一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用

摘要

本发明涉及一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用。具体地，本发明提供一种增强型融合蛋白。相比野生型基因编辑蛋白，本发明的增强型融合蛋白可用于基因治疗,并且基因治疗效果要优于野生型基因编辑蛋白。

权利要求

1.一种活性物质的用途，其特征在于，用于制备用于基因治疗的制剂，其中所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体，其中所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：C‑A‑L‑B    (I)B‑L‑A‑C    （I’）式中，

A为基因编辑蛋白，

B为DNA双链结合结构域，所述DNA双链结合结构域选自下组：HMG‑D、Sac7d、或其组合；

C为任选的碱基编辑器元件；

L为无或连接肽，

各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；

所述基因编辑蛋白选自下组：Cas9、Cas12a、或其组合；并且所述基因编辑蛋白选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、或其组合；所述连接肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO.:4‑7中任一所示的多肽。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂用于治疗包括以下一种或多种疾病：遗传性疾病、神经系统疾病、心脏系统疾病、眼科疾病、自身免疫性疾病、血友病、血液病、和/或癌症。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述遗传性疾病选自下组：肝脏代谢性疾病、β地中海贫血、心血管疾病、杜式肌肉营养不良症、高草酸症、或其组合。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肝脏代谢性疾病选自下组：家族性高胆固醇血症、血友病、苯丙酮尿症、络氨酸血症、高血氨症、或其组合。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述疾病包括细胞增殖性病症。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述细胞增殖性病症选自下组：肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌、卵巢癌、类风湿性关节炎、或其组合。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，当融合蛋白的结构如式I’所示时，C为无。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述碱基编辑器元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2或12所示。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA双链结合结构域为非序列特异性的DNA双链结合结构域。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA双链结合结构域来源于果蝇或古细菌。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述碱基编辑器元件包括胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶。

12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.: 8、9、13中任一所示的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂包括：(a) 融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体；所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：C‑A‑L‑B    (I)B‑L‑A‑C    （I’）式中，

A为基因编辑蛋白，

B为DNA双链结合结构域，所述DNA双链结合结构域选自下组：HMG‑D、Sac7d、或其组合；

C为任选的碱基编辑器元件；

L为无或连接肽，

各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；和(b) 药学上可接受的载体；

所述基因编辑蛋白选自下组：Cas9、Cas12a、或其组合；并且所述基因编辑蛋白选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、或其组合；所述连接肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO.:4‑7中任一所示的多肽。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述制剂还包括其他用于基因治疗的药物。

15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因治疗通过基因编辑进行基因治疗。

16.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因治疗通过基因编辑试剂进行基因治疗。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述基因编辑试剂包含融合蛋白，所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：C‑A‑L‑B    (I)B‑L‑A‑C    （I’）式中，

A为基因编辑蛋白，

B为DNA双链结合结构域，所述DNA双链结合结构域选自下组：HMG‑D、Sac7d、或其组合；

C为任选的碱基编辑器元件；

L为无或连接肽，

各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；

所述基因编辑蛋白选自下组：Cas9、Cas12a、或其组合；并且所述基因编辑蛋白选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、或其组合；所述连接肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO.:4‑7中任一所示的多肽。

18.一种药盒，其特征在于，包括：(a1) 第一容器，以及位于所述第一容器中的活性物质，或含有所述活性物质的药物，其中，所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体，其中所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：

C‑A‑L‑B    (I)B‑L‑A‑C    （I’）式中，

A为基因编辑蛋白，

B为DNA双链结合结构域，所述DNA双链结合结构域选自下组：HMG‑D、Sac7d、或其组合；

C为任选的碱基编辑器元件；

L为无或连接肽，

各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；

所述基因编辑蛋白选自下组：Cas9、Cas12a、或其组合；并且所述基因编辑蛋白选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、或其组合；所述连接肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO.:4‑7中任一所示的多肽；

并且，所述药盒还包括：

(a2) 第二容器，以及位于所述第二容器中的其他用于基因治疗的药物，或含有其他用于基因治疗的药物的药物。

19.一种药物组合物，其特征在于，包括：(a) 活性物质，所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体，其中所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：C‑A‑L‑B    (I)B‑L‑A‑C    （I’）式中，

A为基因编辑蛋白，

B为DNA双链结合结构域，所述DNA双链结合结构域选自下组：HMG‑D、Sac7d、或其组合；

C为任选的碱基编辑器元件；

L为无或连接肽，

各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；和(b) 药学上可接受的载体；

所述基因编辑蛋白选自下组：Cas9、Cas12a、或其组合；并且所述基因编辑蛋白选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、或其组合；所述连接肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO.:4‑7中任一所示的多肽；

并且所述药物组合物中还包括其他用于基因治疗的选自下组的药物：反义核苷酸药物、EDIT‑101药物、CTX001、或其组合。

说明书

一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用。

背景技术

[0002] 基因编辑技术是通过人为地实现双链DNA的断裂，利用双链DNA断裂的修复机制来实现基因操纵的一门技术。目前已有的基因编辑技术包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术，
其中以CRISPR/Cas9技术应用最为广泛。CRISPR/Csa9技术是来源于细菌或古细菌的一种获
得性免疫机制，利用一条单链向导RNA(sgRNA)和Csa9蛋白定向的在基因组特定位置产生
DNA双链断裂，进而通过内源的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)修复机制，来实现
目的基因的敲除或特定基因或片段的插入。

[0003] CRISPR/Cas9技术虽然有着无比强大的功能，但也有其缺点，如：1.脱靶问题；2.PAM的限制导致靶点选择的有限性；3.一些新出来的工具的编辑效率总体偏低(XCas9和
SpCas0‑NG)，并且目前对于基因编辑工具的优化和改造主要是基于增强工具的精确性和增
强靶向范围的改造，还没有针对于基因编辑工具本身来广泛的提高各类基因编辑工具的方
法。

[0004] 基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。传统的基因治疗是基于过表达正确的基因来补偿
患者体内缺失的基因，从而对疾病进行治疗，在基因编辑技术出现后，基因治疗已经发展成
一种精确的治疗方式，可以从DNA水平精确的修正治病基因，达到从根本上治疗疾病的目
的。目前，以基因编辑技术为基础的基因治疗正在如火如荼的发展，已报道过在多种遗传疾
病的治疗发挥了可喜的成效，但是对于大多数遗传疾病来说，基因编辑介导的基因治疗的
效率还是总体偏低，极大地限制了其广泛应用。因此，本发明基于新发明的增强型基因编辑
工具，通过临床可行的方法递送增强型基因编辑工具至疾病模型体内，尝试提高疾病治疗
的效率。

[0005] 因此，本领域迫切需与开发一种新的基因治疗的方法。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种新的基因治疗的方法。

[0007] 本发明第一方面提供了一种活性物质的用途，用于制备用于基因治疗的药物或制剂，其中所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体，其中所述融合蛋白的结
构如下式I或I’所示：

[0008] C‑A‑L‑B  (I)

[0009] B‑L‑A‑C  (I’)

[0010] 式中，

[0011] A为基因编辑蛋白，

[0012] B为DNA双链结合结构域，

[0013] C为任选的碱基编辑器元件；

[0014] L为无或连接肽，

[0015] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

[0016] 在另一优选例中，所述药物用于治疗可以用基因治疗进行治疗的疾病。

[0017] 在另一优选例中，所述疾病包括遗传性疾病、神经系统疾病、心脏系统疾病、眼科疾病、自身免疫性疾病、血友病、血液病、和/或癌症。

[0018] 在另一优选例中，所述遗传性疾病选自下组：肝脏代谢性疾病、β地中海贫血、心血管疾病、杜式肌肉营养不良症、高草酸症、或其组合。

[0019] 在另一优选例中，所述肝脏代谢性疾病选自下组：家族性高胆固醇血症、血友病、苯丙酮尿症、络氨酸血症、高血氨症、或其组合。

[0020] 在另一优选例中，所述疾病包括细胞增殖性病症。

[0021] 在另一优选例中，所述细胞增殖性病症选自下组：肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌、卵巢癌、类风湿性关节
炎、或其组合。

[0022] 在另一优选例中，所述疾病为针对选自下组的器官的疾病：肝脏、肾脏、心脏、胰脏、肺脏、骨、胸腺、肾上腺、口腔、咽、食管、胃、脑、十二指肠、空肠、回肠、大肠、肛门、或其组
合。

[0023] 在另一优选例中，当融合蛋白的结构如式I’所示时，C为无。

[0024] 在另一优选例中，所述非肽键包括PEG。

[0025] 在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：Cas9、Cas9a、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14、或其组合。

[0026] 在另一优选例中，所述基因编辑蛋白包括野生型或突变型的基因编辑蛋白。

[0027] 在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、毛
螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)、或其组合。

[0028] 在另一优选例中，所述野生型的基因编辑蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、14或15所示。

[0029] 在另一优选例中，所述碱基编辑器元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2或12所示。

[0030] 在另一优选例中，所述DNA双链结合结构域为非序列特异性的DNA双链结合结构域。

[0031] 在另一优选例中，所述DNA双链结合结构域选自下组：HMG‑D、Sac7d、或其组合。

[0032] 在另一优选例中，所述DNA双链结合结构域包括野生型的DNA双链结合结构域和突变型的DNA双链结合结构域。

[0033] 在另一优选例中，所述DNA双链结合结构域来源于果蝇或古细菌。

[0034] 在另一优选例中，所述DNA双链结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10或11所示。

[0035] 在另一优选例中，所述连接肽的长度为1‑100aa，较佳地，15‑85aa，更佳地，25‑70aa。

[0036] 在另一优选例中，所述连接肽为具有n个重复的如Gly‑Gly‑Ser所示的序列，其中n为2‑8，优选地n为3‑6。

[0037] 在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列选自下组：

[0038] (1)氨基酸序列如SEQ ID NO.:3‑7中任一所示的多肽；

[0039] (2)将SEQ ID NO.:3‑7中任一所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1‑20个、更优选1‑15个、更优选1‑10个、更优选1‑8个、更优选1‑3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失
或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:3‑7中任一所示氨基酸序列的多
肽衍生的多肽。

[0040] 在另一优选例中，所述碱基编辑器元件包括胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶。

[0041] 在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶包括Apobec1、Apobec3A。

[0042] 在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶包括TadA。

[0043] 在另一优选例中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.:8、9、13中任一所示的氨基酸序列。

[0044] 在另一优选例中，所述药物包括：

[0045] (a)融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)；所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：

[0046] C‑A‑L‑B  (I)

[0047] B‑L‑A‑C  (I’)

[0048] 式中，

[0049] A为基因编辑蛋白，

[0050] B为DNA双链结合结构域，

[0051] C为任选的碱基编辑器元件；

[0052] L为无或连接肽，

[0053] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；和

[0054] (b)药学上可接受的载体(carrier)。

[0055] 在另一优选例中，所述药物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

[0056] 在另一优选例中，所述药物的剂型为注射剂型。

[0057] 在另一优选例中，所述药物还包括其他用于基因治疗的药物。

[0058] 在另一优选例中，所述其他用于基因治疗的药物选自下组：反义核苷酸药物、EDIT‑101药物、CTX001、或其组合。

[0059] 在另一优选例中，所述药物为细胞制剂。

[0060] 在另一优选例中，所述基因治疗通过基因编辑进行基因治疗。

[0061] 在另一优选例中，所述基因治疗通过基因编辑试剂进行基因治疗。

[0062] 在另一优选例中，所述基因编辑试剂包含融合蛋白，所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：

[0063] C‑A‑L‑B  (I)

[0064] B‑L‑A‑C  (I’)

[0065] 式中，

[0066] A为基因编辑蛋白，

[0067] B为DNA双链结合结构域，

[0068] C为任选的碱基编辑器元件；

[0069] L为无或连接肽，

[0070] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

[0071] 在另一优选例中，所述的试剂还包括选自下组的一种或多种试剂：

[0072] (a1)gRNA、crRNA、或用于产生所述gRNA或crRNA的载体；

[0073] (a2)用于同源定向修复的模板：单链核苷酸序列或质粒载体。

[0074] 在另一优选例中，所述基因治疗用如下方法进行：

[0075] 在基因编辑试剂的存在下，对细胞进行基因编辑。

[0076] 在另一优选例中，所述细胞包括人或非人哺乳动物细胞(如灵长类动物或家畜)。

[0077] 在另一优选例中，所述细胞包括癌细胞或正常细胞。

[0078] 在另一优选例中，所述细胞选自下组：肾脏细胞、肝脏细胞、神经细胞、心脏细胞、上皮细胞、肌细胞、体细胞、骨髓细胞、内皮细胞、或其组合。

[0079] 在另一优选例中，所述细胞选自下组：293细胞、A549细胞、SW626细胞、HT‑3细胞、PA‑1细胞、或其组合。

[0080] 在另一优选例中，所述细胞包括HEK293T。

[0081] 在另一优选例中，所述的基因编辑在一体外反应体系中进行。

[0082] 在另一优选例中，所述的体外反应体系中，所述基因编辑试剂的含量为100ng－700ng，较佳地，200ng－600ng，更佳地，300ng—500ng。

[0083] 在另一优选例中，所述细胞为体外的细胞。

[0084] 本发明第二方面提供了一种药盒，包括：

[0085] (a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的活性物质，或含有所述活性物质的药物，其中，所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体，其中所述融合蛋白的结
构如下式I或I’所示：

[0086] C‑A‑L‑B  (I)

[0087] B‑L‑A‑C  (I’)

[0088] 式中，

[0089] A为基因编辑蛋白，

[0090] B为DNA双链结合结构域，

[0091] C为任选的碱基编辑器元件；

[0092] L为无或连接肽，

[0093] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

[0094] 在另一优选例中，所述药盒还包括：

[0095] (a2)第二容器，以及位于所述第二容器中的其他用于基因治疗的药物，或含有其他用于基因治疗的药物的药物。

[0096] 在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。

[0097] 在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含所述活性物质的单方制剂。

[0098] 在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他用于基因治疗的药物的单方制剂。

[0099] 在另一优选例中，所述药物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

[0100] 在另一优选例中，所述药物的剂型为注射剂型。

[0101] 本发明第三方面提供了一种药物组合物，包括：

[0102] (a)活性物质，所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)，其中所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：

[0103] C‑A‑L‑B  (I)

[0104] B‑L‑A‑C  (I’)

[0105] 式中，

[0106] A为基因编辑蛋白，

[0107] B为DNA双链结合结构域，

[0108] C为任选的碱基编辑器元件；

[0109] L为无或连接肽，

[0110] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键；和

[0111] (b)药学上可接受的载体(carrier)。

[0112] 在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体。

[0113] 在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。

[0114] 在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(AAV)。

[0115] 在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

[0116] 在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂型。

[0117] 在另一优选例中，所述药物组合物中还包括其他用于基因治疗的药物。

[0118] 在另一优选例中，所述其他用于基因治疗的药物选自下组：反义核苷酸药物、EDIT‑101药物、CTX001、或其组合。

[0119] 在另一优选例中，所述药物组合物为细胞制剂。

[0120] 本发明第四方面提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象，施用一活性物质或本发明第二方面所述的药盒，所述活性物质为融合蛋白、或其编码基因、
或其表达载体，其中所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：

[0121] C‑A‑L‑B  (I)

[0122] B‑L‑A‑C  (I’)

[0123] 式中，

[0124] A为基因编辑蛋白，

[0125] B为DNA双链结合结构域，

[0126] C为任选的碱基编辑器元件；

[0127] L为无或连接肽，

[0128] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

[0129] 在另一优选例中，在施用所述活性物质或本发明第二方面所述的药盒之前、同时和/或之后，配合使用其他治疗疾病的活性物质。

[0130] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。

附图说明

[0131] 图1显示了对于两个不同的内源靶点的编辑效率，说明DNA双链结合结构域和Cas9的不同连接方式，以及不同长度的linker对效率的提高都有区别，综合选出HMG‑D结构域通
过L4长度的linker连接在Cas9的N端最好。即：HMG‑D‑L4‑Cas9，其中，H代表HMG‑D；S代表
Sac7d；L1‑L5代表不同长度的linker；mutH代表突变的HMG‑D(V32A和T33A突变，降低了结合
活性)；C代表Cas9。

[0132] 图2显示了HMG‑D‑L4‑Cas9在其他内源性靶点的编辑效率也是可以提高的，效率提高＞20％，较佳地，＞40％，更佳地，＞60％(如80％)，最高可达2倍，其中，H代表HMG‑D。

[0133] 图3显示了双链结合结构域HMG‑D可以提高其他来源Cas9蛋白(如：SaCas9)的效率，效率提高了20％以上。

[0134] 图4显示了显示了双链结合结构域HMG‑D可以提高非Cas9蛋白(如：AsCas12a)的效率，效率提高了10‑20％。

[0135] 图5显示了双链结合结构域HMG‑D可以提高表观调控工具(如：CRISPR‑VPR)的效率，效率可以提高2倍。

[0136] 图6显示了双链结合结构域HMG‑D可以提高单碱基编辑工具ABE的效率，其中，H代表HMG‑D。

[0137] 图7显示了通过腺相关病毒(AAV)递送融合HMG‑D的SpCas9和靶向高胆固醇血症的治疗靶点(PCSK9)的sgRNA到小鼠肝脏中，成功地靶向敲除了小鼠PCSK9基因，敲除效率明显
高于不融合HMG‑D的SpCas9组。通过长期监测治疗小鼠的血液胆固醇含量，我们发现治疗的
小鼠血胆固醇含量明显低于未治疗组，并且融合HMG‑D的治疗组明显低于没有融合HMG‑D的
治疗组。说明，通过融合双链结合蛋白的SpCas9可以明显有助于降低血液中的胆固醇，有利
于心血管疾病和家族性高胆固醇血症的治疗治疗，图7A显示了小鼠体内PCSK9靶点的编辑
效率，图7B显示了编辑后的小鼠体内血胆固醇含量下降情况。

[0138] 图8显示了通过表达融合双链结合蛋白(HMG‑D)的碱基编辑工具(hA3A‑CBE)的蛋白，和sgRNA电转至造血干细胞中，实现‑114和‑115位点的C到T的突变。结果表明，融合HMG‑
D的hA3A‑CBE组编辑效率明显高于不融合HMG‑D的hA3A‑CBE组；在RNA水平，融合HMG‑D的
hA3A‑CBE组的γ珠蛋白的的表达也明显提升；同样在蛋白水平，融合HMG‑D的hA3A‑CBE组珠
蛋白的的表达也明显高于不融合HMG‑D的hA3A‑CBE组；图8A显示了造血干细胞靶点的编辑
效率，图8B显示了编辑的造血干细胞分化后HBG基因mRNA的表达情况，图8C显示了编辑的造
血干细胞分化后γ珠蛋白的的表达情况。

具体实施方式

[0139] 本发明人经过广泛而深入的研究，意外地获得一种增强型融合蛋白。相比野生型的基因编辑蛋白，本发明的增强型融合蛋白可显著提高体内或体外的基因编辑效率，并且
本发明还意外的发现，基因编辑蛋白和DNA双链结合结构域、任选的碱基编辑器元件以及任
选的连接肽所形成的融合蛋白，可显著提高基因编辑效率(提高≥20％，如80％，甚至可达2
倍)，并且本发明的融合蛋白可用于基因治疗。在此基础上，本发明人完成了本发明。

[0140] 术语

[0141] 为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了
其它定义。

[0142] 术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约
100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

[0143] 如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

[0144] 序列同一性(或同源性)通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现
相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测
量是本领域技术人员熟知的方法。

[0145] 如本文所用，术语“EDIT‑101药物”属于基因治疗药物，是一类细胞，具体地，EDIT‑101是一种利用CRISPR基因编辑技术治疗遗传性视网膜衰退疾病(LCA10疾病)的药物，
EDIT‑101通过视网膜下注射给药，将基因编辑系统直接输送到感光细胞中而达到治疗效
果。

[0146] 如本文所用，术语“CTX001”属于基因治疗药物，是一类细胞，具体地，CTX001是基于CRISPR基因编辑技术通过剪切β‑地中海贫血患者的BCL11A基因实现治疗目的。

[0147] 野生型的基因编辑蛋白

[0148] 如本文所用，“野生型的基因编辑蛋白”是指天然存在的、未经过人工改造的基因编辑蛋白，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)
等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型的基因编辑蛋白的来源包括(但
并不限于)：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、
氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)。

[0149] 在本发明的一个优选例中，所述野生型基因编辑蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或14或15所示。

[0150] 在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括，但并不限于，Cas9、Cas9a、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14。

[0151] DNA双链结合结构域

[0152] 如本文所用，术语“DNA双链结合结构域”为无序列特异性的DNA双链结合结构域。与序列特异性的DNA双链结合结构域相比，本发明的无序列特异性的DNA双链结合结构域不
受DNA序列的限制，理论上可以结合任何DNA序列，因此，可以适用于任何位置的DNA的结合。

[0153] 一种优选的DNA双链结合结构域的序列如SEQ ID NO.:10或11所示。

[0154] 碱基编辑器

[0155] 本文提供的任何碱基编辑器能够修饰特定核苷酸碱基而不产生显著比例的插入/缺失。如本文所用，“插入/缺失”指核酸内的核苷酸碱基的插入或缺失。此类插入或缺失可
以导致基因编码区内的移码突变。在一些实施方案中，期望产生有效修饰(例如突变或脱氨
基化)核酸内的特定核苷酸，而不在核酸中产生大量插入或缺失(即插入/缺失)的碱基编辑
器。在某些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器能够产生相对于插入/缺失更大比例的
意图修饰(例如，点突变或脱氨基化)。

[0156] 本发明的任何碱基编辑器能够有效地在核酸(例如基因组内的核酸)中产生意图的突变，如点突变，而不产生大量的非意图突变，诸如非意图点突变。

[0157] 在本发明中，碱基编辑器包括胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶，其他类型的碱基编辑器只要具备本发明的碱基编辑器的功能也在本发明的保护范围内。

[0158] 在本发明中，将基因编辑蛋白与碱基编辑器融合后的结构称之为ABE或CBE，其中，ABE为基因编辑蛋白与腺嘌呤脱氨酶融合后的结构，CBE为基因编辑蛋白与胞嘧啶脱氨酶融
合后的结构。

[0159] 一种优选的碱基编辑器的序列如SEQ ID NO.:2或12所示。

[0160] 融合蛋白

[0161] 如本文所用，“本发明融合蛋白”、或“多肽”均指本发明第二方面所述的融合蛋白。本发明融合蛋白的结构如下式I或I’所示：

[0162] C‑A‑L‑B  (I)

[0163] B‑L‑A‑C  (I’)

[0164] 式中，

[0165] A为基因编辑蛋白，

[0166] B为DNA双链结合结构域，

[0167] C为任选的碱基编辑器元件；

[0168] L为无或连接肽，

[0169] 各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

[0170] 在本发明中，连接肽的长度对融合蛋白的活性有影响，优选的连接肽的长度为1‑100aa，较佳地，15‑85aa，更佳地，25‑70aa。

[0171] 一种优选的连接肽如SEQ ID NO.:3‑7所示。

[0172] 如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:8、9、或13所示的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1‑3个(通常为1‑2个，更佳地1个)氨基酸的
缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较
佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸
进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或
数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形
式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

[0173] 本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的
多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守
性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或
(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成
的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列
或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物
属于本领域熟练技术人员公知的范围。

[0174] 一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多
肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

[0175] 表A

[0176] 最初的残基 代表性的取代 优选的取代Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0177] 本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:8或9或13所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，
或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L‑氨基酸的残基(如D‑氨基酸)的类似物，以
及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ‑氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并
不限于上述例举的代表性的多肽。

[0178] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行
糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物
的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨
酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化
了溶解性能的多肽。

[0179] 在本发明中，在式I中，A为基因编辑蛋白，B为HMG‑D或Sac7d，C为腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶或无，L为L1或L2或L3或L4或L5或无。

[0180] 在一优选实施方式中，在式I中，A为基因编辑蛋白，B为HMG‑D，C为或腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶或无，L为L4或L5。

[0181] 在一优选实施方式中，本发明的融合蛋白还可以包括式I中的A、B、C、L元件中的两种或多种。

[0182] 在一优选实施方式中，在式I中，A为基因编辑蛋白，B为HMG‑9，C为无，L为L4。

[0183] 在一优选实施方式中，在式I中，A为基因编辑蛋白，B为HMG‑D，C为腺嘌呤脱氨酶，L为L5。

[0184] 在一优选实施方式中，在式I中，A为基因编辑蛋白，B为HMG‑D，C为胞嘧啶脱氨酶，L为L5。

[0185] 在一优选实施方式中，本发明的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8、9或13所示。

[0186] 腺相关病毒

[0187] 因腺相关病毒(Adeno‑associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对遗传性疾病的基因治疗方法受
到了广泛的关注。

[0188] 腺相关病毒(adeno‑associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为
腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病
毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和
整合。AAV能感染多种细胞。

[0189] 重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被
视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应
用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细
胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多
种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还
广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

[0190] 在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系
列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。
AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列
(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区
域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣
壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

[0191] AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容
整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所
描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV
的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专
利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方
式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各
种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物
体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病
毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端
重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准
技术纯化所产生的AAV重组体。

[0192] 在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和
AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因
其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利
No.6,596,535中有所描述。

[0193] 表达载体和宿主细胞

[0194] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

[0195] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：

[0196] (1).用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

[0197] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

[0198] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

[0199] 本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如
腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以
用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

[0200] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重
组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这
些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包
括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和
其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括
翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

[0201] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋
白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

[0202] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

[0203] 宿主细胞可以是原核细胞(如大肠杆菌)，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：大肠杆
菌、麦胚细胞，昆虫细胞，SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞等。在本发明的一个优选实施方
式中，选择酵母细胞(如毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克
鲁维酵母，更佳地为马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母)为宿主细胞。

[0204] 本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启
动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的
SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

[0205] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

[0206] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所
用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方
法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如
显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

[0207] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下
进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)
诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

[0208] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这
些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用
蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸
附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

[0209] 基因治疗

[0210] 遗传病的基因治疗(Gene Therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正缺陷基因而根治疾病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以
是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。基因是
携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入
生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，基因转移的方法分为生物学方法、物理方法
和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗主要是治疗
那些对人类健康威胁严重的疾病，包括，但并不限于：遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭
性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)。基因治疗
是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷
或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法
不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的
是疾病的根源‑‑异常的基因本身。基因治疗的靶细胞包括，但并不限于，体细胞、骨髓细胞、
肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞。

[0211] 在本发明中，通过基因治疗将靶基因进行高效的基因编辑(包括基因插入、替换等)，从而恢复基因的正常表达或增强基因的表达，从而治疗相关疾病。

[0212] 遗传性疾病

[0213] 在本发明中，遗传性疾病指由于基因组DNA的突变而导致的一类疾病。

[0214] 在一优选实施方式中，本发明的遗传性疾病包括但并不限于，肝脏代谢性疾病(比如家族性高胆固醇血症、血友病、苯丙酮尿症、络氨酸血症、高血氨症等)、β地中海贫血、心
血管疾病、杜式肌肉营养不良症、高草酸症。

[0215] 肝脏代谢性疾病

[0216] 肝脏是机体最重要的新陈代谢器官，各种各样物质均直接或间接的通过肝脏进行代谢。因此，肝细胞表达着各种各样的代谢酶来发挥代谢功能。一旦某个(或某些)酶的基因
发生突变而影响酶的表达或其生物学功能，则会导致上游代谢物不能被及时代谢或者下游
重要的代谢产物不能得以补充，从而发生不可逆的代谢障碍，导致疾病的发生。

[0217] 此外，胆固醇含量的高低往往是评价心血管疾病和家族性高胆固醇血症的一个重要指标，胆固醇在血液中浓度升高或者聚集在血管中，就会导致相关心血管疾病的发生。而
机体对胆固醇的代谢都是通过肝脏进行代谢，因此肝脏内缺乏或降低胆固醇代谢的能力，
则会导致血液中的胆固醇浓度偏高，导致疾病的发生。

[0218] 本发明的研究表明，血胆固醇升高是心血管疾病发生的重要因素，并且本发明发现，通过药物治疗或基因治疗的方法降低胆固醇含量是治疗心血管疾病和家族性高胆固醇
血症的主要策略。

[0219] β型地中海贫血

[0220] β型地中海贫血是由β珠蛋白基因发生突变所导致的血液类遗传疾病，当β珠蛋白基因发生突变导致β株蛋白无法表达或功能缺失，就会导致红细胞前体过早凋亡而无法形
成。目前可以通过基因编辑的策略重新激活γ珠蛋白的表达，来弥补β珠蛋白的缺失，产生
γ珠蛋白同样能够与α珠蛋白形成异源四聚体，即胎儿血红蛋白HBF，有助于治疗β地中海贫
血。而γ珠蛋白是一种主要在婴儿时期表达，之后则被各种转录调控因子抑制而不能表达，
目前也有越来越多的发现某些点突变可以重新激活γ珠蛋白的表达。

[0221] 本发明的主要优点包括：

[0222] (1)本发明首次发现，本发明的融合蛋白可显著提高体内或体外的基因编辑效率。

[0223] (2)本发明首次发现，本发明的融合蛋白可显著提高体内或体外的基因编辑效率，提高幅度≥20％，较佳地，＞40％，更佳地，＞60％(如80％)，最高可达2倍。

[0224] (3)本发明首次发现体外转录增强型基因编辑工具的mRNA，提高动物模型构建的成功性。

[0225] (4)本发明使用包装增强型基因编辑工具的AAV病毒，表达增强型基因编辑工具的蛋白，提高疾病治疗效果。

[0226] (5)本发明首次利用通过融合双链DNA结合结构域来提高基因编辑效率。

[0227] (6)本发明首次筛选找到了一种高效提高基因编辑效率的双链DNA结合结构域(如HMG‑D),以及其非常优异的融合方式。

[0228] (7)本发明首次发现，本发明的双链DNA结合结构域可以广泛的提高各种基因编辑工具的基因编辑效率。

[0229] (8)本发明的增强型基因编辑工具可以提高动物模型构建的成功率，以及基因治疗效率。

[0230] (9)本发明的增强型基因编辑工具可用于基因治疗。

[0231] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring  Harbor 
Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否
则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

[0232] 除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

[0233] 通用方法

[0234] 方法1：(适用于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例6)

[0235] 1、24孔板的HEK293T细胞密度长至60‑70％，等摩尔量的质粒通过转染试剂PEI转染进细胞，8‑10小时换液，细胞培养一段时间后(Cas9系统培养72小时，碱基编辑系统培养
120小时)，收细胞，提基因组。

[0236] 2、设计合适引物扩增靶点左右共150‑180bp的序列，进行Hitom建库，深度测序，分析计算编辑效率。

[0237] 方法2：(适用于实施例7的动物模型构建)

[0238] 1、体外转录增强型基因编辑工具的mRNA和对应靶点的sgRNA。

[0239] 2、小鼠胚胎注射mRNA和sgRNA，移植到代孕母鼠，获得F0代小鼠，鉴定基因，统计小鼠基因型突变率，计算模型构建成功率。

[0240] 方法3：(适用于实施例5)

[0241] 1、24孔板的HEK293T细胞密度长至60‑70％，等摩尔量的质粒通过转染试剂PEI转染进细胞，8‑10小时换液，细胞培养一段时间后(Cas9系统培养72小时，碱基编辑系统培养
120小时)，收细胞，提RNA，反转录获得cDNA。

[0242] 2、设计合适的引物进行RT‑qPCR进行相对定量分析，比较靶基因转录激活的效率。

[0243] 方法4：(适用于实施例8的体内基因治疗)

[0244] 1、包装增强型基因编辑工具的腺相关病毒(AAV)和治疗基因的sgRNA，或者同源修复模板。

[0245] 2、通过静脉注射(尾静脉)或局部注射(肌肉等)包装的AAV至疾病动物模型(小鼠或大鼠)，同时注射对照病毒。

[0246] 3、定期观察，检测治疗组的动物模型和对照组动物模型的表型，评价治疗效率。

[0247] 方法5：(适用于实施例9的细胞基因治疗)

[0248] 1、体外表达增强型基因编辑工具的蛋白，以及合成相关靶点的sgRNA。

[0249] 2、电转蛋白和RNA复合物(RNP)至造细胞中。

[0250] 3、基因型检测和功能检测。

[0251] 实施例1筛选增强型基因编辑工具

[0252] 分别合成不同种类的双链DNA结合结构域(HMG‑D和Sac7d)，通过设计5种不同长度的linker(L1、L2、L3、L4和L5)，以及融合在Cas9的N端和C端，在两个内源性靶点(VEGF和
HBG1/2)上进行比较，根据结果统计，对这一系列优化所得到的增强型的基因编辑工具进行
打分(在效果均很好的基础上所做的相对评分)(不好：A；欠好：AA；较好：AAA；好：AAAA；非常
好：AAAAA),结果如下：(注：C表示Cas9；L1‑L5表示不同linker；H表示HMG‑D结构域；S表示
sac7d。)

[0253] A：S‑L1‑C,H‑L1‑C

[0254] AA:S‑L2‑C,S‑L3‑C,S‑L4‑C,H‑L2‑C

[0255] AAA:H‑L4‑C‑L4‑S,H‑L4‑C‑L5‑S

[0256] AAAA:H‑L3‑C,C‑L4‑S,C‑L5‑S,C‑L4‑H,H‑L4‑C‑L4‑H,H‑L4‑C‑L5‑H,H‑L4‑H‑L4‑C,C‑L5‑H‑L5‑H

[0257] AAAAA:H‑L4‑C,C‑L5‑H

[0258] 综合统计，发现HMG‑D的效果非常好，并且L4和L5长度(32个和64个氨基酸)的linker是最优的linker，通过比较N端和C端连接，发现在最优linker条件下，N端和C端连接
的效果相都很好，因此本发明人得到增强型的基因编辑工具，即HMG‑D通过L4或L5的linker
融合在Cas9的N端或C端是非常好的融合方式(图1)。

[0259] 同理，这种通过双链DNA结合结构域融合来增强基因编辑效率的增强型基因编辑工具，也可以类比到其他类型的双链DNA结合结构域，如应用广泛锌指蛋白(ZFP)、其他转录
因子的DNA结合结构域和来源其他物种的HMG‑D或Sac7d，等等。本发明同样可以通过这些双
链DNA结合结构域来提高基因编辑效率，因此，本发明最重要的是在于发现了双链DNA结合
结构域融合基因编辑工具可以提高基因编辑效率，而其中优选双链DNA结合结构域HMG‑D。

[0260] 对比例1与不是DNA结合结构域融合后效果不好

[0261] 为了进一步验证DNA结合结构域融合后可以提高基因编辑效率，把DNA结合结构域改为GFP蛋白(一种非DNA结合结构域)这种无关的蛋白，发现融合了GFP蛋白后不能提高基
因编辑效率(图1)。同时，还对HMG‑D结构域进行突变，破坏其DNA结合的能力，构建了3个氨
基酸突变的HMG‑D结构域(mutHMG‑D，简称mutH),通过实验比较，mutHMG‑D结构域也不能提
高基因编辑效率(图1)。

[0262] 对比例2HMG‑D、Sac7d之外的DNA结合结构域效果不好

[0263] 为了扩宽DNA结合结构域的范围，又测试了一些单链DNA结合结构域(如Rad51)，融合Rad51后同样不能提高基因编辑效率(图1)。因此，结果表明，本发明上述筛选的HMG‑D和
Sac7d的双链DNA结合结构域是非常有效的。

[0264] 实施例2提高SpCas9的基因编辑效率

[0265] 将获得的增强型基因编辑工具(即本发明的融合蛋白，如HMG‑D‑L4‑SpCas9)进一步在更多的内源性靶点上进行效果方面的比较，通过等摩尔比转染293T细胞，发现在所比
较的靶点中和SpCas9相比较，本发明的融合蛋白的编辑效率都有大于20％(或60％、或
80％)的提高，最高可达2倍(图2)。

[0266] 实施例3提高其他种属来源的Cas9(如：SaCas9)的基因编辑效率

[0267] 通过构建HMG‑D‑L4‑SaCas9表达载体，针对内源性靶点，等摩尔比转染293T细胞，发现融合HMG‑D后SaCas9编辑效率也有类似的效果的提升。(图3)

[0268] 实施例4提高其他非Cas9蛋白(如：AsCas12a)的基因编辑效率

[0269] 通过构建HMG‑D‑L4‑AsCas12a表达载体，针对内源性靶点，等摩尔比转染293T细胞，发现融合HMG‑D后AsCas12a编辑效率也有类似的效果的提升。(图4)

[0270] 实施例5提高转录调控工具(CRISPR/Cas9a)的转录激活效率

[0271] 通过构建HMG‑D‑L4‑dCas9‑VPR表达载体，针对内源性靶点，等摩尔比转染293T细胞，发现融合HMG‑D后dCas9‑VPR对于内源性基因的转录激活效率也有类似的效果的提升。
(图5)

[0272] 实施例6提高碱基编辑器(base editor)的编辑效率

[0273] 由于碱基编辑器(base editor)是通过在Cas9的N端融合了胞嘧啶脱氨酶(CBE)和腺嘌呤脱氨酶(ABE)，所以，在碱基编辑器的Cas9的c端通过L5 linker来融合HMG‑D，开发出
增强型单碱基编辑工具。通过内源性靶点比较，融合HMG‑D后碱基编辑器(如ABE)的编辑效
率有了极大的提升，如提高了＞1.5－2倍(图6)。

[0274] 融合了其他类型碱基编辑器的融合蛋白的编辑效率的提升幅度与融合了ABE的融合蛋白的编辑效率类似或相当。

[0275] 实施例7提高提高动物模型构建的成功率

[0276] 通过体外转录增强型基因编辑工具的mRNA，增加了动物模型构建的成功率。

[0277] 实施例8通过递送融合双链结合蛋白(HMG‑D)的增强型基因编辑工具到动物体内，可以增加Cas9在体编辑效率，提高基因治疗的效率

[0278] 以在小鼠模型上降低血胆固醇含量的基因治疗方法为例。

[0279] 方法：

[0280] 1、包装融合HMG‑D的SpCas9的AAV8血清型的病腺相关病毒，以及靶向肝脏基因PCSK9的sgRNA，用超速离心的方法进行病毒的纯化，浓缩，qPCR滴度测定；2、6‑8周龄合适的
小鼠通过尾静脉注射两个病毒的混合物，并同时设置对照组注射野生型SpCas9和sgRNA的
病毒混合物；3、病毒注射后15天和35天进行手术，麻醉取肝组织，常规方法提取基因组，二
代测序比较基因编辑效率；4、注射后7天开始，每隔7天进行取血，用酶标法进行检测血液总
胆固醇含量；5、最终，统一比较野生型基因编辑工具和增强型基因编辑工具的效率和疾病
治疗效果。

[0281] 发明人通过腺相关病毒(AAV)递送融合HMG‑D的SpCas9和靶向高胆固醇血症的治疗靶点(PCSK9)的sgRNA到小鼠肝脏中，成功地靶向敲除了小鼠PCSK9基因，敲除效率明显高
于不融合HMG‑D的SpCas9组(图7A)。通过长期监测治疗小鼠的血液胆固醇含量，发现治疗的
小鼠血胆固醇含量明显低于未治疗组，并且融合HMG‑D的治疗组明显低于没有融合HMG‑D的
治疗组(图7B)。

[0282] 结果表明，通过融合双链结合蛋白的SpCas9可以明显有助于降低血液中的胆固醇，有利于心血管疾病和家族性高胆固醇血症的治疗治疗。同时，通过AAV递送增强型基因
编辑工具明显增强体内编辑效率这一点这也为更多的疾病的治疗提供了条件。

[0283] 实施例9通过电转融合双链结合蛋白(HMG‑D)的增强型基因编辑工具到治疗性的细胞中，可以提高体外治疗性细胞的编辑效率，有利于疾病的治疗

[0284] 以造血干细胞治疗β地中海贫血为例。

[0285] 发明人利用碱基编辑工具在造血干细胞上产生治疗性的点突变，从而激活γ珠蛋白的表达，治疗β地中海贫血。通过表达融合双链结合蛋白(HMG‑D)的碱基编辑工具(hA3A‑
CBE)的蛋白，和sgRNA电转至造血干细胞中，实现‑114和‑115位点的C到T的突变。

[0286] 方法：

[0287] 1、原核表达纯化融合HMG‑D的hA3A‑CBE蛋白；2、合成靶基因的sgRNA；3、造血干细胞常规方法进行分离，培养，蛋白和RNA孵育形成RNP电转到造血干细胞中；4、电转72小时后
收集部分细胞进行基因组的提取，PCR,测序，分析和比较靶基因的突变效率；5、剩余的造血
干细胞用常规方法进行分化成红细胞，通过RT‑qPCR检测红细胞中γ珠蛋白的表达水平；6、
分离红细胞中的蛋白，进行色谱来定性和定量γ珠蛋白的表达；7、总体比较增强型编辑工
具对于β地中海贫血的治疗效果。

[0288] 结果表明，融合HMG‑D的hA3A‑CBE组的编辑效率明显高于不融合HMG‑D的hA3A‑CBE组(图8A)；在RNA水平，融合HMG‑D的hA3A‑CBE组的γ珠蛋白的表达也明显提升(图8B)；同样
在蛋白水平，融合HMG‑D的hA3A‑CBE组珠蛋白的表达也明显高于不融合HMG‑D的hA3A‑CBE组
(图8C)。因此，通过电转增强型基因编辑工具蛋白的策略可以极大地提高细胞的编辑效率，
这对于今后各种细胞治疗(HSC，CART等)意义重大。

[0289] 讨论

[0290] 总的来说，本发明是基于增强型基因编辑工具进行相关疾病的基因治疗的临床前的研发。通过目前基因治疗领域中的两种最重要基因治疗策略来实施，即：通过在体递送基
因治疗工具进行的体内治疗和分离病人细胞进行基因治疗后再移植到病人体内的体外治
疗。

[0291] 首先，大多数的肝脏代谢类疾病都可以通过病毒靶向递送基因治疗药物进行治疗，本发明以胆固醇代谢紊乱引起的胆固醇血症为例，通过AAV递送增强型基因编辑工具可
以极大地降低体内血胆固醇含量，不仅对于胆固醇血症的治疗有利，也对大多数肝脏类代
谢疾病具有很大的指导作用，并且可以推广到一般的遗传性疾病。

[0292] 其次，本发明的基于造血干细胞用于β地中海贫血的治疗的实例，证明了本发明的增强型基因编辑工具可以极大地提高造血干细胞的基因编辑效率，提升β地中海贫血的治
疗的效果，当然，这也可以推广到更多的细胞治疗，如免疫细胞(T细胞)对于肿瘤治疗应用、
间充质干细胞等。

[0293] 最后，通过体内治疗和体外治疗的两个代表性案例的研究，可以看出，本发明的增强型基因编辑工具均优于野生型基因编辑工具，在疾病的基因治疗上展现很大地前景。并
且本发明的增强型基因编辑工具并不局限于这两种疾病，还包括一切野生型基因编辑工具
所能治疗的疾病。

[0294] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。