基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法

摘要

本发明涉及一种基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，通过硅烷化反应在基片表面修饰C‑C双键，利用紫外光引发的自由基聚合反应借助光掩膜在基片上构建PEG水凝胶阵列。目标分子打开修饰在水凝胶上的捕获探针的发卡结构，引发生物素化发卡H1、H2间的杂交链反应，在传感位点形成长串双链DNA。通过生物素‑链霉亲和素特异结合反应，将生物素化的量子点CdS固定到传感位点。通过Ag+引发CdS发生阳离子交换反应，Cd2+使得Rhod‑5N的荧光极大增强。利用基因芯片扫描仪对阵列点荧光进行定量，从而实现目标分子的高灵敏高特异性分析。本发明方法操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好、普适性高。

权利要求

1.基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，其特征在于，所述方法以水凝胶为检测平台，通过紫外光固化在硅烷化的玻璃基片上构建水凝胶阵列；待测目标分子打开修饰在水凝胶上的捕获探针的发卡后，暴露出来的DNA单链引发发卡H1、H2间的杂交链反应，在传感位点处生成长链DNA串联物；标记在发卡H1、H2上的生物素通过链霉亲和素将修+

饰有生物素的量子点CdS固定到所述传感位点，在加入Ag 和Rhod‑5N后，CdS发生阳离子交

2+

换反应，置换出来的Cd 与Rhod‑5N结合，产生灵敏的荧光信号，最后用数据采集系统记录信号并定量分析；

所述水凝胶阵列：先通过硅烷化在玻璃基片表面修饰上带有碳碳双键的官能团，将PEG预聚体溶液滴加在基片表面并覆盖上光掩膜，通过紫外光照射形成水凝胶阵列；所述水凝胶上的捕获探针：将掺杂在水凝胶内的功能化PEG分子的羧基活化后，滴加修饰有氨基的捕获探针，二者通过酰胺键结合；所述捕获探针设有发卡结构；所述待测目标分子为各种核酸。

2.如权利要求1所述的基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，其特征在于，所述捕获探针识别目标分子并与之发生杂交，使捕获探针的发卡结构打开进而释放出发卡茎部的一段序列，该段序列可作为后续所述杂交链反应的引发链；加入发卡H1、H2，发生杂交链反应，在传感位点处形成长链DNA组装物。

3.如权利要求1或2所述的基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，其特征在于，每个阵列点的荧光强度与目标分子的浓度成正相关，利用标准曲线法，则可求得检测样品中目标分子的浓度。

4.如权利要求1或2所述的基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，其特征在于，通过选择或改变所述捕获探针的序列，所述方法可分析检测的目标分子为各种核酸。

5.权利要求1所述的基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法在复杂生物样品中miRNA或DNA的灵敏检测中的应用。

说明书

基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法

技术领域

[0001] 本发明具体涉及一种基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应用于microRNA的荧光分析方法，属于分子检测技术领域。

背景技术

[0002] 在生物传感领域，荧光分析相比于其他技术因具有诸多优势，如简单、灵敏、有不同光学性质的有机染料可供使用以及光学成像的快速发展，荧光分析已广泛用于生物学系
统、疾病控制和诊断、生物防御、环境监测等领域。最常见的荧光分析方法是将报告分子标
记上荧光染料，从而依据荧光强度对目标物进行定量分析。然而，由于受到可用功能化基团
及由高荧光密度导致的光猝灭问题的限制，有机染料的发光强度及染料与报告分子的标记
比很低，基于荧光的生物分析灵敏度的进一步提高受到了阻碍。因此，很多方法被开发出来
放大荧光信号，包括制备高发光性能的纳米晶体，合成荧光高分子，利用金属或金属氧化物
增强荧光，以及利用纳米载体包裹多个光学标签；但是这些方法要么严格依赖于所合成纳
米材料的光学性质，要么需要特殊的装置设计，或者使用苛刻的的检测条件，这些都与典型
的传感平台不兼容。因此，迫切需要开发出简单、温和的荧光放大分析方法。

[0003] 杂交链反应(HCR)是一种支点介导的DNA扩增技术，在典型的HCR反应中，靶物质引发两个DNA发夹的交叉结合，产生类似于交替共聚物的DNA双螺旋结构。HCR作为一个高效的
扩增策略，其具有不需要酶介导、可在等温条件下进行、实验方案简单、扩增效率高等多种
优点，HCR已被认为是一种强大的分子工具，并广泛应用在生物传感、生物成像和生物医药
等领域。一般情况下，HCR可搭载各种信号显示技术，诸如荧光、化学发光、比色和电化学法，
以实现对包括核酸(DNA或RNA)、蛋白质、酶活性、生物小分子、金属离子、甚至是肿瘤细胞在
内的多种靶物质的灵敏检测。尽管基于HCR的方法已历经了长足的发展，但仅依靠HCR扩增
的策略往往不能提供足够的灵敏度，其在生物传感领域的应用仍然面临诸多挑战。因此采
用新颖的设计，构建可以提高HCR反应效率的检测平台是非常有必要的。

[0004] 基于阳离子交换反应的荧光放大技术利用离子晶体(量子点)交换出来的大量金属阳离子，增强了本身无(弱)发光的金属敏感染料的荧光，实现了信号放大。该技术简单、
快速、温和，染料与报告分子的标记比大，不会有荧光猝灭的问题。此外，该方法对纳米晶体
发光性质没有要求，合成技术难度小，因此降低了检测成本。阳离子交换反应作为一种信号
放大技术已广泛用于核酸、蛋白及细胞的检测。但大多数检测是在均相溶液中进行，利用磁
珠进行分离，操作相对繁琐，而且较大的检测溶液体积也限制了痕量分析物的检测。

发明内容

[0005] 为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，用于对目标分子如miRNA的简单、高特异性、高灵
敏检测：通过在玻璃基片上构建水凝胶阵列，搭建反应平台。利用目标物诱发杂交链反应，
实现一次信号放大，量子点以生物素‑链霉亲和素‑生物素三明治结构在DNA长链上结合(具
体的是：由于进行HCR的两个发卡DNA是修饰了生物素的，所以HCR形成的DNA长链上结合有
很多生物素，量子点CdS表面也修饰了生物素，基于链霉亲和素(SA)和生物素(biotin)的特
异性结合作用，形成CdS‑biotin/SA/biotin‑DNA三明治结构，因此将量子点固定到DNA长链
上)，再通过阳离子交换反应二次放大产生增强的荧光信号，用于对目标miRNA进行高灵敏
的的定量分析。

[0006] 本发明结合三维水凝胶载体、杂交链核酸扩增技术、阳离子交换荧光放大技术，设计了一种miRNA高灵敏分析方法。由于水凝胶具有良好的抗非特异性吸附的性质，可以实现
复杂生物样品如细胞裂解液和血清中miRNA的特异性灵敏检测，在临床分析中具有很大的
应用前景。

[0007] 此外，通过改变捕获探针的序列，本发明除检测各种miRNA外，也可以检测DNA。

[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0009] 基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法，所述方法以水凝胶为检测平台，通过紫外光固化在硅烷化的玻璃基片上构建水凝胶阵列；待测目标分子打开修饰在
水凝胶上的捕获探针的发卡后，暴露出来的DNA单链引发发卡H1、H2间的杂交链反应，在传
感位点处生成长链DNA串联物；标记在发卡H1、H2上的生物素通过链霉亲和素将修饰有生物
+
素的量子点CdS固定到所述传感位点，在加入Ag和Rhod‑5N后，CdS发生阳离子交换反应，置
2+
换出来的Cd 与Rhod‑5N结合，产生灵敏的荧光信号，最后用数据采集系统记录信号并定量
分析。

[0010] 进一步地，所述水凝胶阵列：先通过硅烷化在玻璃基片表面修饰上带有碳碳双键的官能团，将PEG预聚体溶液滴加在基片表面并覆盖上光掩膜，通过紫外光照射形成水凝胶
阵列。

[0011] 所述水凝胶阵列用于实现空间分辨，先通过硅烷化反应使得玻璃基片实现功能化，再通过紫外光固化系统和光掩膜制备8×3水凝胶阵列化的基片，每个基片上有24个供
检测的位点(由我们实验中所采用基片的大小决定的点数，实际上也可以通过缩小每个点
的面积来增加点数)。

[0012] 进一步地，所述水凝胶上的捕获探针：将掺杂在水凝胶内的功能化PEG分子的羧基活化后，滴加修饰有氨基的捕获探针，二者通过酰胺键结合；所述捕获探针设有发卡结构。

[0013] 所述通过酰胺键固定在水凝胶上的捕获探针的发卡结构可以被目标分子如miRNA打开，其有22个碱基互补配对，剩余22个碱基会暴露出来。(捕获探针发卡共44个用于杂交
的碱基，其与有22个碱基的目标物miRNA杂交后，剩余22个碱基就会暴露出来)。

[0014] 进一步地，所述捕获探针识别目标分子并与之发生杂交，使捕获探针的发卡结构打开进而释放出发卡茎部的一段序列，该段序列可作为后续所述杂交链反应的引发链；加
入发卡H1、H2，发生杂交链反应，在传感位点处形成长链DNA组装物。

[0015] 进一步地，所述发卡H1、H2带有生物素标记，通过生物素‑链霉亲和素特异结合反应，将生物素化量子点CdS结合到传感位点。

[0016] 进一步地，每个阵列点的荧光强度与目标分子的浓度成正相关，利用标准曲线法，则可求得检测样品中目标分子的浓度。

[0017] 进一步地，通过选择或改变所述捕获探针的序列，所述方法可分析检测的目标分子为各种核酸如miRNA或DNA。

[0018] 所述的基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法在复杂生物样品中miRNA或DNA的灵敏检测中的应用。本发明以构建的三维水凝胶阵列为反应平台，结合核酸
放大技术和离子晶体介导的荧光放大技术，发展了一种基于水凝胶的HCR和阳离子交换的
荧光分析方法。制备硅烷化玻璃基片，在基片表面修饰上带有碳碳双键的官能团，将PEG预
聚体溶液均匀滴加在基片表面并覆盖上光掩膜，通过紫外光照射形成水凝胶阵列。捕获探
针上的氨基与水凝胶内的羧基共价结合，反应结束后冲洗，制得可用于miRNA检测的阵列。
当加入待测样品时，目标物miRNA识别探针并打开其发卡，暴露出的一段单链，该单链在加
入发卡H1、H2后引发H1、H2间的相继杂交打开，组装成长串DNA链，通过H1、H2上标记的生物
素，经链霉亲和素将生物素功能化的量子点固定在DNA长链上，加入Ag+和Rhod‑5N发生阳离
子交换反应，从而获得灵敏的荧光信号。

[0019] 检测步骤如下：

[0020] (1)在修饰了捕获探针的水凝胶阵列上滴加待测样品，进行温育，发生杂交反应将探针的发卡结构打开；

[0021] (2)冲洗后加入生物素化的发卡H1、H2进行温育，发生杂交链反应；

[0022] (3)再冲洗后依次加入链霉亲和素和生物素化的量子点，温育后冲洗，随后加入Ag+和Rhod‑5N混合液，通过芯片扫描仪进行荧光分析；

[0023] (4)利用标准曲线法，求出待测样品中如miRNA的浓度。

[0024] 本发明测定目标分子(如miRNA)的原理如下：

[0025] 如图1和图2所示：普通的玻璃片通过硅烷化反应成为有碳碳双键功能化基团的基片，PEG‑DA分子通过紫外光引发的自由基聚合反应借助光掩膜在基片表面形成水凝胶阵
列。将掺杂在水凝胶内功能化PEG分子的羧基活化后，滴加修饰有氨基的捕获探针，二者通
过酰胺键结合。冲洗后加入目标miRNA，37℃下进行温育。过程中发卡状的探针分子识别
miRNA并与之发生杂交，使发卡打开进而释放出发卡茎部的一段序列，该段序列可作为杂交
链反应的引发链，冲洗后加入修饰了生物素的发卡H1、H2，发生杂交链反应，在传感位点处
形成长链DNA组装物，冲洗除去未反应的发卡，滴加链霉亲和素以及生物素化的量子点CdS，
+ 2+
冲洗去多余的量子点，加入Ag 和Rhod‑5N，CdS发生阳离子交换反应，交换出来的Cd 结合
Rhod‑5N，荧光增强，通过芯片扫描仪对荧光值读数。每个阵列点的荧光强度与目标miRNA的
浓度成正相关，使用标准溶液获得工作曲线，则可求得不同检测样品中miRNA的浓度，实现
复杂生物样品中目标miRNA的高灵敏高特异性荧光定量分析。

[0026] 上述的分析方法，反应液为1×SPSC(0.75M NaCl 50mM Na2HPO4,pH 7.4)缓冲液，冲洗液为含0.05％吐温‑20的0.01M PBS，pH7.4。该反应液是所有DNA/RNA杂交反应的缓冲
液。

[0027] 现有的HCR放大信号的能力有限，而基于阳离子交换反应的荧光放大方法放大信号的能力很强，但其多在均相溶液中进行，大都需要磁珠进行分离，且需要的溶液体积较
大，不利于低丰度物质的检测。本发明借助于三维水凝胶平台，增大了探针负载量，减少了
反应的立体位阻，相比于传统的二维界面更有利于HCR的进行，提高放大效率；而且本发明
首次实现了界面上的阳离子交换反应，避免了磁珠的使用，简化了实验操作，相比于溶液相
阳离子交换，检测液体积仅有10微升，更有利于低丰度物质的检测。

[0028] 本发明设计了一种简单、温和、特异、灵敏的miRNA荧光定量新分析方法，其具有以下特点：

[0029] (1)本方法以三维水凝胶为传感平台，相比于传统的二维界面，减少了反应的立体阻碍，同时增加了探针的负载量，提高了反应效率，水溶液般的反应动力学有利于反应的充
分进行；

[0030] (2)该方法通过固定在水凝胶内的捕获探针识别目标分子如miRNA，进而引发DNA间杂交与组装，将一个识别事件转化为DNA级联反应放大信号，实现对低丰度miRNA的灵敏
检测；

[0031] (3)通过引入水凝胶内基于阳离子交换反应的荧光放大，数以千计的染料分子的荧光被增强，检测信号被放大，提高检测灵敏度，且无需磁珠分离和复杂的清洗步骤，操作
简单，成本低廉；

[0032] (4)信号读出简便，利用基因芯片扫描仪对信号进行定量，荧光值可由数据分析系统直接读出。

附图说明

[0033] 图1为为玻璃片硅烷化及水凝胶阵列的制备；

[0034] 图2为基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法应用于对microRNA的检测；

[0035] 图3为本发明方法总体示意图。

具体实施方式

[0036] 实施例1：结合附图1，玻璃片硅烷化及水凝胶阵列的制备

[0037] (1)硅烷化基片的制备：将普通玻璃片分别用丙酮、乙醇和去离子水各超声清洗2min，氮气吹干后再用等离子体清洗机处理，活化表面羟基，之后放入含0.05％(v/v)硅烷
化试剂(3‑丙烯酰氧基丙基三氯硅烷)的无水甲苯中，在充满氮气的手套袋内放置1小时。之
后再用甲苯，乙醇和去离子水清洗玻片，氮气吹干后放在100℃烘箱内固化2小时，保存在干
燥箱内备用。

[0038] (2)制备水凝胶阵列：首先配制预聚体溶液，将7.5％(v/v)PEG‑DA(MW700),22.5％(v/v)20mM PEG‑DA水溶液(MW 3400),40％(v/v)PEG(MW 200),15％(v/v)20mM Acryl‑PEG‑
COOH水溶液,以及10％(v/v)656mM光引发剂(2‑羟基‑2‑甲基苯丙酮)溶解在去离子水中混
匀避光备用(各物质前面的百分数就是该物质占整个预聚体溶液的比例，各成分之间是
7.5:22.5:40:15:10，剩余的是去离子水)。将上述溶液滴加在硅烷化的玻片表面，加一片盖
2
玻片使溶液均匀布满整个基片，盖上光掩膜，放在365nm紫外光下照射1.5秒(80mW/cm)，用
去离子水冲洗掉未反应的PEG，将此水凝胶阵列基片浸泡在去离子水中备用。

[0039] 实施例2：结合附图2，以miRNA‑21为例，说明该基于水凝胶的HCR和阳离子交换反应的荧光分析方法用于对microRNA的检测

[0040] (1)探针修饰：将水凝胶阵列的羧基用0.4M EDC/0.1M NHS的MES缓冲液(25mM,pH 5.5)室温下活化40分钟，冲洗后每个阵列点滴加10μL 0.5μM捕获探针CP，放在湿盒中在室
温下过夜反应。

[0041] (2)杂交链反应：首先在每个阵列点滴加10μL含有不同浓度标准miRNA或待测样品，37℃温育1小时，冲洗后滴加10μL 1μM杂交链发卡H1、H2的等量混合溶液，37℃温育2小
时，捕获探针的DNA单链引发H1、H2间的杂交链反应，在传感位点(被目标物打开的捕获探针
处就是传感位点)出组装形成长串DNA双链。

[0042] (3)阳离子交换反应：向每个阵列点滴加10μL 0.01mg/mL的链霉亲和素，室温下反应1小时，冲洗后加入10μM生物素化的量子点CdS，温育后冲洗。滴加2μL含有500μM Ag+和2μ
M Rhod‑5N的0.1M KAc(pH 7.4)混合液。

[0043] (4)荧光分析：将进行阳离子交换反应后的水凝胶基片用基因芯片扫描仪对每个阵列点的荧光进行定量，利用532nm的激发波长通道，读取荧光值，制作相应标准曲线并获
得待测样品中miRNA的浓度。

[0044] 以上所述仅为本发明的优选例实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的
权利要求保护范围之内。