一种具有降尿酸功效的黄秋葵聚半乳糖醛酸及其制备方法和用途转让专利
申请号 : CN202010709763.9
文献号 : CN111732672B
文献日 : 2020-12-18
发明人 : 刘娟 , 卢传礼 , 马年方 , 陈骏佳 , 康佩姿
申请人 : 广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)
摘要 :
本发明公开了一种具有降尿酸功效的黄秋葵聚半乳糖醛酸及其制备方法和用途。黄秋葵聚半乳糖醛酸，其平均分子量为20459Da，单糖组成是按质量比Ara:Gal:GalA=1:2:6。本发明从黄秋葵中分离制备了一种聚半乳糖醛酸‑黄秋葵聚半乳糖醛酸，其得率为3～6g/kg（纯度为85～95％），其具有降尿酸的功效，可以用于制备降尿酸药物。本发明为黄秋葵聚半乳糖醛酸的制备提供了一种新的方法，对于推动黄秋葵的高值化加工，提升农产品科技创新能力和驱动产业转型升级具有重要意义。
权利要求 :
1.黄秋葵聚半乳糖醛酸，其平均分子量为20459Da，按质量比单糖组成为Ara:Gal:GalA=1:2:6；
所述的黄秋葵聚半乳糖醛酸的制备方法如下：
将黄秋葵切碎后加入乙醇浸提，浸提后除滤液、取残渣，残渣用水高温加热浸提，收取浸提液，加入乙醇至终体积分数为60%进行沉淀，收集沉淀后得到黄秋葵粗多糖，黄秋葵粗多糖用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，先用水洗脱，然后用1M NaCl溶液洗脱，收集NaCl溶液洗脱的组分，浓缩后透析，然后干燥制得黄秋葵聚半乳糖醛酸。
2.根据权利要求1所述的黄秋葵聚半乳糖醛酸，其特征在于，所述的黄秋葵为新鲜黄秋葵果实。
3.根据权利要求1所述的黄秋葵聚半乳糖醛酸，其特征在于，所述的用水高温加热浸提是加入1～20倍质量的水中浸提1～10个小时，浸提温度为60～110 ℃。
4.根据权利要求3所述的黄秋葵聚半乳糖醛酸，其特征在于，所述的用水高温加热浸提是加入10～15倍质量的水中浸提2～4个小时，浸提温度为105 ℃。
5.权利要求1、2、3或4所述的黄秋葵聚半乳糖醛酸在制备降血尿酸药物中的应用。
说明书 :
一种具有降尿酸功效的黄秋葵聚半乳糖醛酸及其制备方法和
用途
技术领域
[0001] 本发明属于农产品加工领域，具体涉及一种具有降尿酸功效的黄秋葵聚半乳糖醛酸及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 黄秋葵是一年生草本植物，广泛种植于热带亚热带地区。黄秋葵富含矿物质、维生素、膳食纤维等营养物质与生物活性物质，对于抗疲劳、降血糖、缓解便秘、强肾补虚效果显著。黄秋葵中富含具有保健功能的多糖，其含量在25%左右，这些多糖对黄秋葵的健康功效有关键作用。目前对于黄秋葵降尿酸作用的报道多集中于黄秋葵水提物，但是这种水提物的降尿酸作用与多糖是否相关并不明确。因此有必要对黄秋葵中的活性多糖进行分离纯化，结构表征和降尿酸功能评价，这对明确黄秋葵多糖的结构和功能具有重要意义。
发明内容
[0003] 本发明的第一个目的是提供一种具有降尿酸功效的黄秋葵聚半乳糖醛酸。
[0004] 本发明发现并制备了黄秋葵中的一种主要多糖-黄秋葵聚半乳糖醛酸，其平均分子量为20459Da，单糖组成是按质量比Ara:Gal:GalA=1:2:6的聚半乳糖醛酸。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种黄秋葵聚半乳糖醛酸的制备方法，包括以下步骤：将黄秋葵切碎后加入乙醇浸提，浸提后除滤液、取残渣，残渣用水高温加热浸提，并收取浸提液，加入乙醇沉淀，收集沉淀后得到黄秋葵粗多糖，黄秋葵粗多糖用阴离子交换柱纯化，用水/NaCl溶液、Tris-HCl溶液/含NaCl的Tris-HCl溶液或磷酸盐溶液/含NaCl的磷酸盐溶液洗脱，收集NaCl溶液、含NaCl的Tris-HCl溶液或含NaCl的磷酸盐溶液洗脱的组分，浓缩后透析，然后干燥制得黄秋葵聚半乳糖醛酸。
[0006] 所述的NaCl溶液、含NaCl的Tris-HCl溶液和含NaCl的磷酸盐溶液中的NaCl浓度为1M。
[0007] 优选地，所述的黄秋葵为新鲜黄秋葵果实。
[0008] 优选地，所述的用水高温加热浸提是加入1～20倍质量的水中浸提1～10个小时，浸提温度为60～110 ℃。进一步优选为：所述的用水高温加热浸提是加入10～15倍质量的水中浸提2～4个小时，浸提温度为105 ℃。
[0009] 优选地，所述的加入乙醇沉淀，是加入乙醇至终体积分数为10%～90%进行沉淀。进一步优选为加入乙醇至终体积分数为60%进行沉淀。
[0010] 本发明评价了这种黄秋葵聚半乳糖醛酸的降尿酸功效，按200 mg/kg的剂量喂养高尿酸模型的小鼠30天后，可显著降低小鼠的血尿酸水平。
[0011] 因此，本发明的第三个目的是提供上述黄秋葵聚半乳糖醛酸在制备降尿酸药物中的应用。
[0012] 本发明的第四个目的是提供一种降尿酸药物，其含有上述黄秋葵聚半乳糖醛酸或其药用盐作为活性成分。
[0013] 本发明从黄秋葵中分离制备了一种聚半乳糖醛酸-黄秋葵聚半乳糖醛酸，其得率为3～6g/kg（纯度为85～95％），其具有降尿酸的功效，可以用于制备降尿酸药物。本发明为黄秋葵聚半乳糖醛酸的制备提供了一种新的方法，对于推动黄秋葵的高值化加工，提升农产品科技创新能力和驱动产业转型升级具有重要意义。
附图说明
[0014] 图1是黄秋葵聚半乳糖醛酸的单糖组成；图2是黄秋葵聚半乳糖醛酸的平均分子量；
图3是黄秋葵聚半乳糖醛酸的FI-IR图谱。
图3是黄秋葵聚半乳糖醛酸的FI-IR图谱。
具体实施方式
[0015] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016] 实施例1：黄秋葵聚半乳糖醛酸的制备分离、结构表征和降尿酸功能评价一、黄秋葵聚半乳糖醛酸的制备分离（1）选取新鲜黄秋葵（果实，下同），用蒸馏水洗净、晾干、切碎。
[0017] （2）浸提：将切碎后的黄秋葵碎片在室温下用乙醇浸提7天。
[0018] （3）提取粗多糖：收集乙醇浸提后的残渣，加入10倍的去离子水，105℃处理加热浸提2小时。采用三层纱布过滤，除去残渣，得到滤液。在滤液中加入乙醇至终浓度体积分数为60%，于4 ℃冷藏12小时，离心取醇沉淀。将沉淀物真空抽滤，去除残留的乙醇，真空冷冻干燥，得到固体即为黄秋葵粗多糖。
[0019] （4）纯化：黄秋葵粗多糖用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，以水/NaCl溶液为洗脱溶剂，先用水洗脱，然后用1M NaCl溶液洗脱，洗脱体积分别为10个柱体积。收集NaCl溶液洗脱的组分，浓缩后用自来水流水透析，真空冷冻干燥，即得到黄秋葵聚半乳糖醛酸。
[0020] 用此方法制备的黄秋葵聚半乳糖醛酸产率为5g/kg，纯度为95％。
[0021] 二、黄秋葵聚半乳糖醛酸的结构表征实验方法：
（1）单糖组成分析：取干净的色谱瓶，精确称量黄秋葵聚半乳糖醛酸样品5mg（±
0.05mg），加入配置好的TFA酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。采用离子色谱（ICS5000，Thermo Fisher Scientific），检测器为电化学检测器，流速为0.5 ml/min。流动相组成A相：ddH2O；
B相：100mM NaOH；C相：100mM NaOH / 200mM NaAC。梯度洗脱程序如下：0-25min， A维持在
97.5%，B维持在2.5%；25-40 min, A从97.5%线性变化至77.5%，B维持在2.5%，C从0线性变化至20%；40-50.1min, A从77.5%线性变化至97.5%，B维持在2.5%，C从20%线性变化至0；50.1-
60 min, A维持在97.5%，B维持在2.5%。采用外标法定量，通过配制不同浓度标样来制定标准曲线，样品中各组分含量（μg/mg）=C*V*F/M；其中C为仪器读取浓度；V为样品提取液体积（1ml）；F为稀释因子（10）；M为样品称取总量。
（1）单糖组成分析：取干净的色谱瓶，精确称量黄秋葵聚半乳糖醛酸样品5mg（±
0.05mg），加入配置好的TFA酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。采用离子色谱（ICS5000，Thermo Fisher Scientific），检测器为电化学检测器，流速为0.5 ml/min。流动相组成A相：ddH2O；
B相：100mM NaOH；C相：100mM NaOH / 200mM NaAC。梯度洗脱程序如下：0-25min， A维持在
97.5%，B维持在2.5%；25-40 min, A从97.5%线性变化至77.5%，B维持在2.5%，C从0线性变化至20%；40-50.1min, A从77.5%线性变化至97.5%，B维持在2.5%，C从20%线性变化至0；50.1-
60 min, A维持在97.5%，B维持在2.5%。采用外标法定量，通过配制不同浓度标样来制定标准曲线，样品中各组分含量（μg/mg）=C*V*F/M；其中C为仪器读取浓度；V为样品提取液体积（1ml）；F为稀释因子（10）；M为样品称取总量。
[0022] （2）平均分子量测定：黄秋葵聚半乳糖醛酸平均分子量测定采用高效凝胶渗透色谱（LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan），检测器为折射率检测器。凝胶色谱柱G6000PWXL, G5000PWXL和G3000PWXL（Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany）纵向连接，分子量范围为5.22-150 kDa的右旋糖酐用于制作校准曲线，根据保留时间测算平均分子量。
[0023] （3）FI-IR分析：干燥的黄秋葵聚半乳糖醛酸样品利用傅里叶红外光谱仪Tensor 27测定其红外光谱（ATR），光谱范围是4000-650 cm-1。
[0024] 实验结果：如图1所示，黄秋葵聚半乳糖醛酸可溶于水，其单糖组成为按质量比Ara:Gal:GalA=1:
2:6。
2:6。
[0025] 如图2，经过凝胶色谱测定（图2中的第一个峰，即50-60min之间的峰），黄秋葵聚半乳糖醛酸的平均分子量为20459 Da。
[0026] 如图3，在黄秋葵聚半乳糖醛酸的FI-IR图谱中，3302 cm−1的吸收峰是羟基的伸缩振动峰，1602 cm−1的吸收峰是不对称拉伸峰，1031 cm−1的强吸收是(C-OH)侧基的伸缩振动和(C-O-C)糖苷键的振动，表示在每个多糖中含有一个吡喃糖单位。
[0027] 三、黄秋葵聚半乳糖醛酸的降尿酸功能评价（1）实验动物：C57BL/6小鼠（16.7 20.4 g，6-7周龄）由广东省医学实验动物中心提供，~
对购入动物检疫4 d，采用12h:12h昼夜间断照明，饲养室条件始终保持稳定，动物自由进食饮水。
对购入动物检疫4 d，采用12h:12h昼夜间断照明，饲养室条件始终保持稳定，动物自由进食饮水。
[0028] （2）实验设计：实验按体重分为阴性对照组（正常小鼠）、模型对照组（高尿酸小鼠）、阳性对照组（高尿酸小鼠+别嘌醇片）、低剂量组（高尿酸小鼠+黄秋葵聚半乳糖醛酸50 mg/kg体重）、高剂量组（高尿酸小鼠+黄秋葵聚半乳糖醛酸200 mg/kg体重），6只/组。各受试样品组小鼠每天按20 mL/kg体重灌胃相应剂量的受试样品溶液，阳性对照组灌胃5 mg/mL的别嘌醇片药液，阴性对照组及模型对照组灌胃等体积纯净水，1次/天，低、高剂量定为每天50 mg/kg体重、200 mg/kg体重，用纯净水溶解受试样品。连续给药30天。
[0029] 具体分组情况如下表1所示：表1 OP1降尿酸实验剂量设计与分组情况表
OP1为黄秋葵聚半乳糖醛酸
受试样品OP1配制方法：分别称取45 mg受试黄秋葵聚半乳糖醛酸，加适量纯净水混匀，补足纯净水至4.5 mL，得10 mg/mL的受试样品高剂量溶液，用前摇匀。吸取高剂量溶液0.9 mL，加纯净水至3.6 mL混匀，得2.5 mg/mL的受试样品低剂量溶液，用前摇匀。
OP1为黄秋葵聚半乳糖醛酸
受试样品OP1配制方法：分别称取45 mg受试黄秋葵聚半乳糖醛酸，加适量纯净水混匀，补足纯净水至4.5 mL，得10 mg/mL的受试样品高剂量溶液，用前摇匀。吸取高剂量溶液0.9 mL，加纯净水至3.6 mL混匀，得2.5 mg/mL的受试样品低剂量溶液，用前摇匀。
[0030] 5 mg/mL别嘌醇片混悬液：取1片别嘌醇片（有效成份0.1g/片）研磨成粉后，加入适量0.5% CMC-Na，研磨均匀，再加入0.5% CMC-Na溶液至20 mL混匀，得5 mg/mL的别嘌醇片混悬液，用前摇匀。
[0031] （3）高尿酸小鼠模型构造：末次给药当天，阴性对照组按10 mL/kg体重腹腔及皮下注射0.5% CMC-Na溶液，其余各组小鼠按10 mL/kg体重腹腔注射50 mg/mL的次黄嘌呤溶液（剂量为500 mg/kg体重）以及皮下注射25 mg/mL的氧嗪酸钾溶液（剂量为250 mg/kg体重），造模30 min后末次灌胃给药。
[0032] 0.5% CMC-Na溶液：准确称量5.0 g CMC-Na，磁力搅拌器室温边搅拌边缓慢加入装有约800mL纯净水的烧杯中，搅拌至溶解，过夜，第二天量筒中定容至1000mL后混匀。
[0033] 50 mg/mL次黄嘌呤：称取适量次黄嘌呤于研钵中，加入适量0.5% CMC-Na溶液，研磨混匀，再加入0.5% CMC-Na溶液使成50 mg/mL，用前摇匀；25 mg/mL氧嗪酸钾：称取适量氧嗪酸钾于研钵中，加入适量0.5% CMC-Na溶液，研磨混匀，再加入0.5% CMC-Na溶液使成25 mg/mL，用前摇匀。
[0034] （4）指标检测：末次给药3 h后，各组小鼠异氟烷吸入麻醉后摘眼球取血，3000 rpm，离心10 min取血清分装，全自动生化分析仪检测血尿酸、血肌酐、血清尿素氮含量，试剂盒检测XOD活性。
[0035] 实验结果如表2，将黄秋葵聚半乳糖醛酸按低剂量组（50 mg/kg）和高剂量组（200 mg/kg）喂养高尿酸模型小鼠30天，并设置阴性对照组、模型对照组、阳性对照组，与模型对照相比，高剂量组处理可显著降低小鼠血尿酸水平；高剂量组处理与阴性对照和阳性对照相比无统计学差异，说明200 mg/kg黄秋葵聚半乳糖醛酸（OP1）喂养小鼠30天，其降尿酸能力和药物（别嘌醇片）相当，且可使高尿酸小鼠的血尿酸将至与正常小鼠相近。
[0036] 表2黄秋葵聚半乳糖醛酸（OP1）给药30天降尿酸试验期间各组小鼠血尿酸、血肌酐、血清尿素氮、XOD（平均值±标准差，n=6）注：1、阴性对照组与模型对照组进行T检验；2、与模型对照组比较，各项指标数据均采用方差分析，其中血清尿素氮进行log转换；3、与阴性对照组相比，“#”P<0.05，“##”P<0.01；
与模型对照组相比，“*”P<0.05，“**”P<0.01。
与模型对照组相比，“*”P<0.05，“**”P<0.01。
[0037] 实施例2：（1）浸提：将切碎后的黄秋葵（果实）碎片在室温下用乙醇浸提7天。
[0038] （2）提取粗多糖：收集乙醇浸提后的残渣，加入15倍的去离子水，105℃处理加热浸提4小时。采用三层纱布过滤，除去残渣，得到滤液。在滤液中加入乙醇至终浓度体积分数为20%，于4 ℃冷藏12小时，离心取醇沉淀。将沉淀物真空抽滤，去除残留的乙醇，真空冷冻干燥，得到固体即为黄秋葵粗多糖。
[0039] （3）纯化：黄秋葵粗多糖用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，以水/NaCl溶液为洗脱溶剂，先用水洗脱，然后用1M NaCl溶液洗脱，洗脱体积分别为10个柱体积。收集NaCl溶液洗脱的组分，浓缩后用自来水流水透析，真空冷冻干燥，即得到黄秋葵聚半乳糖醛酸（结构同实施例1）。
[0040] 用此方法制备的黄秋葵聚半乳糖醛酸产率为3g/kg，纯度为90％。
[0041] 实施例3：（1）浸提：将切碎后的黄秋葵（果实）碎片在室温下用乙醇浸提7天。
[0042] （2）提取粗多糖：收集乙醇浸提后的残渣，加入10倍的去离子水，105℃处理加热浸提2小时。采用三层纱布过滤，除去残渣，得到滤液。在滤液中加入乙醇至终浓度体积分数为60%，于4 ℃冷藏12小时，离心取醇沉淀。将沉淀物真空抽滤，去除残留的乙醇，真空冷冻干燥，得到固体即为黄秋葵粗多糖。
[0043] （3）纯化：黄秋葵粗多糖用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，以磷酸盐溶液（pH7.0）/NaCl溶液为洗脱溶剂，先用磷酸盐溶液（pH7.0）洗脱，然后用含1M NaCl的磷酸盐溶液（pH7.0）洗脱，洗脱体积分别为10个柱体积。收集含1M NaCl的磷酸盐溶液（pH7.0）洗脱的组分，浓缩后用自来水流水透析，真空冷冻干燥，即得到黄秋葵聚半乳糖醛酸（结构同实施例1）。
[0044] 用此方法制备的黄秋葵聚半乳糖醛酸产率为4g/kg，纯度为85％。
[0045] 实施例4：（1）浸提：将切碎后的黄秋葵（果实）碎片在室温下用乙醇浸提7天。
[0046] （2）提取粗多糖：收集乙醇浸提后的残渣，加入10倍的去离子水，105℃处理加热浸提2小时。采用三层纱布过滤，除去残渣，得到滤液。在滤液中加入乙醇至终浓度体积分数为60%，于4 ℃冷藏12小时，离心取醇沉淀。将沉淀物真空抽滤，去除残留的乙醇，真空冷冻干燥，得到固体即为黄秋葵粗多糖。
[0047] （3）纯化：黄秋葵粗多糖用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，以Tris-HCl（pH=8.0）/NaCl溶液为洗脱溶剂，先用Tris-HCl（pH=8.0）溶液洗脱，然后用含1M NaCl的Tris-HCl（pH=8.0）溶液洗脱，洗脱体积分别为10个柱体积。收集含1M NaCl的Tris-HCl（pH=8.0）溶液洗脱的组分，浓缩后用自来水流水透析，真空冷冻干燥，即得到黄秋葵聚半乳糖醛酸（结构同实施例1）。
[0048] 用此方法制备的黄秋葵聚半乳糖醛酸产率为4.5g/kg，纯度为90％。