一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法转让专利
申请号 : CN202010750323.8
文献号 : CN111733138B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 朱志军 , 王学斌 , 孙丽莹
申请人 : 首都医科大学附属北京友谊医院
摘要 :
权利要求 :
1.一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述方法步骤如下:(1)样本纯化:将患者全血样本与分选磁珠混合孵育,所述磁珠与全血中的靶标细胞结合;磁珠孵育后的全血样本经过微流控芯片的纯化结构区去除小于分选临界半径的细胞;
(2)细胞聚焦:将步骤(1)纯化后的样本进行细胞聚焦,将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置,小于分选临界半径的细胞仍保持原路径;
(3)磁力分选:将步骤(2)经过细胞聚焦后的样本进行磁珠分选,磁珠结合细胞在磁力架的吸引下分流至磁珠细胞收集口进行收集,非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞收集口流出进行收集,从而完成对循环肿瘤细胞的分选;
所述分选方法利用微流控芯片进行,所述微流控芯片包括进样部(1)、微流控分选区(2)和出样部(3),所述微流控分选区(2)为封闭的腔式结构,所述进样部(1)和所述出样部(3)分别与所述微流控分选区(2)两端连接;所述进样部(1)包括血液样本进样口(11)和缓冲液进液口(12);所述出样部(3)包括磁珠细胞收集口(31)和非磁珠细胞收集口(32);其特征在于:
所述微流控分选区(2)包括三个互相连通的结构区,分别为纯化结构区(21)、细胞聚焦结构区(22)及磁珠分选结构区(23);所述进样部(1)与纯化结构区(21)首端连接,所述细胞聚焦结构区设于所述纯化结构区(21)及磁珠分选结构区之间,所述磁珠分选结构区(23)尾端与所述出样部(3)连通;
所述步骤(1)样本纯化是通过纯化结构区(21)进行的,所述纯化结构区(21)设有用于去除全血样本中红细胞及血小板的初滤结构,所述纯化结构区(21)还设有废液出口(218);
所述步骤(2)细胞聚焦是通过细胞聚焦结构区(22)进行的,所述细胞聚焦结构区(22)由两根并排设置且相互独立的聚焦分支通路(221)构成;两根所述聚焦分支通路(221)以所述细胞聚焦结构区(22)的轴线为对称轴相互镜像对称设置,所述聚焦分支通路(221)的顶面外壁为水平顶壁(222),该顶面的内壁设有若干线型凸棱(223),各凸棱(223)平行设置且与所述对称轴呈设定角度地倾斜设置;
所述步骤(3)磁力分选是通过磁珠分选结构区(23)进行的,所述磁珠分选结构区(23)的两侧对称设有可吸引磁珠的磁铁(231);
所述各个凸棱(223)与所述对称轴倾斜设置夹有锐角,其中所述锐角朝向于所述磁珠分选结构区(23);
所述锐角角度为60°-70°;
所述凸棱(223)的条件参数为:d<Hg≤2d、Ht>Hg、Dob>2d≥Lob;所述d为聚焦细胞的直径,Hg为凸棱(223)与底面的垂直距离,Ht为凸棱(223)的高度,Dob为凸棱(223)之间的水平距离,Lob为凸棱(223)的水平宽度。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述靶标细胞为循环肿瘤血细胞或白细胞。
3.如权利要求1的所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述磁珠直径大于5μm小于10μm。
4.如权利要求1的所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述步骤(1)中分选临界半径为5μm。
5.如权利要求1的所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述步骤(2)中分选临界半径为10μm。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述聚焦分支通路(221)的宽度大于等于400μm;长度大于等于1.5cm。
7.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述细胞聚焦结构区(22)的中心区域对应所述非磁珠细胞收集口(32),所述中心区域的两侧区域对应所述磁珠细胞收集口(31),所述中心区域为细胞聚焦结构区(22)的对称轴向两侧延伸至总宽度的1/2区域。
8.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述聚焦分支通路(221)的底面为平壁;所述聚焦分支通路(221)的两个侧壁与底面的所述平壁垂直。
9.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述聚焦分支通路(221)首端设有第二栅状结构(224)。
10.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述纯化结构区(21)由两根并排设置且相互独立的纯化分支通路(211)构成;所述两根纯化分支通路(211)以所述纯化结构区(21)轴线为对称轴相互镜像对称设置;
所述纯化分支通路(211)内部设有微柱阵列(212),所述微柱阵列(212)与所述纯化分支通路(211)内侧壁(213)之间具有间隙,该间隙形成靶标细胞通路(214);所述微柱阵列(212)由若干微柱行(215)平行排列构成,所述微柱行(215)由若干微柱(216)排列而成;所述微柱行(215)首端远离所述纯化结构区(21)轴线、尾端靠近所述纯化结构区(21)轴线并按设定角度倾斜设置;所述微柱(216)的径向截面为卵形,所述卵形的直径为28~33μm,所述卵形的对称直径为20~25μm;所述同一微柱行(215)中相邻两微柱(216)的卵心距为40~
45μm,所述相邻两微柱行(215)之间的最小卵心距为60~65μm。
11.如权利要求10所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述微柱行(215)的倾斜设定角度为1.5~2.5°。
12.如权利要求10所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述纯化分支通路(211)的宽度为1~2mm,所述微柱阵列(212)的长度是3~4cm,高度为20~30μm。
13.如权利要求10所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述血液样本进样口(11)和所述缓冲液进液口(12)同时连接两根纯化分支通路(211)的首端;所述纯化分支通路(211)的首端内还设有栅状结构区(217)。
14.如权利要求10所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述两根纯化分支通路(211)的微柱阵列(212)尾端连接废液出口(218),所述微柱阵列(212)和废液出口(218)之间还设有栅状结构区(217);所述靶标细胞通路(214)尾端与细胞聚焦结构区(22)连通。
15.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述血液样本进样口(11)通过一分流进样管(13)与所述纯化结构区(21)微柱阵列(212)首端连通,用于将血液样本通过所述分流进样管(13)分流至所述纯化结构区(21)两侧的微柱阵列(212)内。
16.如权利要求15所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述分流进样管(13)内设有第一栅状结构(131)。
17.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述磁珠分选结构区(23)为锥形结构由首端至尾端宽度逐渐增加。
18.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述磁珠分选结构区(23)的长度大于等于4cm;所述磁珠分选区的尾端宽度为首端宽度的3倍。
19.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述磁珠分选结构区(23)两侧的磁铁(231)的N极靠近所述磁珠分选结构区(23),S极远离所述磁珠分选结构区(23)。
20.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述出样部(3)的非磁珠细胞收集口(32)通过非磁珠细胞收集管(321)与所述磁珠分选结构区(23)中央连通;所述磁珠细胞收集口(31)通过一磁珠细胞分流管(311)与磁珠分选结构区(23)两侧连通。
21.如权利要求1至20中任意一项所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述分选方法利用微流控芯片系统进行,所述微流控芯片系统由权利要求1至20中任意一项所述的微流控芯片并联而成。
22.根据权利要求21所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法,其特征在于,所述微流控芯片系统中血液进样口及缓冲液进样口为上下叠放双通道结构;纯化结构区(21)的废液出样口与出样通道为上下叠放双通道结构,非磁珠标记细胞出样口和磁珠标记细胞出样口为上下叠放双通道结构。
说明书 :
一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法
技术领域
背景技术
原因之一是癌细胞可以轻易进入并通过血液传播。在手术切除之前,这些患者的血液中可
能已经存在该类游离肿瘤细胞。
念。CTC是指从原发性肿瘤脱离,并进入患者淋巴系统、血液循环的部分癌细胞。这部分细胞
在患者接受手术前有可能已经存在于血液循环中,手术操作有可能促使更多的CTC进入血
液循环从而加速肿瘤转移。随着近年研究的深入,CTC 的应用逐渐成为抗癌治疗的热点,被
人们称为“液体活检”,众多研究发现,CTC 不仅可作为早期诊断肿瘤的新型标志物,亦可以
作为术后检测肿瘤复发转移的灵敏指标之一,通过提取研究患者血液中的CTC,有望为患者
提供个性的治疗方案,并彻底阻断肿瘤的转移复发途径,同时也是实现CTC体外培养和药敏
实验的基础。CTC的捕获具有一定难度,主要难点在于该细胞性质的特殊,CTC的含量极低,
细胞本身活性差,难以高效提取并保持足够活性于下一阶段实验。
CellSearch系统,是少数由美国FDA批准的用于CTC提取的系统之一,根据使用靶向上皮细
胞粘附的抗体分子(EpCAM)来特异性识别CTC。然而CellSearch系统还存在一些缺陷,例如
CellSearch系统无法实现全自动分选以及智能捕获EpCAM阳性细胞,由于CTC在人体内时刻
发生着改变,当其发生上皮-间质样变时,其表面EpCAM抗原消失,使依据识别该抗体的CTC
提取系统失效,且该种方法提取的细胞通常活性较差,极大限制了后期实验。阴性富集法原
理与阳性富集法相反,采取各种手段去除全血中的背景细胞收集剩余细胞即为CTC,例如目
前广泛使用的密度梯度离心法进行CTC分离,基于血细胞之间密度的差异,去除全血中红细
胞,血小板,白细胞等背景细胞得到CTC,该类方法具有快速、直接、非抗原依赖性及操作简
单,可保持提取细胞活性等优点,但同时该方法操作步骤多、提取率及纯度均较低,因为血
液样本中一些体积与CTC近似的背景细胞例如白细胞等残留细胞无法精准分离,将会影响
后续CTC的培养及药敏实验等研究,因此存在CTC提取效率低,纯度低等缺陷。
控芯片具有快速、高效、全程无需离心、细胞损害更小等优点,并在后续的临床实验中,证实
了该捕获系统可成功捕获患者外周循环血液中的CTC。但是,发明人在实验研究的过程中也
发现该分选设备及方法存在诸多问题。首先,该微流控芯片的主要作用是去除背景细胞,经
过该微流控芯片的样本仍需要依赖现有商品化的磁力分选设备进行CTC的分选,从而使得
整套系统体积偏大,实验成本偏高,转接管路繁琐;其次,现有的成熟磁珠细胞分选设备结
构多为磁柱样结构,在实验中,该结构分选受流量限制,无法短时间内通过大量液体。第三,
在分选过程中,由于所有细胞在无序状态下进行磁力分选,分选效率差,且磁柱中会残留一
部分细胞,造成CTC的损失;第四,虽然该方法对白细胞、红细胞、血小板的平均清除率较高,
但剩余背景细胞相对于CTC数量来讲仍然过大,仍需要提高提取纯度。
发明内容
径的细胞;
珠细胞收集口流出进行收集,从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
别与所述微流控分选区两端连接;所述进样部包括血液样本进样口和缓冲液进液口;所述
出样部包括磁珠细胞收集口(31)和非磁珠细胞收集口;其中,
述纯化结构区及磁珠分选结构区之间,所述磁珠分选结构区尾端与所述出样部连通;
轴线为对称轴相互镜像对称设置,所述聚焦分支通路的顶面外壁为水平顶壁,该顶面的内
壁设有若干线型凸棱,各凸棱平行设置且与所述对称轴呈设定角度地倾斜设置;
离,Lob为凸棱的水平宽度。
向两侧延伸至总宽度的1/2区域。
微柱行由若干微柱排列而成;所述微柱行首端远离所述纯化结构区轴线、尾端靠近所述纯
化结构区轴线并按设定角度倾斜设置;所述微柱的径向截面为卵形,所述卵形的直径为28
~33μm,所述卵形的对称直径为20~25μm;同一微柱行中,相邻两微柱的卵心距为40~45μ
m,所述相邻两微柱行之间的最小卵心距为60~65μm。
通。
样口和磁珠标记细胞出样口为上下叠放双通道结构。
如果使用白细胞特异性抗体包被的磁珠,则为阴性富集法捕获CTC,CTC由非磁珠细胞收集
口获得。
获率为85.2±1.2%,正性富集模式捕获率为85.0±1.0%。
的循环肿瘤细胞活性差的问题,为后续实验提供了有力的支撑。
选的有效率,使磁珠附着细胞和非磁珠附着细胞分离效果更好,提高CTC纯度。同时可以减
小芯片磁力分选结构区的长度和宽度。在阴性富集情况下,聚焦步骤还可以起到二次去除
由步骤(1)残留的微量红细胞及血小板。
附图说明
具体实施方式
描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻
全面。
体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相
关的所列项目的任意的和所有的组合。
径的细胞;
珠细胞收集口流出进行收集,从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
片的细胞聚焦结构区22实现的,步骤(3)的磁力分选步骤是利用下述微流控芯片的磁珠分
选结构区23实现的。
后进行过滤和分选。因此,进样部1作为血液样本的进样通道,出样部3作为目的细胞出样通
道,二者分别与微流控分选区2两端连接。在血液样本进样的同时还需同时注入缓冲液帮助
血液样本的流动,因此,进样部1包括血液样本进样口11和缓冲液进液口12。出样部3用于分
流不同的收获细胞,因此出样部3包括磁珠细胞收集口31和非磁珠细胞收集口32。患者全血
样本经磁珠孵育后由进样部1进入芯片的微流控分选区2内,经微流控分选区2过滤及分选
后磁珠细胞及非磁珠细胞分别由出样部3的磁珠细胞收集口31和非磁珠细胞收集口32流出
进行收集。
流体方向。进样部1与纯化结构区21首端连接,细胞聚焦结构区22首端与纯化结构区21尾端
连通,细胞聚焦结构区22的尾端与磁珠分选结构区23首端连通,磁珠分选结构区23尾端与
出样部3连通。磁珠孵育的全血样本先经过纯化结构区21纯化,纯化的目的是去除全血样本
中的红细胞及血小板等小直径细胞,纯化后的样本进入细胞聚焦结构区22,在细胞聚焦结
构区22中会按该通路的分选临界半径将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置,使
其按照直线路径在中央位置流入磁珠分选结构区23,在磁珠分选结构区23,按照直线位置
流入的细胞继续按直线位置流入非磁珠细胞收集管321,磁珠结合细胞在流道磁场吸引下
由两侧的磁珠细胞收集管流出。
区21轴线为对称轴相互镜像对称设置;
壁,纯化分支通路211内部设有微柱阵列212,所述微柱阵列212与纯化分支通路211内侧壁
213之间具有间隙,该间隙形成靶标细胞通路214;微柱阵列212由若干微柱行215平行排列
构成,微柱行215由若干微柱216排列而成;微柱216与纯化分支通路211的顶面和底面固定
连接。微柱行215倾斜设置,具体倾斜设置方式为微柱行215首端远离所述纯化结构区21轴
线、尾端靠近纯化结构区21轴线并按设定角度倾斜设置,倾斜角度为微柱行215与纯化结构
区21轴线之间的角度,也可以理解为微柱行215与靶标细胞通路214之间的夹角。
微柱行215之间的最小卵心距D为60~65μm。上述数值范围为可行且较佳的数值范围,在本
发明的一个实施例中,采用的具体数据为:卵形的直径B推荐范围为31μm,卵形的对称直径A
推荐为23μm;同一微柱行215中相邻两微柱216的卵心距C为41μm,相邻两微柱行215之间的
最小卵心距D为62μm。
柱阵列212的长度是3cm,高度为20μm。根据实际需要,在本发明所述参数范围内也是可行
的。
小于5μm的细胞将会沿原有方向流动,不会改变流动方向。
连接纯化结构区21首端的两外侧,用于将血液样本分流至纯化结构区21两侧的微柱阵列
212内。缓冲液进液口12与纯化结构区21中央位置连接,缓冲液可通过该进液口流入两纯化
分支通路211内,纯化分支通路211的首端内还设有栅状结构区217。栅状结构区217设置的
目的是保证流体按照一定方向进入芯片,同时防止异物进入芯片,因此栅状结构区为若干
栅栏构成,栅栏与纯化结构区21轴线平行设置,因此可使流体按照与所述轴线平行方向流
入纯化结构区21内。
结构区22连通。
程中流体细胞的流入方向按设定方向流动,以及防止异物进入芯片。
过前结构区域后流道杂乱的白细胞及CTC细胞聚焦于芯片流道中央,并沿直线稳定流入下
一结构区域,达到聚焦效果。该部分结构设计与第三结构区域—磁珠分选结构区23设计呼
应,具体呼应为:细胞聚焦结构区22的中心区域对应所述非磁珠细胞收集口32,所述中心区
域的两侧区域对应所述磁珠细胞收集口31,所述中心区域为所述对称轴向两侧延伸至总宽
度的1/2区域。如果取消第二结构,将会产生①由第一结构区—纯化结构区21分选后的细胞
将杂乱的进入第三结构区并由最终细胞收集口流出,每个收集口得到的均为混合细胞,无
法完成磁力分选。②该结构聚焦效果直接影响第三结构区的长度与宽度。聚焦效果越好,非
磁珠附着细胞与磁珠附着细胞分离效果越明显,第三结构区域所需流道长度越短,所需流
道宽度越窄。③在阴性富集模式下,该结构还起到二次去除由纯化结构区21残留的微量红
细胞及血小板作用,因其直径小无法被该结构区域聚焦,最终由磁珠细胞收集口31流出,不
会影响由非磁珠细胞收集口32流出的CTC的纯度。
示,聚焦分支通路221的顶面的外壁为水平顶壁222,顶面的内壁向底面方向设有若干凸出
的凸棱223,凸棱为矩形片状凸棱,各凸棱之间平行设置且与细胞聚焦结构区22的对称轴之
间夹有锐角α,锐角α朝向磁珠分选结构区23。α角度推荐为60°~70°。在本发明的实施例中,
锐角α角度为70°。上述结构的参数直接影响细胞聚焦效果,如图15所示,本发明的一个实施
例中凸棱的参数:d<Hg≤2d、Ht>Hg、Dob>2d≥Lob;所述d为聚焦细胞的直径,Hg为凸棱与
底面的垂直距离,Ht为凸棱的高度,Dob为凸棱之间的水平距离,Lob为凸棱的水平宽度。此
处所述的水平距离为水平线距离。
等于800μm。在本发明的实施例中,聚焦分支通路221的宽度为600μm,W为1200;长度理论上
是越长越好。为了减小体积,本发明的实施例中采用长度为1.5cm。
侧,所述内侧为两聚焦分支通路221相邻一侧,其他细胞,即小于10μm的细胞仍然按原路径
行驶,且最终根据细胞直径大小的不同将目的细胞稳定于固定位置流出该结构区域。聚焦
分支通路221的底面为平壁,两个侧壁与底面垂直。
胞按细胞直径大小将大直径细胞尽可能排成一列直线或汇集于一个区域。
实验发现,此类结构在低流量时可很好发挥作用,但随着进样速度不断提高,进样速度约为
80μL/min时,狭窄管道所承受的压力明显高于其他部分而使芯片结构爆裂,无法满足分选
CTC高通量的要求。而采用本发明提供的结构方案后,仅就该结构来说,最快流速可高达
1ml/min而不爆裂,进样速度较前设计快约12.5倍。
平行设置。悬浮细胞在上述微结构诱导的压力场影响下运动,通过利用微通道中的倾斜障
碍物,产生垂直于流体流动方向的横向压力梯度,使得微粒可以沿着由梯度引起的横向流
偏转和排列,利用该原理,实现某一直径细胞的聚焦效果。图11A为倾斜设置的凸棱,其倾斜
后夹有锐角,锐角朝向磁珠分选结构区23。图11B和图11C为鱼骨结构,鱼骨结构为两具有凸
棱的顶壁对称连接设置,两顶壁具有夹角。图11B的夹角朝向磁珠分选结构区23。图11C的夹
角朝向初滤通路。图11D为本发明所提供的最终保护结构。对各结构考核的要求为,当细胞
流经该结构时,会向芯片中央聚集,且最终根据细胞直径大小稳定于芯片固定位置流出该
结构,实现细胞聚焦作用,且聚焦效果与样本流速无关,可实现设备高通量要求,且还可间
接实现红细胞及血小板的二次去除。
片中央的液体流动方式不同于单独结构,细胞更倾向于向芯片两侧聚集,无法达到将细胞
聚集于芯片中央的目的。因此,发明人在图11B的基础上,将进入芯片的流体分为单独的两
部分,彼此互不干涉,如图12所示,荧光显微镜下使用15um红色微球和5um绿色微球进样,轨
迹图片如图12所示,可见红色微球(图中R所示)聚焦到通路中央位置,稳定流出该结构区
域,绿色微球(图中G位置)按原路径流出,实验证明本发明提供的方案可以达到非常好的聚
焦效果,将第一结构区纯化后杂乱的细胞按大小进行目的细胞的聚焦,优秀的聚焦效果增
加了非磁珠附着细胞与磁珠附着细胞分离效果,由此可减小第三结构区域所需流道长度及
所需流道宽度。优秀的聚焦效果,在阴性富集模式下,还起到了二次去除由纯化结构区21残
留的微量红细胞及血小板作用,因其直径小无法被该结构区域聚焦,最终由磁珠细胞收集
口31流出,不会影响由非磁珠细胞收集口32流出的CTC的纯度。
端,所述长轴与所述细胞聚焦结构区22的长轴平行设置,此结构的目的是保证样本流入过
程中流体细胞的流入方向按栅柱设定方向流动。
分别进入不同出样口达到分选目的,该区域设计要保证从第二阶段流出的细胞沿原有路径
继续沿直线前进,不能改变原有流道。
的情况下,通过的细胞不能因流道原因改变流动路径,即保持直线运动,且尽可能让细胞流
动速度减慢获得足够偏转时间。具体结构见图10A至图10E,发明人设计了多种流道结构以
验证每种流道的效果,该部分难点在于,想要增加流道宽度,势必引起流道内流束方向变
化,如何选取由狭窄流道过渡为较宽流道的设计方案成为难点。为此发明人尝试了多种设
计方案: 图10A、图10C和图10E为单侧增宽型流道,区别在于图10A为缓慢增宽,图10C和图
10E为迅速增宽,经过实验发现,细胞通过该两种方式进入流道,均会改变流道向增宽侧偏
移,且沿流道垂直方向上混乱排列,无法达到要求,该设计方式失败。图10B和图10D为双侧
增宽型流道,其中图10B为缓慢增宽,图10D为迅速增加。但通过实验发明人发现,此设计方
式,只能保证由原先流道中部流入的细胞沿直线减速前进,但位于边缘的细胞仍会分别向
两侧改变流动方向,最终形成大致三条流束,因此该实验方式也无法满足设计要求。
宽度,经实验发现,该设计可保证流入细胞,大致沿直线运动,且具有明显减速效果。此方案
为最佳方案。
影响效果的同时尽可能减小体积,本发明的实施例设计为4cm;磁珠分选区的尾端宽度为首
端宽度的3倍。
且较易获得等优点。磁铁231位于磁珠分选结构区23外部,两磁铁231均是N极靠近磁珠分选
结构区23,S极远离磁珠分选结构区23。所述磁铁231为镂空的矩形磁铁框。
U型结构,两端部连接磁珠分选结构区23,此结构可以将磁铁231吸引的磁珠结合细胞通过
磁珠细胞分流管311分流后由磁珠细胞收集口31流出进行收集。非磁珠细胞收集口32通过
非磁珠细胞收集管321与所述磁珠分选结构区23中央连通,用于收集没有与磁珠结合的细
胞。
血液进样口及缓冲液进样口可以设计为上下叠放双通道;纯化结构区21的废液出样口与出
样通道也可以设计为上下叠放双通道结构,非磁珠标记细胞出样口和磁珠标记细胞出样口
也可以设计为上下叠放双通道结构。
为含有红细胞和血小板的废液,d为收集的磁力细胞,e为收集的非磁力细胞。
纯化分支通路211的微柱阵列212内,同时缓冲液通过所述缓冲液进液口12同时进入所述纯
化分支通路211内;所述样本流经微柱阵列212时,大于分选临界半径的细胞与所述微柱碰
撞发生侧向位移向靶标细胞通路214一侧汇聚流入所述细胞聚焦结构区22内;小于分选临
界半径的细胞与所述微柱216发生碰撞后不发生侧向位移,按原路径流过所述微柱阵列212
后通过所述废液出口218流出芯片;
选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置保持直线形流入所述磁珠分选结构区23内;小于分
选临界半径的细胞仍保持原路径流入所述磁珠分选结构区23内;
管311分流至磁珠细胞收集口31进行收集,非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞
收集管321,由非磁珠细胞收集口32流出进行收集,从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
控芯片为阳性富集法特异性捕获CTC,且CTC由磁珠细胞收集口31获得;如果使用白细胞特
异性抗体包被的磁珠,则该微流控芯片为阴性富集法捕获CTC,CTC由非磁珠磁暴收集口获
得。
提供足够的力使细胞偏转,而过大的磁珠则可能受力过强而使附着细胞破裂或堵塞流道。
发明人试验了直径1μm,2μm,5μm和10μm的磁珠,最终实验结果表明,选用直径≥5μm且≤10μ
m的磁珠可较好达到实验目的。
成活率。
需要的人体外周血来源于健康志愿者。所有志愿者均签写书面知情同意书,并通过伦理委
员会授权,遵守赫尔辛基宣言。
可选用CD45磁珠及CD16磁珠联合使用,阳性富集模式可选择EpCAM磁珠)将样品和缓冲液分
别以不同的流速注入样品和缓冲液入口,使用荧光显微镜计数出样口肿瘤细胞系细胞以选
择最佳流速,然后发明人使用等式计算最佳回收效率R(阴性富集模式下R=C1V1/(C1V1 +
C2V2+ C3V3);阳性富集模式下R=C2V2/(C1V1 + C2V2+ C3V3),其中C1和V1表示非磁珠标
记细胞出样通道的浓度和溶液体积,C2和V2表示磁珠标记细胞出样通道的浓度和溶液体
积,C3和V3表示废液流出通道的浓度和溶液体积。重复若干次。
下进行处理。在装置稳定运行后,发明人使用公式分别计算每种背景细胞清除率Rr(阴性富
集模式下:Rr=(C4V4-C1V1)/C4V4;阳性富集模式下:Rr=(C4V4-C2V2)/C4V4),其中C1和V1
分别表示非磁珠标记细胞出样通道的细胞浓度和溶液体积,C2和V2表示磁珠标记细胞出样
通道的浓度和溶液体积,C4和V4表示起始样品的浓度和溶液体积)。重复若干次。
轴,使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)绘制统计图;在最佳
进液速度条件下掺入不同浓度捕获效率组间比较用完全随机方差分析;初始掺入不同肿瘤
细胞系细胞数与平台平均捕获数行简单直线回归分析,以初始掺入肿瘤细胞系细胞数为X
轴以平均捕获肿瘤细胞系细胞数为Y轴使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software,La
Jolla,CA,USA)图绘制简单直线方程图。背景细胞清除率实验,白细胞、血小板及红细胞的
清除率采用均值±标准差描述。P<0.05被认为具有统计学意义。
平面和缓冲液液平面位于芯片中央的原则,在实验中发明人测的对应的缓冲液进样速度与
样本液相同。
度为100μl/min,对应的PBS缓冲液进液速度100μl/min,此时负性富集模式平均捕获率为
85.2±1.2%,正性富集模式捕获率为85.0±1.0%,为该平台最佳捕获效率。
min,在平台充满血样正常工作状态下,计算进样口和最终样本收集出口的体积和其中的血
细胞浓度,检测平台对血细胞去除效果,经过计算,负性富集模式与正性富集模式无显著差
异,平台对白细胞、红细胞、血小板的平均清除率Rr均大于99%。