SLC26A4 Del/T rs956666801 KCNQ4 G/C
rs104894408 GJB2 C/G/T rs28938175 COCH C/T
rs876657754 CDH23 A/G rs201895089 GJB2 T/G
rs777465132 USH2A G/T rs727504567 MYO6 C/T
[0100] 检测位点及遗传性耳聋疾病的对应关系如下表2所示：
[0101] 表2检测位点及对应的遗传性耳聋疾病
[0102]
[0103]
[0104] 实施例2引物的设计以及反应体系的建立
[0105] 鉴于MassARRAY检测是一种基于多重PCR扩增的反应，引物组合必须避免交叉扩增、偏好性扩增和非特异性等问题(D.van den Boom et al./International Journal of
Mass Spectrometry，238(2004)，173–188)，因此该反应体系的引物设计需经一定量的优化
获得。
Mass Spectrometry，238(2004)，173–188)，因此该反应体系的引物设计需经一定量的优化
获得。
[0106] 首先，本发明通过MassARRAY网址的引物设计软件(Assay Design Suite)，调整相关参数，完成28个位点的PCR和UEP的引物的初步设计，导出设计好的引物及各参数文件，并
合成引物。按照引物配置表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX，并微调延伸引物MIX直至符合
要求。然后进行引物测试和优化。具体步骤如下：
合成引物。按照引物配置表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX，并微调延伸引物MIX直至符合
要求。然后进行引物测试和优化。具体步骤如下：
[0107] 将基因组DNA样本稀释至10ng/μL，按下表配制PCR反应MIX(以下为单个样本量)
[0108] 表3 PCR反应体系
[0109]
[0110] 封膜，2272g离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：
[0111] 表4
[0112]
[0113] (1)虾碱性磷酸酶消化(SAP)
[0114] 取出PCR板，2272g离心1分钟，按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量)：
[0115] 表5 SAP反应体系
[0116]
[0117] 每个反应孔加2μL SAP混液，封膜，2272g离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：
[0118] 表6
[0119] 温度(℃) 时间37 40min
85 5min
10 保温
85 5min
10 保温
[0120] (2)单碱基延伸(EXT)
[0121] 取出PCR板，2272g离心1分钟，按下表配制EXT反应体系，其中Extend Primer Mix为两组位点不同的延伸引物混液(以下为单个样本量)：
[0122] 表7 EXT反应体系
[0123]
[0124] 每个反应孔加入2μL延伸混液，封膜，2272g离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：
[0125] 表8
[0126]
[0127] (3)树脂脱盐
[0128] ①把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上，风干最少10分钟；
[0129] ②样本板取出，板式离心机2272g离心1分钟；
[0130] ③样本板每一个有样本的孔里加入16μL水，封板；
[0131] ⑤轻轻将样本板凌空翻转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起翻转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里；
[0132] ⑦2272g离心5分钟。
[0133] (4)Dispensing点样
[0134] 使用MassARRAY CPM将样本点到对应的SpectroCHIP(芯片)上。
[0135] (5)MALDI‑TOF
[0136] 使用MALDI‑TOF(基质辅助激光解吸电离‑飞行时间)质谱仪获得数据。
[0137] 应当指出的是，MassARRAY检测的特殊性在于，需要先通过PCR反应扩增出含有目标SNP位点的片段，再通过延伸引物延伸出SNP位点的碱基，通过其产物的分子量判断其SNP
位点信息。本发明可在一个反应体系中检测出多种SNP位点信息，这需要各SNP位点的PCR反
应、延伸反应间不能有明显的干扰。
位点信息。本发明可在一个反应体系中检测出多种SNP位点信息，这需要各SNP位点的PCR反
应、延伸反应间不能有明显的干扰。
[0138] 靶向区域调整、UEP引物方向调整：以rs35887622和rs786204730位点引物优化为例：
[0139] rs35887622位点出现no call，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGACAAAGTCGGCCTGCTCATC，更改前下游引物序列为：
ACGTTGGATGGCATTGGAAAGATCTGGCTC)和更改UEP引物(更改前UEP序列为：
gCCTCTTCATTTTTCGCATTA)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测
试效果更好，no call现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现no call，更改引物前的
具体的聚类峰图如图1所示，更改引物后的具体的聚类峰图如图2所示。从图中可以看出更
改引物前的聚类均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改
后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。
ACGTTGGATGGCATTGGAAAGATCTGGCTC)和更改UEP引物(更改前UEP序列为：
gCCTCTTCATTTTTCGCATTA)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测
试效果更好，no call现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现no call，更改引物前的
具体的聚类峰图如图1所示，更改引物后的具体的聚类峰图如图2所示。从图中可以看出更
改引物前的聚类均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改
后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。
[0140] rs786204730位点出现出峰较低且有偏峰现象，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：)ACGTTGGATGGAGATATGTCTTGATGTTCC，更改前下游引物序列为：
ACGTTGGATGAGTTCCTGTCGGATATGGTC)和更改UEP引物方向(更改前UEP序列为：
GGTCTCTACTCTGCTTTTTT)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测试
效果更好，出峰较低现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现出峰较低且有偏峰现象，
优化之前引物前位点峰图如图3所示，更改引物优化后的位点峰图如图4所示。从图中可以
看出更改引物前的位点出峰较低且有偏峰现象，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基
因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。
ACGTTGGATGAGTTCCTGTCGGATATGGTC)和更改UEP引物方向(更改前UEP序列为：
GGTCTCTACTCTGCTTTTTT)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测试
效果更好，出峰较低现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现出峰较低且有偏峰现象，
优化之前引物前位点峰图如图3所示，更改引物优化后的位点峰图如图4所示。从图中可以
看出更改引物前的位点出峰较低且有偏峰现象，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基
因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。
[0141] 引物间并孔调整：以rs267606617、rs267606618、rs267606619位点优化引物为例。
[0142] rs267606617、rs267606618、rs267606619位点在并孔之前，rs267606619、rs267606618在well1中，rs267606617在well2中；优化调整之后全部在well1中，实现单孔
检测氨基糖苷类药物诱导性耳聋位点。通过对40例样本进行聚类，rs267606617位点聚类图
5、rs267606618位点聚类图6和rs267606619位点聚类图7，可以看出并孔后符合本项目要
求。
检测氨基糖苷类药物诱导性耳聋位点。通过对40例样本进行聚类，rs267606617位点聚类图
5、rs267606618位点聚类图6和rs267606619位点聚类图7，可以看出并孔后符合本项目要
求。
[0143] 综上，获得了最优PCR扩增引物及单碱基延伸(UEP)引物，具体引物序列参见表7和8的引物序列。
[0144] 表9 PCR引物序列
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150] 表10 UEP引物序列
[0151]
[0152]
[0153] 实施例3反应体系的验证
[0154] 本发明在确认最优反应体系后又进行了一系列的验证实验，包括准确性、精密度以及人员比对和不同批次引物间的比对实验。具体的验证方案如下：
[0155] (1)准确性实验验证方案：28个位点各选取一例样本进行Sanger测序，并比对sanger测序与MassARRAY的结果。
[0156] 由于耳聋突变为临床非常少见突变类型，临床样本收集极其困难，故合成质粒线粒体突变和基因组突变两种类型的质粒，分别包含位点：rs267606617、rs267606618、
rs267606619和rs956666801。使用鱼精DNA与两种类型质粒混合，混合成的9例质粒样本进
行比对验证(质粒合成都经过Sanger测序验证)，比对sanger测序与MassARRAY的结果，一致
性大于95％则验证通过。
rs267606619和rs956666801。使用鱼精DNA与两种类型质粒混合，混合成的9例质粒样本进
行比对验证(质粒合成都经过Sanger测序验证)，比对sanger测序与MassARRAY的结果，一致
性大于95％则验证通过。
[0157] (2)精密度实验验证方案：挑取同一患者3例外周血样本和3例干血斑样本，每个样本重复3次进行一个批次的检测，共检测5个批次，6例样本15次重复结果一致性100％，批间
精密度和批内精密度的一致性大于95％则验证通过。
精密度和批内精密度的一致性大于95％则验证通过。
[0158] (3)人员比对和试剂比对实验验证方案：上述(2)中配制两个批次的引物(批次A和批次B)，操作员甲使用引物批次A检测批次1和批次2，使用引物批次B检测批次4，操作员乙
使用引物批次A检测批次3，使用引物批次B检测批次5，比较人员和试剂间的结果，一致性大
于95％则验证通过。
使用引物批次A检测批次3，使用引物批次B检测批次5，比较人员和试剂间的结果，一致性大
于95％则验证通过。
[0159] 具体的验证过程如下：首先按照本发明实施例1提供的体系加量表配制两个批次的扩增引物MIX和延伸引物MIX，分别命名为批次A和批次B。然后按照实施例1中的操作步
骤，分别进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶消耗、单碱基延伸、树脂脱盐和MassARRAY CPM点样分
析等步骤后进行结果分析。准确性和精密度结果见下表。
骤，分别进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶消耗、单碱基延伸、树脂脱盐和MassARRAY CPM点样分
析等步骤后进行结果分析。准确性和精密度结果见下表。
[0160] 表11准确性的验证结果1
[0161]
[0162] 表12准确性的验证结果2
[0163]
[0164]
[0165] 经28例样本和9例混合质粒的MassARRAY结果和Sanger结果的比对可知，本发明的体系验证实验的准确性为100％。另外，因本发明检测位点较多，故选取经Sanger测序，包含
点突变，缺失突变以及线粒体点突变三种类型的5个位点rs267606617、rs267606618、
rs267606619、rs956666801和rs80338943进行展示，上述5个位点的聚类图分别如图5、图6、
图7、图8和图9所示。从上述附图结果中同样可以得出，本发明的准确性为100％。
点突变，缺失突变以及线粒体点突变三种类型的5个位点rs267606617、rs267606618、
rs267606619、rs956666801和rs80338943进行展示，上述5个位点的聚类图分别如图5、图6、
图7、图8和图9所示。从上述附图结果中同样可以得出，本发明的准确性为100％。
[0166] 表13精密度的验证结果
[0167]
[0168]
[0169] 经3例外周血样本和对应3例干血斑样本的5个批次的检测结果比对，可知本发明体系的批间精密度、批内精密度以及人员间比对和试剂间比对的一致性均为100％。
[0170] 实施例4室间质评试验
[0171] 本发明选取部分位点参与欧盟室间质评，具体的参与了2020年EMQN的遗传性耳聋GJB2基因8个位点检测上报，位点名称为：rs72474224、rs35887622、rs104894408、
rs80338939、rs80338942、rs104894396、rs80338943和rs201895089，以上8个位点的聚类图
分别如图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16和图17所示，该结果通过了欧盟的室间质
评，证实了本发明的有效性、准确性及权威性。
rs80338939、rs80338942、rs104894396、rs80338943和rs201895089，以上8个位点的聚类图
分别如图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16和图17所示，该结果通过了欧盟的室间质
评，证实了本发明的有效性、准确性及权威性。
[0172] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。