一种基于PADI4作为肿瘤标志物制得的抗原、抗体及应用

摘要

本发明涉及一种基于PADI4作为肿瘤标志物制得的抗原、抗体及应用，所述抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了由所述抗原制备的特异性抗体。所述的蛋白PADI4单克隆抗体包括包被在酶标板上的蛋白PADI4单克隆抗体和生物素标记的蛋白PADI4单克隆抗体。采用本发明所述的抗体制备的检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的蛋白PADI4水平，具有广谱性和可检测性，测试重复性好。

权利要求

1.一种基于肽基精氨酸脱亚胺酶4作为肿瘤标志物制得的抗体135‑B9，由一条重链和一条轻链组成，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述抗体135‑B9的表达基因，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种基于肽基精氨酸脱亚胺酶4作为肿瘤标志物制得的抗体197‑A5，由两条重链和一条轻链组成，重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.权利要求3所述抗体197‑A5的表达基因，重链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5.权利要求1所述抗体135‑B9和权利要求3所述抗体197‑A5作为有效成分在制备检测PADI4为标志物的肿瘤试剂中的应用；其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肝细胞癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌或卵巢癌。

说明书

一种基于PADI4作为肿瘤标志物制得的抗原、抗体及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于PADI4作为肿瘤标志物制得的抗原、抗体及应用，属于分子生物检 测技术领域。

背景技术

[0002] 肽基精氨酸脱亚胺酶(Peptidylarginine deiminase,PAD或PADI)是在人体组织中的一种酶， 目前，共发现了五种PAD酶(即PAD1、2、3、4和6)。这些酶由坐落在人类染色体
lp36区域上 的一簇基因所编码，并具有不同的组织分布。它可以在钙离子存在的情况下对
其它一些组织蛋 白进行后翻译修饰(post‑translational modification)。这个酶可将多
肽链中的精氨酸(arginine)的  氨基催化成羰基，从而使精氨酸转化成瓜氨酸
(citrulline)。瓜氨酸是一个非自然氨基酸。这个由 PAD催化的多肽中精氨酸转化成瓜氨
酸的过程被称做瓜氨酸化(citrullination)。蛋白发生瓜氨酸 化后由于结构发生变化，导
致其酶活性、代谢活性、调节功能和结构功能均发生改变。因此， 瓜氨酸化是和磷酸化、乙
酰化、糖基化、甲基化、泛素化一样重要的蛋白翻译后修饰方式。

[0003] 近年来，通过免疫学、细胞生物化学和分子遗传学的研究，PAD4(肽基精氨酸脱亚胺酶 4Peptidylarginine deiminase4，或PADI4)被证明在人类类风湿性关节炎发病过程
中起着非常重要 的作用，且可作为腺癌标志物，在制备腺癌临床诊断试剂中进行应用。应
用组织芯片等筛选技 术发现PADI4(肽基精氨酸脱亚胺酶4)在多种恶性肿瘤组织和患者血
液中(乳腺癌、肺癌、 肾癌、膀胱癌、结肠癌、子宫癌，卵巢癌等)表达水平显著增高，在各种
良性肿瘤、慢性炎症 (胃平滑肌瘤、子宫肌瘤、子宫颈息肉、胆囊炎、子宫颈炎、滑膜炎等)及
健康人中低表达或 不表达。这些结果显示PADI4不但与肿瘤发病过程密切相关，而且在多
种恶性肿瘤组织中表达， 是具有广谱性和可检测的肿瘤标记物。

[0004] 中国专利文献CN101101290A(申请号200610070392.4)公开了一种肿瘤血清标志物，由 肽基精氨酸脱亚胺酶4组成；其中：所述肿瘤指乳腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺
癌、膀 胱癌之一。其还公开了所述肿瘤血清标志物在制备检测肿瘤的临床诊断试剂中的应
用。利用该 发明提出的肿瘤血清标志物制备的肿瘤临床诊断试剂或试剂盒可以只检测一
个指标而实现对被 检者是否患有恶性肿瘤的初步确定，以较少的费用在较短的检测时间
里完成健康普查工作，并 为临床诊断提供了可靠的依据。但是目前国内尚未建立检测患者
的血清中PADI4的试剂盒，主 要的技术障碍在于抗原为人源PADI4蛋白，采用昆虫杆状病毒
表达系统进行重组表达，N端添 加Twin Strep标签用于纯化，细胞采用sf9细胞，需获得可
溶性蛋白作抗原。经过表达纯化测试， PADI4在sf9细胞中有表达，最佳表达条件是30ul病
毒质粒(M.O.I.～1)感染Sf9细胞3天，技术 障碍在于表达纯化后得率较低，产量只有
0.34mg/L，纯度只有80％，制备单抗需要的抗原量至 少3.5mg，因此需放大较大体积才能获
得足够的抗原；同时，抗体制备需要经过免疫，融合， 亚克隆及筛选和定株，生产抗体阶段，
由于PADI4蛋白与PADI2蛋白同源性较高，因此需在筛 选时去除交叉反应也是阻碍该技术
发展的主要难题。

[0005] 因此研发出高灵敏性、高特异性及稳定性的PADI4检测试剂盒，用于乳腺癌、肺癌、肾癌、 膀胱癌、结肠癌、子宫癌，卵巢癌等癌症血清中PADI4的检测，这对上述肿瘤的筛查、
诊断与 治疗具有重要意义。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供一种PADI4(肽基精氨酸脱亚胺酶4)在制备肿瘤诊断 试剂盒中的应用，该检测试剂盒重复性高、稳定性好，具有广谱性和可检测性，可用于
肿瘤的 临床诊断。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0008] 一种基于肽基精氨酸脱亚胺酶4作为肿瘤标志物制得的抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 示。

[0009] 上述抗原的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 一种基于肽基精氨酸脱亚胺酶4作为肿瘤标志物制得的抗体135‑B9，由一条重链和一条轻 链组成，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所
示。

[0011] 上述抗体135‑B9的表达基因，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，轻链核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示。

[0012] 一种基于肽基精氨酸脱亚胺酶4作为肿瘤标志物制得的抗体197‑A5，由两条重链和一条轻 链组成，重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示，轻链氨基酸序
列如SEQ ID NO.11所示。

[0013] 上述抗体197‑A5的表达基因，重链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示， 轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

[0014] 上述抗体135‑B9和抗体197‑A5作为有效成分在制备检测肿瘤试剂中的应用。

[0015] 一种肿瘤诊断试剂盒，包括：

[0016] 包被有蛋白PADI4单克隆抗体的酶标板、对照样品、洗涤液、终止液、稀释液、辣根过氧 化物酶标记链霉亲和素(HRP‑SA)及辣根过氧化物酶显色底物；

[0017] 所述蛋白PADI4单克隆抗体，包括抗体135‑B9和抗体197‑A5。

[0018] 根据本发明优选的，所述酶标板为96孔酶标板。

[0019] 根据本发明优选的，所述对照样品包括阳性对照品，阳性对照品为人工合成PADI4蛋白。

[0020] 根据本发明优选的，所述稀释液为5％FBS‑PBST：将10ml FBS(胎牛血清)加入90ml PBST溶液中，混匀，即得。

[0021] 根据本发明优选的，所述洗涤液为PBST溶液：将Tween‑20按体积百分比0.1％的比例加入 到PBS溶液中，混合均匀，PBS溶液的pH为7.4。

[0022] 根据本发明优选的，所述终止液为2mol/L的盐酸溶液。

[0023] 根据本发明优选的，所述辣根过氧化物酶显色底物包括显色液A和显色液B，所述显色液A 是用柠檬酸缓冲液将质量浓度为30％的过氧化氢稀释1000倍制得，所述显色液B
为向含质量浓 度为20％二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液中按0.4mg/ml的比例加入四甲基联苯
胺配制获得的溶液。

[0024] 根据本发明优选的，所述抗体135‑B9包被于酶标板上，抗体197‑A5为由生物素标记的抗体 197‑A5。

[0025] 上述肿瘤诊断试剂盒的制备方法，步骤如下：

[0026] (1)制备氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原；

[0027] (2)制备抗体135‑B9；所述抗体135‑B9，由一条重链和一条轻链组成，重链氨基酸序列 如SEQ ID NO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

[0028] (3)制备抗体197‑A5，然后用生物素进行标记，制得生物素标记的抗体197‑A5；所述抗 体197‑A5，由两条重链和一条轻链组成，重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ 
ID NO.9 所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；

[0029] (4)将步骤(2)制得的抗体135‑B9包被于酶标板上，然后组装试剂盒，制得肿瘤诊断试 剂盒。

[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(3)的标记，具体步骤为：

[0031] 1)将生物素(Biotin)用N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制得浓度为20mg/ml的生物素 溶液；

[0032] 2)将抗体197‑A5溶解于PBS缓冲液中，使用碳酸盐缓冲溶液(CBS)调pH至8.5，制得浓 度为1～10mg/ml的抗体197‑A5溶液；

[0033] 3)按每mg抗体加5μl生物素溶液的比例混合步骤1)制得的生物素溶液与步骤2)制得的 抗体197‑A5溶液，室温避光搅拌2小时；

[0034] 4)收集液体(抗体缓冲溶液和生物素缓冲溶液的混合溶液)，使用PBS缓冲液透析，该 过程中更换PBS缓冲液3～4次。

[0035] 根据本发明优选的，所述步骤(4)的包被，具体步骤为：

[0036] 采用直接吸附法，用pH为9.6的PBS缓冲液将上述制备的135‑B9单克隆抗体稀释至4μg/ml， 按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为37℃的条件下放置2个小时，然
后用洗涤液 洗涤，甩干，即得包被有135‑B9单克隆抗体的96孔酶标板。

[0037] 原理介绍

[0038] PADI4作为肿瘤标记物具有具有广谱识别性。现有标记物至多识别2‑3种肿瘤。PADI4及其 产物瓜氨酸化抗凝血酶在乳腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、子宫癌，卵巢癌
等患者的血 液中显著表达。PADI4作为标记物的检测技术可以低成本用于肿瘤健康普查和
门诊初查。 PADI4作为肿瘤标记物作用机制清楚，有判断肿瘤治疗进展状况的理论基础。现
有肿瘤标记物 的作用机制大多不清楚，因而无法用于监测肿瘤治疗效果。PADI4可通过修
饰抗凝血酶、细胞 角质蛋白和细胞纤维连接蛋白刺激肿瘤毛细血管增生和抑制细胞凋亡。
经试验发现高表达的 PADI4可干扰P53抑癌基因对下游基因的调控。因此以PADI4为标记物
的本试剂盒在临床检测中 具有广谱性和特异性。

[0039] 有益效果

[0040] 本发明通过特异的抗原进行免疫，获得了抗体135‑B9和抗体197‑A5，在常规酶联免疫吸附 试验的基础上，通过生物素与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素之间的高度放大
作用，建立了一 种高灵敏度生物素‑亲和素‑酶联免疫检测试剂盒，以测定待测样中的蛋白
PADI4表达水平。采 用本发明的蛋白PADI4检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的
肿瘤蛋白PADI4水平， 其特异性高，测试重复性好。

附图说明

[0041] 图1是肿瘤蛋白单克隆抗体135‑B9和197‑A5纯化后两个抗体的变性胶和非变性胶的PAGE图；

[0042] 图2是肿瘤蛋白单克隆抗体135‑B9识别抗原的SDS‑PAGE及Western blot分析结果；

[0043] 图3是用ELISA方法检测PADI4在乳腺癌、乳腺癌术后、乳腺纤维患者以及健康人血清在 450nm下的吸收峰值中的表达水平；

[0044] 图4是用ELISA方法检测PADI4在肝癌、肝癌术后、肝海绵状血管瘤患者以及健康人血清在 450nm下的吸收峰值中的表达水平；

[0045] 图5是用ELISA方法检测PADI4在卵巢癌、卵巢癌术后患者以及健康人血清在450nm下的吸收 峰值中的表达水平；

[0046] 图6是用ELISA方法检测PADI4在前列腺癌、列腺癌术后、前列腺增生患者以及健康人血清 在450nm下的吸收峰值中的表达水平；

[0047] 图7是抗体配对组合135(4ug/ml)‑197(0.5ug/ml)对应标准曲线图；

[0048] 图8是抗体配对组合135(4ug/ml)‑197(0.25ug/ml)对应标准曲线图；

[0049] 图9是抗体配对组合135(2ug/ml)‑197(0.25ug/ml)对应标准曲线图；

[0050] 图10是抗体配对组合135(1ug/ml)‑197(0.25ug/ml)对应标准曲线图；

[0051] 图11是抗体配对组合135(4ug/ml)‑197(0.125ug/ml)对应标准曲线图；

[0052] 图12是抗体配对组合135(2ug/ml)‑197(0.125ug/ml)对应标准曲线图；

[0053] 图13是抗体配对组合135(1ug/ml)‑197(0.125ug/ml)对应标准曲线图；

[0054] 图14是抗体配对组合135‑197biotin对应标准曲线图；

[0055] 图15是抗体配对组合135‑122biotin对应标准曲线图；具体实施方案

[0056] 下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不 限于此。

[0057] 试剂来源

[0058] 96孔酶标板：品牌Corning，货号：3599；

[0059] PADI4抗原蛋白:人工合成

[0060] 健康人血清：来自山东省肿瘤医院健康体检人群；

[0061] 辣根过氧化物酶‑链亲和素：品牌Jackson，货号：016‑030‑084；

[0062] 洗涤液和终止液均购自普健生物科技有限公司；

[0063] 辣根过氧化物酶显色底物：TMB显色液，购自普健生物科技有限公司；

[0064] 实施例1

[0065] 蛋白PADI4单克隆抗体的制备：

[0066] (1)抗原制备：

[0067] a)密码子优化，基因合成；

[0068] 蛋白PADI4一共663AAs，分子量74.47KDa，无信号肽，无跨膜螺旋，265‑271AAs处有一 个疏水性较强的区域。综合同源性比对结果需要可溶性蛋白做抗原，用大肠杆菌系统可
溶性表 达蛋白PADI4的1‑260AAs(去掉疏水区，且同源性较低)免疫小鼠制备单抗，载体采
用 pET28b，C端连载体上的6His标签，酶切位点为NcoI/XhoI。

[0069] b)质粒提取(试剂盒名称为：Endo‑free plasmid Mini Kit I(50),OMEGA bio‑tek)：

[0070] 1)取过夜培养的菌液4mL，12000rpm离心1min后收集菌体；

[0071] 2)加入250μL Solution I重悬细胞；

[0072] 3)加入250μL Solution II，轻柔颠倒4‑6次使菌体充分裂解，室温放置2min；

[0073] 4)加入350μL Solution III，立即颠倒混匀数次至出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10 min；

[0074] 5)将上一步收集的上清液转移到吸附柱中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

[0075] 6)向吸附柱中加入500μL的Buffer HB，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

[0076] 7)向吸附柱中加入700μL的DNA Wash Buffer，12,000rpm离心1min后倒掉废液，重复洗 涤一次；

[0077] 8)空柱在12,000rpm下离心2min；

[0078] 9)将吸附柱置于无菌的离心管中，加入50μL的无菌水，室温放置2min，12,000rpm离心 1min，将质粒溶液收集到经过离心管中，重复操作1次。

[0079] c)质粒转化DH10Bac

[0080] 1)DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen公司)冰上解冻；

[0081] 2)将100ul高效DH10Bac感受态细胞倒入预冷的1.5ml管子；

[0082] 3)向细胞中加入3μl步骤b)制得的质粒DNA，轻轻混合；

[0083] 4)冰上孵育30分钟；

[0084] 5)42度热激90秒；

[0085] 6)立即冰上放置2分钟；

[0086] 7)加入900μl无抗性的LB培养基；

[0087] 8)37度180rpm转震荡培养4小时；

[0088] 9)分别取10μl、20μl、30μl以不同浓度涂LB平板，各浓度涂三个LB平板，其中LB平板 包含50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，10μg/ml tetracycline，100μg/ml X‑gal，40μ
g/ml IPTG；

[0089] 10)37度培养箱避光培养48小时；

[0090] d)蓝白斑筛选及验证

[0091] 1)挑取步骤c)培养的白色的克隆，重新划线在新鲜LB平板(50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，10μg/ml tetracycline，100μg/ml X‑gal，40μg/ml IPTG)，37度避光培养48h；

[0092] 2)将16个白斑克隆分别接种到5ml含有50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamici，10μg/ml tetracycline的液体中，37度200rpm过夜培养；

[0093] 3)PCR验证重组Bacmid，选取1‑16号单克隆菌株进行验证；

[0094] 4)PCR鉴定的阳性克隆进行试剂盒抽提重组质粒DNA(试剂盒名称为：Endo‑free plasmid Mini Kit I(50),OMEGA bio‑tek)；

[0095] e)重组杆状病毒P1代制备(6孔板进行Sf9细胞的转染)

[0096] 1)在每个孔含2ml含有抗生素的SFX培养基的6孔板上接种9×105Sf9细胞，27度培养1小时；

[0097] 2)转染试剂准备：将2μg纯化的重组质粒DNA加入100μl无抗生素SFX培养基中；完全混 匀Cellfectin试剂，翻转混合5‑10次；吸出6μl Cellfectin试剂加入100μl无抗生素
SFX培养基中； 将Cellfectin试剂加入到含质粒DNA的培养基中(总体积约210μl)；室温轻
轻混合3min，室温 孵育15分钟；

[0098] 3)在DNA/转染试剂混合体孵育过程中，从细胞中除去培养基并用2ml无抗生素无血清培 养基清洗，弃去清洗培养基；

[0099] 4)向每个含有混合体的管子中加入0.8ml无抗生素无血清培养基，轻轻混匀，将混合体加 入到含有细胞的孔中；

[0100] 5)27度培养5小时；

[0101] 6)去掉培养液，向细胞中加入5ml全培养基(50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素，5％血 清)；

[0102] 7)27度培养培养1周后，1000rpm/min离心5分钟，取上清为P1病毒株(cultur medium)；

[0103] f)P1代表达测试

[0104] 1)将离心得到的细胞加入10ml PBS缓冲液，超声处理，超声时间2s，间隔2s，总计3min； 12000rpm，2min离心分离上清(native)和沉淀(denatured)，沉淀用8Murea+PBS溶
解；

[0105] 2)将收集的病毒上清(culture medium)，上清(native)和沉淀(denatured)，分别取12 μl样品跑SDS‑PAGE(12％，80v浓缩胶，20min，120v分离胶，45min)验证表达情况；

[0106] g)P2代病毒制备

[0107] 1)P1代表达测试结果显示目的蛋白有表达，继续进行P2代病毒制备；

[0108] 2)准备200ml体积细胞，加入200μl体积P1代病毒。

[0109] 3)27度潮湿培养箱培养细胞1周，500×g离心5分钟弃去细胞和碎片，收集得到的上清即 为P2代病毒；

[0110] h)MOI测试

[0111] 1)在六孔板中加入细胞状态良好的30ml细胞上清(2×105细胞/ml)；

[0112] 2)向其中分别加入30μl，150μl和300ul的P2代病毒液，培养48h及72h后分别取样1.5ml进 行表达测试鉴定；

[0113] 3)收取的样品进行超声处理，超声时间2s，间隔2s，总计3min；12000rpm，2min离心分 离上清(native)和沉淀(denatured)，沉淀用8Murea+PBS溶解；

[0114] 4)SDS‑PGAE鉴定同上；

[0115] i)200ml纯化测试

[0116] 1)根据MOI测试结果，选取30μl P2代病毒侵染72h为纯化测试条件；

[0117] 2)培养200ml细胞至生长状况良好，检测细胞密度为3×106，加入30μl的P2代病毒，培养 72h后收样品；

[0118] 3)12000rpm，离心30min后收集上清；

[0119] 4)纯化：利用Strep‑tactin树脂进行STREP标签的亲和纯化；

[0120] (2)单克隆抗体制备：

[0121] 1)动物免疫：用上述制得的抗原免疫小鼠，共免疫四次，融合前冲击免疫，融合1～2次；

[0122] 2)细胞融合及筛选：挑选血清免疫结果较好的小鼠进入细胞融合，融合1～2次，每次融合 进行5‑6轮Elisa筛选(需检测交叉反应)，第一轮先得到单抗，建株，生产腹水，配
对。如果 没有得到配对抗体，进行第二轮细胞融合，第二轮融合得到的细胞株建株，生产腹
水，然后再 跟第一轮得到的细胞株一起配对。从而得到两株具有稳定分泌蛋白PADI4单克
隆抗体能力的杂 交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株135‑A1‑B9、杂交瘤细胞株197‑
C11‑A5；

[0123] 3)腹水生产及纯化：将培养的杂交瘤细胞，注射小鼠腹腔，经过1‑2周时间，生产腹水， 通过proteinA/G对腹水进行纯化，纯化后获得蛋白PADI4单克隆抗体135‑B9和197‑A5；

[0124] 如图1所示为肿瘤蛋白单克隆抗体135‑B9和197‑A5纯化后两个抗体的变性胶和非变性胶的 PAGE图,其中第1泳道为135‑B9单克隆抗体变性后重链和轻链的SDS‑PAGE结果，
第2泳道为197‑ A5单克隆抗体变性后重链和轻链的SDS‑PAGE分析结果,第3泳道为135‑B9
单克隆抗体变性前的 SDS‑PAGE结果，第4泳道为197‑A5单克隆抗体变性前的SDS‑PAGE结
果。如图2所示为单克隆抗体 135‑B9识别抗原的Westernblot分析结果,其中第1泳道为
135‑B9单克隆抗体识别0.5μg抗原的 SDS‑PAGE分析结果，第2泳道为为135‑B9单克隆抗体
识别0.25μg抗原的SDS‑PAGE分析结果；

[0125] 4)纯化后抗体效价检测：单克隆抗体用间接ELISA法检测效价，大于1:64000的为合格， 否则重新培养该抗体对应的细胞株，将细胞注射小鼠生产腹水纯化抗体；

[0126] 5)将纯化的抗体进行标记(Biotin)

[0127] i)Biotin使用DMF溶解，浓度20mg/ml；

[0128] ii)抗体溶解于PBS，使用CBS调至pH8.5，终浓度1‑10mg/ml；

[0129] iii)按每mg抗体加5μl生物素溶液，室温避光搅拌2小时；

[0130] iv)收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS 3‑4次。

[0131] 生物素化单克隆抗体197‑A5

[0132] 1)Biotin使用DMF溶解，浓度20mg/ml。

[0133] 2)抗体溶解于PBS,使用CBS调至pH8.5，终浓度1‑10mg/ml。

[0134] 3)按每mg抗体加5ul生物素溶液，室温避光搅拌2小时。

[0135] 4)收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS 3‑4次。

[0136] 将上述成分按常规方式组装成肿瘤诊断试剂盒。

[0137] 包被96孔酶标板：

[0138] 采用直接吸附法，用pH为9.6的PBS缓冲液将上述制备的135‑B9单克隆抗体稀释至4μg/ml， 按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为37℃的条件下放置2个小时，然
后用洗涤液 洗涤，甩干，即得包被有135‑B9单克隆抗体的96孔酶标板。

[0139] 实施例2

[0140] 实施例1所述试剂盒的使用步骤如下：

[0141] 1)抗体固相化板恢复室温平衡。

[0142] 2)加入标准样品稀释液(PADI4)，用稀释液从10ng/ml～0.015625ng/ml共7个梯度稀释， 每孔100μl，最后一孔最为空白对照，加入稀释液100μl，测量样品100μl，37℃，1.5h。

[0143] 3)洗板，用PBST 300μl洗板5次，液体拍干。

[0144] 4)加入197‑C11‑A5‑Antibody‑Bio，用稀释液稀释到2ug/ml使用，每孔100μl，37℃，1h。

[0145] 5)洗板，用PBST 300μl洗板5次，液体拍干。

[0146] 6)加入Streptavidin‑HRP，用稀释液稀释1:2000使用，每孔100μl，37℃,30min。

[0147] 7)洗板，用PBST 300ul洗板5次，液体拍干。

[0148] 8)TMB显色，每孔100μl，37℃显色10min。

[0149] 9)2M盐酸终止，每孔50μl。

[0150] 3、检测结果：

[0151] 在加入终止液后15min内，用酶联仪在450nm的波长条件下检测每个检测孔的光密度OD值， 检测试剂盒的检测标准为：待测血清的OD值是以上时，检测样判为阳性，否则检测
样判为阴 性。经检测，本发明制备的包被96孔酶标板的变异系数CV值小于20％，对同一批
次及不同批次 的检测试剂盒进行试验测试，测试结果显示批内及批间的试剂盒的CV值均
小于20％，说明本发 明的PADI4检测试剂盒具有高精密性。

[0152] 实施例3使用本发明的PADI4检测试剂盒的临床样本检测：

[0153] 实施案例1：对乳腺癌112例、乳腺癌手术后86例，肝细胞癌77例、肝细胞癌手术后24例、 食管癌64例，食管癌手术后24例、胃癌94例、胃癌术后43例、结肠癌2l例、结肠癌手术
后15例、 直肠癌19例，直肠癌手术后28例，胰腺癌21例、胰腺癌手术后6例、卵巢癌29例、卵
巢癌术后 11例以及性别年龄相匹配的正常对照组160例，进行检测，结果如表1所示：

[0154] 表1肿瘤患者和患者术后以及正常人PADI4水平检测数据

[0155]

[0156]

[0157] 所有试验数据由3次重复试验而获得，经t检验，PADl4在乳腺癌、肝细胞癌、食管癌、胃 癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌各种恶性肿瘤患者血清中与健康对照组相比有很高的
表达，差 异有统计学意义(P<0.05)。在乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌
等手术后 患者血清中PADl4表达明显下降。

[0158] 实施案例2：用ELISA方法检测肿瘤患者的血液，发现PADI4及其产物瓜氨酸化抗凝血酶在 乳腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、子宫癌，卵巢癌等患者的血液中显著表达，而
在正常 人中不表达或表达量很低。如图3所示，用ELISA方法检测PADI4在各种肿瘤患者以
及术后和健 康人血清中的表达水平。柱状图中的每个柱代表患者或健康人血清在450nm下
的吸收峰值。结 果显示，与一些良性肿瘤、肿瘤切除手术后患者血清和正常人血清相比较，
PADI4在乳腺癌、 肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤患者血清中的表达水平
明显增高。

[0159] 对比例1

[0160] 为了进一步说明本发明获得的技术方案在检测蛋白PADI4表达水平方面的突出的效果，选 取本发明研发过程中在相同条件下筛选获得的其他抗体与本申请所述抗体的效
果对照：

[0161] (1)双抗夹心ELISA检测系统的建立：将筛选获得的26个单克隆细胞株进行抗体生产， 纯化后选择21株效价较好的抗体进行生物素标记，采用棋盘滴定实验，通过双抗夹心
ELISA法 检测26株单克隆抗体与18株生物素标记抗体能否配对，以PADI4蛋白作为标准蛋
白，PADI2蛋 白为阴性对照，选择了9株捕获抗体和9株生物素标记抗体，进行下一步的內源
检测。

[0162] (2)配对抗体检测内源样本：采用棋盘滴定实验，通过双抗夹心ELISA法检测筛选的9株单 克隆抗体与9株生物素标记抗体配对，分别以筛选的这些抗体作为捕获抗体包被
酶标板，以生 物素标记抗体作为检测抗体，以PADI4蛋白作为标准蛋白，PADI2蛋白为阴性
对照蛋白，甲方 提供的阳性血清和阴性血清作为内源样本分别进行两两配对验证。通过棋
盘滴定实验，选择 P/N值最大(如下表2所示)，反应最敏感的10组抗体对进行下一步优化实
验。

[0163] 表2各组抗体对检测阳性和阴性样本P/N值

[0164]

[0165] (3)最佳抗体对的初步筛选：将上一步确定的10组抗体对(见表2)，检测梯度稀释的 PADI2蛋白，PADI4蛋白，阳性血清，阴性血清，结果如下：

[0166] 表3 10组抗体对检测阴性对照蛋白OD值

[0167] Plate‑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101
PAID2 Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody 
135 135 135 135 135 135 197 197 200 200
A 0.04 0.05 0.04 0.03 0.04 0.06 0.06 0.06 0.32 0.30
B 0.03 0.03 0.03 0.03 0.05 0.03 0.05 0.05 0.30 0.30
C 0.03 0.03 0.03 0.02 0.05 0.03 0.05 0.06 0.29 0.30
D 0.03 0.03 0.03 0.03 0.05 0.03 0.05 0.05 0.33 0.28
E 0.04 0.03 0.03 0.03 0.05 0.03 0.05 0.05 0.29 0.29
F 0.05 0.03 0.03 0.03 0.05 0.03 0.05 0.06 0.27 0.27
G 0.03 0.03 0.03 0.03 0.05 0.03 0.05 0.06 0.27 0.25
H 0.03 0.04 0.04 0.03 0.06 0.04 0.06 0.06 0.26 0.21
  Biotin‑139 Biotin‑148 Biotin‑197 Biotin‑65 Biotin‑122 Biotin‑137 Biotin‑135 Biotin‑200 Biotin‑148 Biotin‑197

[0168] 表3数据说明10组抗体对都不识别阴性对照蛋白PADI2，无交叉反应。

[0169] 表4 10组抗体对检测阳性对照蛋白OD值

[0170] Plate‑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 102
PAID4 Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody  Antibody 
135 135 135 135 135 135 197 197 200 200
A 4.12 4.15 4.32 2.4 3.17 4.23 4.13 4.26 3.843 3.93
B 3.85 3.92 3.86 1.43 1.96 3.21 3.95 3.95 3.62 2.93
C 2.49 2.77 2.83 0.65 0.86 2.98 3.53 3.08 2.53 2.06
D 1.66 1.97 1.79 0.39 0.48 1.89 2.47 2.58 1.41 1.05
E 1.10 1.19 1.19 0.19 0.27 1.12 1.69 1.58 0.81 0.70
F 0.65 0.67 0.65 0.11 0.16 0.57 0.92 0.85 0.47 0.44
G 0.38 0.39 0.37 0.06 0.10 0.34 0.46 0.54 0.32 0.37
H 0.04 0.04 0.04 0.03 0.04 0.02 0.04 0.04 0.18 0.17
  Biotin‑139 Biotin‑148 Biotin‑197 Biotin‑65 Biotin‑122 Biotin‑137 Biotin‑135 Biotin‑200 Biotin‑148 Biotin‑197

[0171] 表4数据说明10组抗体对都能识别阳性对照蛋白PADI4。

[0172] 表5 10组抗体对检测阳性血清和阴性血清OD值

[0173]

[0174] 从表5数据中，选择阳性血清OD/阴性血清OD大于3倍的5组抗体对组合(1、2、3、5和6纵 列)，进行下一步捕获抗体和检测抗体的条件优化：将捕获抗体135设置三个浓度梯度 
(1/2/4ug/ml)，将5个检测抗体分别设置3个浓度梯度(0.5/1/2ug/ml)进行检测PADI4蛋白 
(浓度0.1ug/ml‑0.0015625ug/ml倍比稀释)，阴性血清(稀释倍数1/2/4倍)和阳性血清(稀 
释倍数1/2/4倍)，布板如表6所示：

[0175] 表6

[0176]

[0177]

[0178]

[0179] 数据如表7(黑色加粗为PADI4数据‑标曲；3、4、7和8纵列的第D、E、F行为阴性血清数据 (1/2/4倍稀释)；剩余黑色非加粗为阳性血清数据)所示：

[0180] 表7

[0181]

[0182] 从表7数据可以看出，阴影填充部分数据随着血清稀释倍数的增加，OD值呈下降趋势；对 应抗体配对组合是135(4ug/ml)‑197(0.5ug/ml)，对应标曲如下表8及图7所示：

[0183] 表8

[0184]

[0185] (4)将抗体配对组合135(4ug/ml)‑197(0.5ug/ml)继续进行条件优化确定抗体对最 佳工作浓度：

[0186] ①条件优化：将捕获抗体135设置三个浓度梯度(4/2/1ug/ml)，将检测抗体197分别设置 3个浓度梯度(0.5/1/2ug/ml)检测PADI4蛋白(浓度50ng/ml‑0.78125ng/ml倍比稀
释)；

[0187] 在①的基础上进行②条件优化：将捕获抗体135设置1个浓度梯度(4ug/ml)，将检测抗体 197分别设置2个浓度梯度(0.25/0.125ug/ml)检测PADI4蛋白(浓度50ng/ml‑
0.78125ng/ml倍 比稀释)；

[0188] 在②基础上，继续进行③条件优化：将捕获抗体135设置三个浓度梯度(4/2/1ug/ml)， 将检测抗体197分别设置2个浓度梯度(0.25/0.125ug/ml)进行检测PADI4蛋白(浓度
50ng/ml‑ 0.78125ng/ml倍比稀释)；

[0189] 各条件组合数据如表9‑表14及图8‑图13所示：

[0190] 表9

[0191]

[0192] 表10

[0193]

[0194] 表11

[0195]

[0196] 表12

[0197]

[0198] 表13

[0199]

[0200] 表14

[0201]

[0202] 综合比较以上六个抗体对数据(R2值，相同抗原浓度对应OD值，检测抗体浓度值(灵敏 度))，抗体对最佳工作浓度如下：Antibody 135(4ug/ml)‑PADI4蛋白(50ng/ml‑
0.78125ng/ml) ‑197‑bio(0.125ug/ml)。

[0203] 总结：

[0204] 通过布板以及检测到的数据显示：根据3个稀释倍数下(1×，2×，4×)的阳性血清，阴 性血清及空白对照的OD值，算出各稀释倍数下阳性血清OD/阴性血清OD值的比值(减
去空白 背景值)，结果如表15所示：

[0205] 表15

[0206]

[0207] 通过以上数据综合比较，各抗体对分别检测PADI4蛋白和PADI2蛋白(去交叉筛选)，以及 阳性血清，阴性血清的OD值筛选确定五组抗体对；该五组抗体对在检测相同血清
稀释度下，通 过比较抗体对的阳性血清/阴性血清的比值(比值高阳性和阴性区分度好)，
135‑197biotin和 135‑122biotin较好，对应标曲如表16‑表17及图14‑图15所示：

[0208] 表16

[0209]

[0210] 表17

[0211]

[0212] 比较两对抗体的灵敏度(相同抗原浓度对应的OD值)及标曲的相关性(R2)，135‑197biotin抗 体对表现都显著优于135‑122biotin。