抗人白介素23单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及抗人白介素23(hIL‑23)单克隆抗体及其应用。本发明的抗人白介素23(hIL‑23)单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3)和三个轻链互补决定区(CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3)，其中，(a)CDR‑H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；(b)CDR‑H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；(c)CDR‑H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(d)CDR‑L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；(e)CDR‑L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且(f)CDR‑L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。所述的抗人白介素23(hIL‑23)单克隆抗体，其与现有的抗人白介素23单克隆抗体(Guselkumab和Risankizumab)相比，结合hIL‑23的亲和力相当，但在细胞水平的拮抗活性优于Guselkumab，而与Risankizumab相当，有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。

权利要求

1.一种分离的抗人白介素23单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和三个轻链互补决定区即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：(a)CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(b)CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(c)CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(d)CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(e)CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且(f)CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；且，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1或2所述的单克隆抗体。

4.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸。

5.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求4所述的宿主细胞从而生产根据权利要求1或2所述的单克隆抗体。

6.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

说明书

抗人白介素23单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及抗体药物领域。具体地，本发明涉及针对人白介素23(hIL-23)的单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] IL-23主要由活化的树突状细胞、巨噬细胞及单核细胞等产生，是IL-12异源二聚体细胞因子家族成员，主要由IL-23p19和IL-12/IL-23p40两个亚基组成。IL-23受体包括IL-12受体β1和IL-23受体2个亚基，IL-23通过与T细胞、NK细胞、单核巨噬细胞/树突状细胞表面表达受体IL-23R以及IL-12Rβ1作用，激活下游信号通路发挥生物学功能。IL-23主要作用于Th17细胞，诱导其产生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等促炎细胞因子，在银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化、克罗恩病、炎症性肠病等自身免疫和炎症性疾病中发挥重要作用。

[0003] IL-23介导的信号转导及生物学效应与多种类型的疾病相关，包括类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发病的幼年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、胃溃疡、炎性肠病、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳氏肉芽肿、过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、成人呼吸窘迫综合征、过敏性接触性皮炎、白癜风、牛皮癣、斑秃、天胞疮、硬皮病、过敏性/特应性结膜炎、过敏性肺炎、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、格雷夫斯氏病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、重症肌无力、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭等。

[0004] 强生公司、艾伯维公司研发的靶向IL-23的单克隆抗体药物Guselkumab(商品名Tremfya)、Risankizumab(商品名SKYRIZI)已经被美国FDA批准治疗银屑病、银屑病关节炎，以及开展克罗恩病、炎性肠病的III期临床研究。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种新的抗人白介素23(hIL-23)单克隆抗体、包含该单克隆抗体的药物组合物以及该单克隆抗体的制药用途。

[0006] 即，本发明包括：

[0007] 1.一种分离的抗人白介素23单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，其中：

[0008] (a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(NHEMS)所示；

[0009] (b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(IITTSDTTYYATWAKG)所示；

[0010] (c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(VDIVLLSVTSRI)所示；

[0011] (d)CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASQSVSTYLS)所示；

[0012] (e)CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(GASNLES)所示；且

[0013] (f)CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QSGYVFAGLT)所示。

[0014] 2.根据项1所述的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，[0015] 所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列为[0016] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNHEMSWVRQAPGKGLEWIGIITTSDTTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVDIVLLSVTSRIWGQGTLVTVSS；且，

[0017] 所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列为[0018] DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSTYLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSGYVFAGLTFGGGTKVEIK。

[0019] 3.一种分离的核酸，其编码前述任一单克隆抗体。

[0020] 4.一种宿主细胞，其包含根据项3所述的核酸。

[0021] 所述核酸可以存在于载体上。载体可以属于任意类型，例如，重组载体诸如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

[0022] 5.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据项4所述的宿主细胞从而生产前述任一单克隆抗体。

[0023] 所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗人白介素23单克隆抗体的重组载体，从而生产所述单克隆抗体。在某些实施方案中，所述方法包括培养包含编码所述抗人白介素23单克隆抗体的核酸的宿主细胞，从而表达所述核酸。所述方法可以进一步包括从宿主细胞培养物或宿主细胞培养基回收所述抗人白介素23单克隆抗体。

[0024] 6.一种药物组合物，其包含前述任一单克隆抗体和药学上可接受的载体。

[0025] 所述药物组合物可以进一步包含另外的治疗剂(例如，不同的抗人白介素23(hIL-23)抗体)。

[0026] 7.根据项6所述的药物组合物，其用于治疗IL-23介导的信号转导相关的疾病。

[0027] 8.根据项7所述的药物组合物，其中，所述IL-23介导的信号转导相关的疾病为类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发病的幼年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、胃溃疡、炎性肠病、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳氏肉芽肿、过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、成人呼吸窘迫综合征、过敏性接触性皮炎、白癜风、牛皮癣、斑秃、天胞疮、硬皮病、过敏性结膜炎、过敏性肺炎、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、格雷夫斯氏病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、重症肌无力、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎和/或急性肾衰竭。

[0028] 9.前述任一单克隆抗体在制备用于治疗IL-23介导的信号转导相关的疾病的药物中的用途。

[0029] 10.根据项9所述的用途，其中，所述IL-23介导的信号转导相关的疾病为类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发病的幼年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、胃溃疡、炎性肠病、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳氏肉芽肿、过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、成人呼吸窘迫综合征、过敏性接触性皮炎、白癜风、牛皮癣、斑秃、天胞疮、硬皮病、过敏性结膜炎、过敏性肺炎、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、格雷夫斯氏病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、重症肌无力、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎和/或急性肾衰竭。

[0030] 11.一种治疗IL-23介导的信号转导相关的疾病的方法，其包括：

[0031] 向有此需要的受试者给药根据前述任一项所述的单克隆抗体或根据前述任一项所述的药物组合物。

[0032] 12.根据项11所述的方法，其中，所述IL-23介导的信号转导相关的疾病为类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发病的幼年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、胃溃疡、炎性肠病、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳氏肉芽肿、过敏性/特异性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、成人呼吸窘迫综合征、过敏性接触性皮炎、白癜风、牛皮癣、斑秃、天胞疮、硬皮病、过敏性结膜炎、过敏性肺炎、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、格雷夫斯氏病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、重症肌无力、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎和/或急性肾衰竭。

[0033] 13.根据项12所述的方法，其中，所述系统性血管炎为韦格纳氏肉芽肿。

[0034] 发明的效果

[0035] 本发明提供了一种新的抗人白介素23(hIL-23)单克隆抗体，其与现有的抗人白介素23单克隆抗体(Guselkumab和Risankizumab)相比，结合hIL-23的亲和力相当，但在细胞水平的拮抗活性优于Guselkumab，而与Risankizumab相当。

[0036] 需要说明的是，Risankizumab 已先后在日本、美国和欧盟获批上市，且临床试验结果显示，其在中度至重度斑块型银屑病方面的治疗效果优于强生重磅抗炎药(ustekinumab)以及艾伯维畅销抗炎药 (adalimumab)。

[0037] 本发明的单克隆抗体在细胞水平显示出与Risankizumab相当的拮抗活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。

附图说明

[0038] 图1是显示构建QX004N(HZD90-32)瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。其中，M：Marker；条带1：PCR产物90VH-Hu18；条带2：pHZDCH，HindIII/NheI；条带3：PCR产物90VK-Hu9；条带4：pHZDCK，HindIII/BsiWI。

[0039] 图2是瞬转表达流程图。

[0040] 图3是QX004N(HZD90-32)的电泳检测图。

[0041] 图4是显示QX004N(HZD90-32)、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的HEK TMBlue  IL-23细胞中STAT3磷酸化活性图。

[0042] 图5是显示QX004N(HZD90-32)、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性图。

[0043] 图6是显示QX004N(HZD90-32)、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性图。

[0044] 图7是显示QX004N(HZD90-32)、Guselkumab和Risankizumab结合IL-23p19亚基特异性检测图。

具体实施方式

[0045] 本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。

[0046] 一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。

[0047] 在本说明书中，“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

[0048] 在本说明书中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。

[0049] 在本说明书中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。

[0050] 在本说明书中，人白介素23(Human interleukin 23，hIL-23)表示一种源自人的蛋白，由p19和p40两个亚基组成的异源二聚体。p19氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，p40氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中，下划线部分表示信号肽。

[0051] SEQ ID NO：9：

[0052] MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP

[0053] SEQ ID NO：10：

[0054] MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

[0055] 在本说明书中，“抗人白介素23单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人白介素23，使得所述单克隆抗体可用作靶向人白介素23的诊断剂和/或治疗剂。

[0056] 本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人白介素23以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体与作为其靶标的人白介素23的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。

[0057] 本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体与其他动物种属的白介素23可以不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如恒河猴、食蟹猴、大鼠、小鼠等；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体与作为其靶标的人白介素23的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体与其他动物种属的白介素23的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。

[0058] 本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤40nM的平衡解离常数(KD)。

[0059] 实验结果显示，本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体可以特异性结合人白介素23(IL-23)的p19亚基。

[0060] 本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单抗产品相当、或优于上市同类单抗产品。所述生物活性例如抑制IL-23诱导的细胞中STAT3磷酸化的活性、抑制IL23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A的活性、抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性。

[0061] 在一个实施方式中，本发明的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

[0062] SEQ ID NO：11

[0063] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNHEMSWVRQAPGKGLEWIGIITTSDTTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVDIVLLSVTSRIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[0064] SEQ ID NO：12

[0065] DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSTYLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSGYVFAGLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[0066] 其中，SEQ ID NO：11和12均为经人源化的序列。

[0067] 在本说明书中，“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。

[0068] 在本说明书中，“分离的编码抗人白介素23单克隆抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。

[0069] 在本说明书中，“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。

[0070] 在本说明书中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。

[0071] 在本说明书中，“药物组合物”表示这样的制品：其呈现使得包含在其中的活性成分的生物活性能够发挥效果的形式，并且所述组合物不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。

[0072] 在本说明书中，“药学上可接受的载体”表示药物组合物中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

[0073] 实施例

[0074] 以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解的是，本发明不限于这些实施例。

[0075] 实施例1抗人白介素23单克隆抗体QX004N的制备

[0076] 从上海近岸科技有限公司采购人白介素23(IL-23)，用于免疫新西兰兔，运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合IL-23并具有IL-23抑制活性的单克隆抗体。首先，用Binding ELISA检测细胞上清，挑选出与IL-23结合的克隆；再用Blocking ELISA进行检测，挑选出具有IL-23抑制活性的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。

[0077] 挑选出5个克隆进行重组表达，并测序。对90#克隆进行人源化改造。利用NCBI IgBlast进行人IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将90#克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQ ID No:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-39*01作为轻链CDR移植模板，将90#克隆轻链的CDR区(即CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ ID No:6))移植入IGKV1-39*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，将重链CDR-H3中第103位甲硫氨酸(Met，M)突变亮氨酸(Leu，L)，获得本发明的单克隆抗体QX004N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

[0078] 上述重链可变区(SEQ ID NO：7)的基因利用PCR扩增获得；轻链可变区(SEQ ID NO：8)的基因利用PCR扩增获得。用HindIII和NheI双酶切重链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pHZDCK；用Infusion重组酶将PCR扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒pHZDCH-90VH-Hu18和轻链表达质粒pHZDCK-90VK-Hu9。

[0079] 通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链可变区PCR扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，轻链可变区约438bp，重链可变区约459bp。

[0080] 将序列正确的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成66
×10个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。

[0081] 转染后第4-8天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX004N(HZD90-32)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和
25kDa，与重链(49.1kDa)和轻链(23.1kDa)理论分子量一致。

[0082] 实施例2平衡解离常数(KD)的测定

[0083] 用BiacoreT200检测QX004N(HZD90-32)与IL-23的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。

[0084] 除此之外，将QX004N(HZD90-32)与目前已经商业化的针对IL-23的单克隆抗体，即Guselkumab和Risankizumab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX004N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中Guselkumab和Risankizumab通过购买市售的药品获得。

[0085] 表1抗体结合人IL-23的亲和力

[0086] 样品名称 ka(105M-1S-1) kd(10-5S-1) KD(10-10M)Guselkumab 5.01 3.19 0.63
Risankizumab 7.06 3.70 0.52
QX004N(HZD90-32) 3.66 3.50 1.01

[0087] 表中的数据为：每个样品检测两次，计算平均值的数据。

[0088] 实施例3QX004N、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的HEKBlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸化活性

[0089] 利用HEK BlueTM  IL-23细胞报告基因细胞系测定QX004N、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23介导的胞内信号分子STAT3磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4
4×10 个细胞加入到96孔板内，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中培养过夜。将IL-23稀释至
1ng/ml，将抗体稀释至浓度范围为0至2μg/ml的系列稀释液，IL-23与梯度稀释的抗体等体积混合，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育1.5小时。然后将混合液加入到细胞中，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中培养24小时，收集细胞培养上清加入10％的QUANTI-BlueTM检测试剂在37℃反应1小时，然后检测OD630nm值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的中和活性，剂量效应曲线如图4所示。

[0090] 图4所示的结果显示，QX004N能够抑制IL-23诱导的HEK BlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸化活性，其IC50为3.21ng/ml；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的HEK BlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸化活性，其IC50分别为6.18ng/ml和3.51ng/ml，说明QX004N抑制IL-23诱导的信号转导活性与目前已经商业化的针对IL-23的单克隆抗体即Risankizumab的活性相当，并优于Guselkumab。

[0091] 实施例4QX004N、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性

[0092] 利用小鼠脾脏细胞测定QX004N、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的IL-17A释放活性：从小鼠脾脏中获取原代小鼠脾脏细胞，将培养液中的细胞以每孔5×105个细胞加入到96孔板内。将IL-23稀释至10ng/ml，将抗体稀释至浓度范围为0至20μg/ml的系列稀释液，IL-23与梯度稀释的抗体等体积混合，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育1.5小时。
然后将混合液加入到细胞中，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中培养48小时，收集细胞培养上清用ELISA Kit检测IL-17A的表达量并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的中和活性，剂量效应曲线如图5所示。

[0093] 图5所示的结果显示，QX004N能够抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，其IC50为11.7ng/ml；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，其IC50分别为13.5ng/ml和8.43ng/ml，说明QX004N抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性较强，其与现有的商业化产品(Guselkumab和Risankizumab)的能力相当。

[0094] 实施例5QX004N、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性

[0095] 利用人NK细胞测定QX004N、Guselkumab和Risankizumab抑制IL-23诱导的IFN-γ释放活性：利用密度梯度离心法从健康志愿者外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMC)，然后用磁珠分选法从PBMC中分选出自然杀伤细胞(NK细胞)，加入100U/ml IL-2于CO2培养箱(37℃、5％CO2)中活化培养3天。在培养液中加入20ng/ml的IL-18，然后将培养液中的细胞以每孔1×105个细胞加入到96孔板内。将IL-23稀释至10ng/ml，将抗体稀释至浓度范围为0至5μg/ml的系列稀释液，IL-23与梯度稀释的抗体等体积混合，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中孵育1.5小时。然后将混合液加入到细胞中，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中培养48小时，收集细胞培养上清用ELISA Kit检测IFN-γ的表达量并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的中和活性，剂量效应曲线如图6所示。

[0096] 图6所示的结果显示，QX004N能够抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性，其IC50为10.4ng/ml；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性，其IC50分别为16.8ng/ml和11.1ng/ml，说明QX004N抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性强于目前已经商业化的产品Guselkumab，并与Risankizumab的活性相当。

[0097] 由上述实施例3～5可知，在测定的三项细胞水平生物活性方面，QX004N优于Guselkumab，而与Risankizumab难分伯仲。鉴于Risankizumab 已在临床试验中被证实对中度至重度斑块型银屑病的治疗效果显著，QX004N亦有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。

[0098] 实施例6QX004N、Guselkumab和Risankizumab结合IL-23p19亚基特异性检测[0099] 利用Binding ELISA的方法测定QX004N、Guselkumab和Risankizumab与IL-23的p40亚基的结合情况。将IL-23-p40稀释至2μg/ml并加入到酶标板中，于4℃包被过夜。封闭后分别加入稀释至浓度范围为0至5μg/ml的系列抗体稀释液和Goat-anti-human IgG二抗孵育，最后加入底物显色，并加入终止液终止显色反应。终止完成后，将酶标板置于酶标仪中读取450nm处的吸收值(650nm处的吸收值作为参考)，并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的结合特异性，剂量效应曲线如图7所示。

[0100] 图7所示的结果显示，IL-23p40特异性抗体QX001S能够与p40亚基结合，QX004N以及Guselkumab和Risankizumab与IL-23的p40亚基不结合，表明QX004N、Guselkumab和Risankizumab是特异性与IL-23的p19亚基结合的。

[0101] 实施例7利用点突变研究QX004N与Risankizumab结合IL-23p19的差异

[0102] 通过PCR的方法，设计突变引物，分别构建了含5种单点突变的p19质粒，如表2所示。将p19突变质粒与p40质粒一起共转染293F细胞，制备含IL-23突变体的细胞上清。先用定量ELISA对细胞上清中的IL-23突变体进行蛋白浓度定量，然后用结合ELISA检测QX004N和Risankizumab与不同IL-23突变体的EC50值。

[0103] 利用Binding ELISA的方法对含有IL-23突变体的细胞上清进行浓度定量：将抗p40抗体稀释至2μg/ml并加入到酶标板中，于4℃包被过夜。封闭后加入稀释至浓度范围为0至50ng/ml的已知浓度的纯化IL-23，以及梯度稀释的含IL-23突变体的细胞上清孵育。然后分别加入Biotin标记的抗His抗体和SA-HRP孵育，最后加入底物显色，并加入终止液终止显色反应。终止完成后，将酶标板置于酶标仪中读取450nm处的吸收值(650nm处的吸收值作为参考)，绘制已知浓度的纯化IL-23的剂量效应曲线，作为标准曲线，然后根据标准曲线和IL-23突变体细胞上清的OD值，计算出IL-23突变体细胞上清的浓度。

[0104] 利用Binding ELISA的方法检测QX004N和Risankizumab与IL-23突变体的结合情况：将QX004N和Risankizumab分别稀释至1μg/ml并加入到酶标板中，于4℃包被过夜。封闭后加入稀释至浓度范围为0至0.5μg/ml的系列IL-23突变体细胞上清稀释液孵育。然后分别加入Biotin标记的抗His抗体和SA-HRP孵育，最后加入底物显色，并加入终止液终止显色反应。终止完成后，将酶标板置于酶标仪中读取450nm处的吸收值(650nm处的吸收值作为参考)，绘制剂量效应曲线，并计算EC50值。若IL-23突变体的EC50值比天然IL-23的大10倍以上，则表示突变对应的位点是抗体结合的表位，EC50的结果如表2所示。

[0105] 表2所示的结果显示，QX004N与Risankizumab结合IL-23p19的表位有差异，且W137是QX004N的关键表位。Jutta 和Yehudi Bloch等人分别证实了W137是IL-23p19结合IL-23受体(IL-23R)的关键位点之一。

[0106] 表2结合ELISA检测抗体结合不同IL-23突变体

[0107]

[0108]

[0109] N.D.表示结合弱，EC50值不准确。

[0110] 综上所述，本发明所述的单克隆抗体能够抑制STAT3磷酸化活性、能够抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性以及能够抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性，其抑制活性优于目前已经商业化的产品，即Guselkumab，并且与Risankizumab相当，对于IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，本发明所述的单克隆抗体抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性与Guselkumab和Risankizumab相当。

[0111] 本发明所述的单克隆抗体和目前商业化的产品(Guselkumab和Risankizumab)一样，能够特异性地与IL-23的p19亚基结合，但是，本发明所述的单克隆抗体与Guselkumab、Risankizumab结合IL-23p19的表位有差异，W137是本发明所述单克隆抗体的关键表位，但不是Guselkumab、Risankizumab的关键表位(Guselkumab的表位研究可以参见国际专利申请公开WO2007076524A2，Risankizumab的表位研究可以参见Sanjaya等,Selective targeting of the IL23pathway Generation and characterization of a novel high affinity humanized anti-IL23A antibody,mAbs,Volume 7,Issue 4,2015)。

[0112] 此外，由于Risankizumab 已先后在日本、美国和欧盟获批上市，且临床试验结果显示，其在中度至重度斑块型银屑病方面的治疗效果优于强生重磅抗炎药(ustekinumab)以及艾伯维畅销抗炎药 (adalimumab)，因此，本
发明所述的单克隆抗体有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。