一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法转让专利
申请号 : CN202010730429.1
文献号 : CN111718889B
文献日 : 2021-10-22
发明人 : 郑航辉 , 方倪冉 , 叶俊贤 , 董楠 , 杨小云
申请人 : 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司
摘要 :
本发明属于生物领域，公开了一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括如下步骤：步骤1：将Sf9细胞在添加硫酸葡聚糖的Sf‑900 III SFM培养基中重悬并将Sf9细胞稀释至0.6‑1.0×106cells/mL；步骤2：添加热灭活胎牛血清至步骤1中，对Sf9细胞进行培养；步骤3：当步骤2中Sf9细胞密度在第三天达到4×106cells/mL以上，重复步骤1和2；其中，每重复一次步骤1和步骤2，添加的热灭活胎牛血清的量逐步降低直至不添加热灭活胎牛血清依然可以使Sf9细胞密度达到4×106cells/mL以上；步骤1中的Sf‑900 III SFM培养基中硫酸葡聚糖的终浓度为20‑30mg/L。该方法具有驯化次数少、驯化后细胞增殖后浓度高、活率高的优点。
权利要求 :
1.一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将Sf9细胞在添加硫酸葡聚糖的Sf‑900 III SFM培养基中重悬并将Sf9细胞稀6
释至0.6‑1.0×10 cells/mL；
步骤2：添加热灭活胎牛血清至步骤1中，对Sf9细胞进行培养；
6
步骤3：当步骤2中Sf9细胞密度在第三天达到4×10 cells/mL以上，重复步骤1和2；
其中，每重复一次步骤1和步骤2，添加的热灭活胎牛血清的量逐步降低直至不添加热6
灭活胎牛血清依然可以使Sf9在第三天细胞密度达到4×10 cells/mL以上；
步骤1中的Sf‑900 III SFM培养基中硫酸葡聚糖的终浓度为20‑30mg/L；
步骤1‑2重复为6次，其中，初次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为9‑11%；第二次和第三次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为6‑8%，第四次、第五次、第六次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为3‑4%。
2.根据权利要求1所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，当不添加热灭6
活胎牛血清依然可以使Sf9细胞密度达到4×10 cells/mL以上后，悬浮培养Sf9细胞的Sf‑
900 III SFM培养基不再添加硫酸葡聚糖。
3.根据权利要求1所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在步骤1之前还包括：
步骤0‑1：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清；
步骤0‑2：加入胰酶，摇晃均匀后静置1‑3min，待消化完全后加入FBS终止消化。
4.根据权利要求3所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，步骤0‑2：加入胰酶消化时间为1min。
5.根据权利要求1‑4任一所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，步骤16
中，Sf9细胞稀释至0.8×10 cells/mL。
6.根据权利要求1‑4任一所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，步骤2中培养体系在摇瓶中采用摇床进行培养；
每重复一次步骤1和步骤2，摇床速度增加5rpm，摇床起始速度为90 rpm，摇床目标速度为120 rpm。
7.根据权利要求6所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，采用摇床进行培养时，培养温度为28℃。
8.根据权利要求1‑4任一所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在任一6
一次重复步骤1和步骤2的过程中，如果步骤2中Sf9细胞密度在第三天低于4×10 cells/mL，该次重复步骤1和步骤2的行为不计入重复次数，且离心细胞重新开始步骤1和步骤2，步骤2中的灭活胎牛血清的浓度和上一轮的步骤2中的灭活胎牛血清浓度相同。
说明书 :
一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法。
背景技术
[0002] 目前成熟的细胞培养方式主要是单层静置贴壁培养、吸附法培养两种。单层静置贴壁培养指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。优点是容易且廉价培养，在倒置显微
镜下易于观察感染过程并且所有的细胞都可用这种方法维持培养。缺点是传代时活率较
低，而且单层细胞限制了每毫升细胞密度，影响蛋白产量。吸附法培养，是固定化培养法的
一种，该法是将细胞贴附于葡聚糖类微载体，细胞利用微载体的表面进行贴壁生长的培养
方式。相比于静置培养方式，微载体悬浮培养有很大的优势，比如：提供较大的比表面积；易
于观察与控制；容易实现细胞与培养液的分离，便于灌注培养；节省空间；具有较好的气液
传质特性。缺点是细胞难以消化传代；微载体悬浮放大过程中，放大比例较小；微载体价格
昂贵；回收微载体的过程复杂。
镜下易于观察感染过程并且所有的细胞都可用这种方法维持培养。缺点是传代时活率较
低，而且单层细胞限制了每毫升细胞密度，影响蛋白产量。吸附法培养，是固定化培养法的
一种，该法是将细胞贴附于葡聚糖类微载体，细胞利用微载体的表面进行贴壁生长的培养
方式。相比于静置培养方式，微载体悬浮培养有很大的优势，比如：提供较大的比表面积；易
于观察与控制；容易实现细胞与培养液的分离，便于灌注培养；节省空间；具有较好的气液
传质特性。缺点是细胞难以消化传代；微载体悬浮放大过程中，放大比例较小；微载体价格
昂贵；回收微载体的过程复杂。
[0003] 全悬浮无血清培养，相对于传统的微载体悬浮培养和培养基需要添加血清的培养方式，细胞用于病毒疫苗的制备无需微载体，从而可以突破细胞生长需要基质表面贴附的
限制，还可以节约设备空间，提高设备利用率，真正意义上实现大规模培养；并且采用全悬
浮无血清培养病毒制备疫苗，无需血清和消化液，从而可大大减少产品杂质的引入，简化后
期的产品分离纯化过程，有效的降低了成本。因此利用全悬浮无血清的方式培养细胞具有
明显的优势。
限制，还可以节约设备空间，提高设备利用率，真正意义上实现大规模培养；并且采用全悬
浮无血清培养病毒制备疫苗，无需血清和消化液，从而可大大减少产品杂质的引入，简化后
期的产品分离纯化过程，有效的降低了成本。因此利用全悬浮无血清的方式培养细胞具有
明显的优势。
[0004] 本申请人所述集团公司的另一子公司广东温氏大华农生物科技有限公司于2015年提出了一项发明专利ZL201510323791.6,公开了一种适用于无血清培养系统的vero细胞
驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后，置于有血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量
的驯化方法驯化vero细胞。采用逐渐减少血清含量的培养方法对vero细胞进行驯化培养，
以使vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后
的vero能在VP‑SFM中连续传代培养至少50代。
驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后，置于有血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量
的驯化方法驯化vero细胞。采用逐渐减少血清含量的培养方法对vero细胞进行驯化培养，
以使vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后
的vero能在VP‑SFM中连续传代培养至少50代。
[0005] 经过研究发现，对于不同的细胞，需要采用不同的培养基，且很多时候单一的采用适用于该细胞的普通培养基可能无法达到最优效果。
[0006] 采用逐步降低血清的方法能够适用于很多悬浮无血清细胞培养驯化过程，但是培养基的选择会对驯化过程、驯化后细胞的活性有明显的影响。
[0007] 所以本案的研究重点在于：研究适用于Sf9细胞的最优的培养基和驯化方法。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，该方法具有驯化次数少、驯化后细胞增殖后浓度高、活率高的优点。
[0009] 本发明的具体方案如下：一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤1：将Sf9细胞在添加硫酸葡聚糖的Sf‑900 III SFM培养基中重悬并将Sf9细6
胞稀释至0.6‑1.0×10cells/mL；
胞稀释至0.6‑1.0×10cells/mL；
[0011] 步骤2：添加热灭活胎牛血清(FBS)至步骤1中，对Sf9细胞进行培养；
[0012] 步骤3：当步骤2中Sf9细胞密度在第三天达到4×106cells/mL以上，重复步骤1和2；
[0013] 其中，每重复一次步骤1和步骤2，添加的热灭活胎牛血清的量逐步降低直至不添6
加热灭活胎牛血清依然可以使Sf9细胞密度在第三天达到4×10cells/mL以上；
加热灭活胎牛血清依然可以使Sf9细胞密度在第三天达到4×10cells/mL以上；
[0014] 步骤1中的Sf‑900 III SFM培养基中硫酸葡聚糖的终浓度为20‑30mg/L。
[0015] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，当不添加热灭活胎牛血清依然可以6
使Sf9细胞密度达到4×10cells/mL以上后，悬浮培养Sf9细胞的Sf‑900 III SFM培养基不
再添加硫酸葡聚糖。
使Sf9细胞密度达到4×10cells/mL以上后，悬浮培养Sf9细胞的Sf‑900 III SFM培养基不
再添加硫酸葡聚糖。
[0016] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，步骤1‑2重复不少于6次，其中，初次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为9‑11％。
[0017] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，步骤1‑2重复为6次，其中，初次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为9‑11％；第二次和第三次重悬培养Sf9
细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为6‑8％，第四次、第五次、第六次重悬培养Sf9细
胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为3‑4％。
细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为6‑8％，第四次、第五次、第六次重悬培养Sf9细
胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为3‑4％。
[0018] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，在步骤1之前还包括：
[0019] 步骤0‑1：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清；
[0020] 步骤0‑2：加入胰酶，摇晃均匀后静置1‑3min，待消化完全后加入FBS终止消化。
[0021] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，步骤0‑2：加入胰酶消化时间为1min。
[0022] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，步骤1中，Sf9细胞稀释至0.8×6
10cells/mL。
10cells/mL。
[0023] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，步骤2中培养体系在摇瓶中采用摇床进行培养；
[0024] 每重复一次步骤1和步骤2，摇床速度增加5rpm，摇床起始速度为90rpm，摇床目标速度为120rpm。
[0025] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，采用摇床进行培养时，培养温度为28℃。
[0026] 在上述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法中，在任一一次重复步骤1和步骤2的过6
程中，如果步骤2中Sf9细胞密度在第三天低于4×10cells/mL，该次重复步骤1和步骤2的
行为不计入重复次数，且离心细胞重新开始步骤1和步骤2，步骤2中的灭活胎牛血清的浓度
和上一轮的步骤2中的灭活胎牛血清浓度相同。
程中，如果步骤2中Sf9细胞密度在第三天低于4×10cells/mL，该次重复步骤1和步骤2的
行为不计入重复次数，且离心细胞重新开始步骤1和步骤2，步骤2中的灭活胎牛血清的浓度
和上一轮的步骤2中的灭活胎牛血清浓度相同。
[0027] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0028] (1)与现有技术相比，本发明提供的Sf9细胞的无血清悬浮驯化方法降低血清浓度和提高悬浮培养的转速同步进行，方法简单，能够快速获得无血清全悬浮细胞系。
[0029] (2)现有技术相比，本发明获得的无血清全悬浮Sf9细胞生长速度快，倍增时间短，细胞活率高，适合大规模的工厂化生产。
[0030] (3)通过研究发现硫酸葡聚糖对Sf9细胞的无血清悬浮驯化具有积极意义，特别是在驯化时间、细胞终浓度等方面都有明显作用。
[0031] (4)本方法初次驯化所用的培养基中热灭活胎牛血清起始浓度低、驯化总用时不超过30天，具有高效、简单、成功率高的优势。
具体实施方式
[0032] 下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围内。
[0033] 实施例1
[0034] 步骤一：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉Grace's Insect Medium培养基(贴壁培养基)，使用5mL PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残
液，彻底除去影响胰酶消化的血清。
液，彻底除去影响胰酶消化的血清。
[0035] 步骤二，加入2mL胰酶，摇晃均匀后静置1min，待消化完全后加入1mL FBS终止消化；
[0036] 步骤三，用Sf‑900 III SFM培养基吹打，将吹打下的Sf9细胞1200rpm离心4min。
[0037] 步骤四，将步骤三中离心产物弃上清液，用5mL Sf‑900 III SFM培养基重悬，取200μL悬液使用Counterstar计数仪计数，根据计数结果将细胞密度采用Sf‑900 III SFM培
6
养基稀释至0.6‑1.0×10cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭
活胎牛血清，28℃、90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
6
养基稀释至0.6‑1.0×10cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭
活胎牛血清，28℃、90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
[0038] 步骤四中的培养基为添加一定量硫酸葡聚糖后的Sf‑900 III SFM培养基，其中，硫酸葡聚糖的终浓度优选为25mg/L。
[0039] 步骤五，当细胞密度达到4×106cells/mL以上，采用稀释传代，用新鲜培养基将细6
胞密度稀释至0.6‑1.0×10 cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到
120rpm为止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
胞密度稀释至0.6‑1.0×10 cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到
120rpm为止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
[0040] 若第三天细胞密度低于4×106cells/mL，则记录该次循环失败，需要离心细胞，重6
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
[0041] 在培养过程中用10％热灭活胎牛血清传代培养一次，再用8％热灭活胎牛血清传代培养两次，再用4％热灭活胎牛血清传代培养三次，之后传代的培养基不再添加血清。需
要说明的是，本实施例中描述了循环次数为6次，实际上在大量的实验中证实，循环次数高
于6次也是可以的；
要说明的是，本实施例中描述了循环次数为6次，实际上在大量的实验中证实，循环次数高
于6次也是可以的；
[0042] 步骤五中每次细胞传代密度优选为0.8×106cells/mL。
[0043] 步骤六，一旦在无血清培养基中连续3代以上的Sf9细胞密度在第三天能达到4×6
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
[0044] 在本实验中，经过6次循环，最终Sf9细胞密度在第三天能达到5.5×106cells/ml，细胞活率高于99％。
[0045] 实施例2
[0046] 大体参考实施例1，其具体步骤如下：
[0047] 步骤一：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用5mL PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清。
[0048] 步骤二，加入2mL胰酶，摇晃均匀后静置2min，待消化完全后加入1mL FBS终止消化；
[0049] 步骤三，用Sf‑900 III SFM培养基吹打，将吹打下的Sf9细胞1200rpm离心4min。
[0050] 步骤四，将步骤三中离心产物弃上清液，用5mL Sf‑900 III SFM培养基重悬，取200μL悬液使用Counterstar计数仪计数，根据计数结果将细胞密度稀释至0.6‑1.0×
6
10 cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
6
10 cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
[0051] 步骤四中的培养基为添加一定量硫酸葡聚糖后的Sf‑900 III SFM培养基，其中，硫酸葡聚糖的终浓度优选为30mg/L。
[0052] 步骤五，当细胞密度达到4×106cells/mL以上，采用稀释传代，用新鲜培养基将细6
胞密度稀释至0.6×10cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到120rpm为
止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
胞密度稀释至0.6×10cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到120rpm为
止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
[0053] 若第三天细胞密度低于4×106cells/mL，则记录该次循环失败，需要离心细胞，重6
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
[0054] 在培养过程中用10％热灭活胎牛血清传代培养两次，再用8％热灭活胎牛血清传代培养两次，再用4％热灭活胎牛血清传代培养三次，之后传代的培养基不再添加血清。
[0055] 步骤六，一旦在无血清培养基中连续3代以上的Sf9细胞密度在第三天能达到4×6
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
[0056] 在本实验中，经过7次循环，最终Sf9细胞密度在第三天能达到6.1×106cells/ml，细胞活率高于99％。
[0057] 实施例3
[0058] 大体参考实施例1，其具体步骤如下：
[0059] 步骤一：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用5mL PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清。
[0060] 步骤二，加入2mL胰酶，摇晃均匀后静置2min，待消化完全后加入1mL FBS终止消化；
[0061] 步骤三，用Sf‑900 III SFM培养基吹打，将吹打下的Sf9细胞1200rpm离心4min。
[0062] 步骤四，将步骤三中离心产物弃上清液，用5mL Sf‑900 III SFM培养基重悬，取200μL悬液使用Counterstar计数仪计数，根据计数结果将细胞密度稀释至0.6‑1.0×
6
10 cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
6
10 cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
[0063] 步骤四中的培养基为添加一定量硫酸葡聚糖后的Sf‑900 III SFM培养基，其中，硫酸葡聚糖的终浓度优选为20mg/L。
[0064] 步骤五，当细胞密度达到4×106cells/mL以上，采用稀释传代，用新鲜培养基将细6
胞密度稀释至1×10 cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到120rpm为
止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
胞密度稀释至1×10 cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到120rpm为
止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
[0065] 若第三天细胞密度低于4×106cells/mL，则记录该次循环失败，需要离心细胞，重6
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
[0066] 在培养过程中用10％热灭活胎牛血清传代培养一次，再用8％热灭活胎牛血清传代培养两次，再用4％热灭活胎牛血清传代培养三次，之后传代的培养基不再添加血清。
[0067] 步骤六，一旦在无血清培养基中连续3代以上的Sf9细胞密度在第三天能达到5×6
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
[0068] 在本实验中，经过6次循环，最终Sf9细胞密度在第三天能达到5.1×106cells/ml，细胞活率高于99％。
[0069] 且通过实验可以发现，在实施例1‑3中，没有遇到步骤1‑步骤2的循环失败的现象。
[0070] 对比例1
[0071] 同实施例1，不同的是，自始至终Sf‑900 III SFM培养基不添加硫酸葡聚糖。
[0072] 其具体步骤如下：
[0073] 步骤一：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用5mL PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清。
[0074] 步骤二，加入2mL胰酶，摇晃均匀后静置2min，待消化完全后加入1mL FBS终止消化；
[0075] 步骤三，用Sf‑900 III SFM培养基吹打，将吹打下的Sf9细胞1200rpm离心4min。
[0076] 步骤四，将步骤三中离心产物弃上清液，用5mL Sf‑900 III SFM培养基重悬，取200μL悬液使用Counterstar计数仪计数，根据计数结果将细胞密度稀释至0.6‑1.0×
106cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
106cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
[0077] 步骤五，当细胞密度达到4×106cells/mL以上，采用稀释传代，用新鲜培养基将细6
胞密度稀释至0.8×10cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到120rpm为
止；
胞密度稀释至0.8×10cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到120rpm为
止；
[0078] 若第三天细胞密度低于4×106cells/mL，则记录该次循环失败，需要离心细胞，重6
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
[0079] 在培养过程中用10％热灭活胎牛血清传代培养四次，再用8％热灭活胎牛血清传代培养四次，再用4％热灭活胎牛血清传代培养二次，之后传代的培养基不再添加血清。
[0080] 步骤六，一旦在无血清培养基中连续3代以上的Sf9细胞密度在第三天能达到4×6
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
[0081] 在本实验中，经过10次循环，最终Sf9细胞密度在第三天能达到4.4×106cells/ml，细胞活率高于96％。
[0082] 对比例2
[0083] 步骤一：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用5mL PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清。
[0084] 步骤二，加入2mL胰酶，摇晃均匀后静置1min，待消化完全后加入1mL FBS终止消化；
[0085] 步骤三，用Sf‑900 III SFM培养基吹打，将吹打下的Sf9细胞1200rpm离心4min。
[0086] 步骤四，将步骤三中离心产物弃上清液，用5mL Sf‑900 III SFM培养基重悬，取200μL悬液使用Counterstar计数仪计数，根据计数结果将细胞密度稀释至0.6‑1.0×
6
10 cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
6
10 cells/mL，体积为27mL，转移至125mL康宁摇瓶中，再添加3mL热灭活胎牛血清，28℃、
90rpm的摇床中培养。每天定时统计细胞密度及活率。
[0087] 步骤四中的培养基为添加一定量硫酸葡聚糖后的Sf‑900 III SFM培养基，其中，硫酸葡聚糖的终浓度优选为25mg/L。
[0088] 步骤五，当细胞密度达到4×106cells/mL以上，采用稀释传代，用新鲜培养基将细6
胞密度稀释至0.6‑1.0×10 cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到
120rpm为止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
胞密度稀释至0.6‑1.0×10 cells/mL，每次传代后将摇床转速增加5rpm直至转速达到
120rpm为止，在转速达到120rpm后改为使用未添加硫酸葡聚糖的培养基培养；
[0089] 若第三天细胞密度低于4×106cells/mL，则记录该次循环失败，需要离心细胞，重6
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
悬后继续培养直至细胞密度达到4×10cells/mL以上。失败的循环不计入循环次数，不对
下次循环的摇床速度进行增加，不对下次循环的热灭活胎牛血清的浓度进行降低；所有的
培养工艺参数参考失败的循环的工艺参数。
[0090] 在培养过程中用10％热灭活胎牛血清传代培养一次，再用8％热灭活胎牛血清传代培养一次，再用4％热灭活胎牛血清传代培养四次(需要说明的是：在用含4％灭活胎牛血
清培养基培养过程中，前两次培养细胞生长缓慢，再离心细胞，重悬后继续培养一至两天，
6
细胞密度才达到4×10 cells/mL)，之后传代的培养基不再添加血清。需要说明的是，本实
施例中描述了循环次数为6次，实际上在大量的实验中证实，循环次数高于6次也是可以的；
清培养基培养过程中，前两次培养细胞生长缓慢，再离心细胞，重悬后继续培养一至两天，
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细胞密度才达到4×10 cells/mL)，之后传代的培养基不再添加血清。需要说明的是，本实
施例中描述了循环次数为6次，实际上在大量的实验中证实，循环次数高于6次也是可以的；
[0091] 步骤五中每次细胞传代密度优选为0.8×106cells/mL。
[0092] 步骤六，一旦在无血清培养基中连续3代以上的Sf9细胞密度在第三天能达到4×6
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
10cells/ml以上，细胞活率不低于98％，则认为此细胞适应了无血清全悬浮培养。
[0093] 在本实验中，经过6次循环，最终Sf9细胞密度在第三天能达到4.2×106cells/ml，细胞活率高于96％。
[0094] 通过实施例1‑3以及对比例1‑2可以发现，细胞在第三天的密度能否达到要求、活度能否达到要求和很多因素相关，如培养基的微量成分、培养次数、FPS的降低频率和幅度
等，需要通过多次、反复实验才能得到最优结果。
等，需要通过多次、反复实验才能得到最优结果。