微环境控释型功能化水凝胶、其制备方法及应用转让专利
申请号 : CN201910180252.X
文献号 : CN111748041B
文献日 : 2021-09-14
发明人 : 戴建武 , 范彩霞 , 赵燕南
申请人 : 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
摘要 :
本发明公开了一种微环境控释型功能化水凝胶、其制备方法及应用。所述微环境控释型功能化水凝胶，其包括GSH修饰的胶原凝胶材料，以及与所述GSH修饰的胶原凝胶材料结合的GST‑TIMP‑bFGF蛋白。所述GST‑TIMP‑bFGF蛋白主要由GST标签与bFGF融合表达并在GST标签与bFGF之间插入MMP底物短肽TIMP而形成。本发明将GST‑TIMP‑bFGF结合到GSH修饰的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，既能响应心肌梗死微环境刺激，裂解其底物短肽释放bFGF，促进血管生成，又可以抑制MMP活性，促进心肌梗死心功能恢复，减轻梗死部位心肌不良重构，可应用于心肌梗死的治疗。
权利要求 :
1.一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白，其特征在于：所述蛋白由GST标签、MMP底物短肽TIMP与bFGF融合表达所得，其中TIMP‑bFGF的氨基酸序列由如SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列编码。
2.权利要求1所述GST‑TIMP‑bFGF蛋白的引物对，所述引物对包括第一引物和第二引物，其特征在于：所述第一引物的序列如SEQ ID NO. 1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种微环境控释型功能化水凝胶，其特征在于包括GSH修饰的胶原凝胶材料，以及与所述GSH修饰的胶原凝胶材料结合的如权利要求1所述的GST‑TIMP‑bFGF蛋白。
4.根据权利要求3所述的微环境控释型功能化水凝胶，其特征在于：所述GSH修饰的胶原凝胶材料通过酶与底物的方式负载所述的GST‑TIMP‑bFGF蛋白；其中，12mg所述GSH修饰的胶原凝胶材料负载的GST‑TIMP‑bFGF蛋白的量为0.4 0.8nmol。
~
5.权利要求3‑4中任一项所述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有响应心肌梗死微环境刺激释放bFGF促进血管生成的功能。
6.权利要求3‑4中任一项所述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制MMP活性的功能。
7.权利要求3‑4中任一项所述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有促进心肌梗死心功能恢复的功能。
8.权利要求3‑4中任一项所述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有减轻梗死部位心肌不良重构的功能。
9.一种在心肌梗死部位诱导血管化并保护梗死心肌组织的功能产品，其特征在于包含权利要求3‑4中任一项所述微环境控释型功能化水凝胶。
说明书 :
微环境控释型功能化水凝胶、其制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微环境控释型功能化水凝胶，具体涉及一种具有高结合力的微环境控释型GST‑TIMP‑bFGF蛋白结合到GSH修饰的功能化水凝胶及其制备方法，以及其在制备
治疗心肌梗死产品中的应用，属于生物医学材料技术领域。
治疗心肌梗死产品中的应用，属于生物医学材料技术领域。
背景技术
[0002] 心肌梗死是目前世界范围内心血管死亡和致残的主要原因，是由冠状动脉闭塞缺血缺氧所导致的不可逆的心肌损伤。心肌梗死后，上调的基质金属蛋白酶(matrix
metalloproteinases，MMPs)特别是MMP‑2降解细胞外基质(ECM)，降低组织力学性能，导致
梗死区域心室壁逐渐变薄，整体扩张，加速心功能恶化。因此，原位恢复梗死区域的血供，减
轻ECM降解已成为治疗心肌梗死的潜在治疗手段。研究证明心肌内注射生物材料和生物活
性因子(如血管生成因子或MMP抑制剂)利于心肌梗死后心功能的恢复。然而，由于生物活性
因子释放不当，目前疗法在很大程度上还局限于实验室和临床实验，通常表现为损伤区药
物累积较低(无效)和药物诱导的严重副作用(毒性)。
metalloproteinases，MMPs)特别是MMP‑2降解细胞外基质(ECM)，降低组织力学性能，导致
梗死区域心室壁逐渐变薄，整体扩张，加速心功能恶化。因此，原位恢复梗死区域的血供，减
轻ECM降解已成为治疗心肌梗死的潜在治疗手段。研究证明心肌内注射生物材料和生物活
性因子(如血管生成因子或MMP抑制剂)利于心肌梗死后心功能的恢复。然而，由于生物活性
因子释放不当，目前疗法在很大程度上还局限于实验室和临床实验，通常表现为损伤区药
物累积较低(无效)和药物诱导的严重副作用(毒性)。
[0003] 微环境控释的实现以生物活性因子与生物材料的结合为前提。生物材料递送因子有的通过物理包裹、物理结合的方式，这类方式属于被动扩散，不太受调控；有的通过化学
交联的方式，而直接交联可能会影响因子的活性；本案发明人前期发明的胶原特异结合区
(CBD)的融合表达不改变因子的生物活性，又可提高与胶原材料的结合力，但其应用只局限
于胶原材料，不能用于胶原材料之外的生物材料。
交联的方式，而直接交联可能会影响因子的活性；本案发明人前期发明的胶原特异结合区
(CBD)的融合表达不改变因子的生物活性，又可提高与胶原材料的结合力，但其应用只局限
于胶原材料，不能用于胶原材料之外的生物材料。
[0004] 生长因子通过诱导血管生成广泛应用于心肌梗死的治疗。碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是最有效的血管生成因子之一，已在动物和
临床试验中得到广泛研究。心肌内可注射生物材料不仅可以为脆弱的心室壁提供结构支
撑，增强心室壁顺应性，同时为药物的控制释放提供平台。
临床试验中得到广泛研究。心肌内可注射生物材料不仅可以为脆弱的心室壁提供结构支
撑，增强心室壁顺应性，同时为药物的控制释放提供平台。
[0005] 因此，开发可与多种生物材料高结合，又能主动响应体内刺激的生物活性因子可能具有更广阔的应用前景。
发明内容
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种具有高结合力的微环境控释型功能化水凝胶及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
[0007] 本发明的另一目的在于提供前述微环境控释型功能化水凝胶在制备治疗心肌梗死产品中的应用。
[0008] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0009] 本发明实施例提供了一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白，它主要由GST标签与bFGF融合表达并在GST标签与bFGF之间插入MMP底物短肽TIMP而形成。
[0010] 本发明实施例还提供了一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白的引物对，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID
NO.2所示。
NO.2所示。
[0011] 本发明实施例还提供了一种微环境控释型功能化水凝胶，其包括GSH修饰的胶原凝胶材料，以及与所述GSH修饰的胶原凝胶材料结合的前述的GST‑TIMP‑bFGF蛋白。
[0012] 进一步地，所述微环境控释型功能化水凝胶具有响应MMP裂解其底物短肽释放bFGF和抑制MMP活性的功能。
[0013] 本发明实施例还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有响应心肌梗死微环境刺激释放bFGF促进血管生成的功能。
[0014] 本发明实施例还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制MMP活性的功能。
[0015] 本发明实施例还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有促进心肌梗死心功能恢复的功能。
[0016] 本发明实施例还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有减轻梗死部位心肌不良重构的功能。
[0017] 本发明实施例还提供了一种用于心肌梗死的功能产品，其包含前述微环境控释型功能化水凝胶。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点包括：
[0019] 本发明构建了一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白，即将GST标签与bFGF融合表达并在两者之间插入MMP底物短肽(TIMP)，同时对水凝胶修饰GSH，将GST‑TIMP‑bFGF生物结合到GSH修饰
的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，既能响应心肌梗死微环境刺
激，裂解其底物短肽释放bFGF，促进血管生成及成熟，同时可以发挥MMP抑制剂作用抑制MMP
活性减轻心肌ECM降解，降低MMP水平保护梗死心肌组织。
的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，既能响应心肌梗死微环境刺
激，裂解其底物短肽释放bFGF，促进血管生成及成熟，同时可以发挥MMP抑制剂作用抑制MMP
活性减轻心肌ECM降解，降低MMP水平保护梗死心肌组织。
附图说明
[0020] 图1为本发明一典型实施例中微环境控释型功能化水凝胶的制备过程及在大鼠心肌梗死区域药物释放过程的示意图。
[0021] 图2A为本发明一典型实施例中利用Sulfo‑SMCC偶联GSH和胶原凝胶制备微环境控释型功能化水凝胶的示意图。
[0022] 图2B为本发明一典型实施例中微环境控释型功能化水凝胶(胶原‑GSH)的扫描电镜图像。
[0023] 图2C为本发明一典型实施例中经GSH修饰前、后水凝胶的应变扫描图。
[0024] 图2D和图2E分别为本发明一典型实施例中经GSH修饰前、后水凝胶的1H NMR谱图。
[0025] 图3A为本发明一典型实施例中GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF的表达结构示意图。
[0026] 图3B为本发明一典型实施例中SDS‑PAGE电泳分析纯化后的GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF蛋白示意图。
[0027] 图3C为本发明一典型实施例中Western blot鉴定纯化蛋白结果示意图。
[0028] 图3D为本发明一典型实施例中重组蛋白GST‑TIMP‑bFGF的活性检测示意图。
[0029] 图3E为本发明一典型实施例中不同浓度下bFGF标准品、GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF蛋白促进Balb/c 3T3细胞增殖能力的比较示意图。
[0030] 图3F为本发明一典型实施例中GST‑TIMP‑bFGF与胶原‑GSH结合实验过程图。
[0031] 图3G为本发明一典型实施例中bFGF和GST‑TIMP‑bFGF与胶原‑GSH的结合曲线图。
[0032] 图3H为本发明一典型实施例中GST‑TIMP‑bFGF与胶原和胶原‑谷胱甘肽的结合曲线图。
[0033] 图4A为本发明一典型实施例中MMP‑2介导的bFGF在不同时间点的累积释放结果示意图。
[0034] 图4B为本发明一典型实施例中CCK‑8检测MMP‑2介导释放的bFGF刺激Balb/c 3T3细胞增殖的能力示意图。
[0035] 图4C为本发明一典型实施例中检测不同浓度GST‑TIMP‑bFGF对MMP‑2活性的抑制作用示意图。
[0036] 图5A为本发明一典型实施例中向心肌梗死大鼠心肌内注射微环境控释型功能化水凝胶的过程示意图。
[0037] 图5B为本发明一典型实施例中各组动物超声心动图代表性图片。
[0038] 图5C为本发明一典型实施例中各组动物舒张末期左室内径示意图。
[0039] 图5D为本发明一典型实施例中各组动物收缩末期左室内径示意图。
[0040] 图5E为本发明一典型实施例中各组动物左室短轴缩短率示意图。
[0041] 图5F为本发明一典型实施例中各组动物射血分数示意图。
[0042] 图6A‑图6B分别为本发明一典型实施例中采用HE和Masson染色心脏切片的代表性图像。
[0043] 图6C为本发明一典型实施例中采用HE和Masson染色检测梗死区定量分析左室壁厚度示意图。
[0044] 图6D为本发明一典型实施例中采用HE和Masson染色检测梗死区定量分析胶原含量示意图。
[0045] 图7A为本发明一典型实施例中α‑SMA、VWF、CD31和MMP‑2、MMP‑9的组织化学染色示意图。
[0046] 图7B为本发明一典型实施例中定量分析心肌梗死大鼠心肌组织血管化情况示意图。
[0047] 图7C为本发明一典型实施例中定量分析心肌梗死大鼠心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达水平示意图。
具体实施方式
[0048] MMPs是锌内肽酶家族的一员，具有裂解所有ECM成分的能力，被认为是细胞外基质重构的关键调节剂，其特征是在多种病理中过度表达或过度活跃，如癌症和心力衰竭。MMPs
水平升高已被证实可导致心肌梗死后不良心室重构。MMP‑2的上调最早发生在心梗后1小
时，并持续3周以上。MMP‑9在心肌梗死后2小时开始上调，在24小时表现出非常明显的活性。
这暗示研发人员可以以心肌梗死后上调表达的MMPs作为微环境响应的靶点，来设计和构建
调控心肌梗死微环境的环境响应型高效功能生物材料；同时可能抑制MMPs活性减少继发性
损伤。由于MMPs在细胞外空间的积累，以及MMPs在各种疾病中过表达的意义，MMPs可能成为
触发药物释放的优秀靶分子。
水平升高已被证实可导致心肌梗死后不良心室重构。MMP‑2的上调最早发生在心梗后1小
时，并持续3周以上。MMP‑9在心肌梗死后2小时开始上调，在24小时表现出非常明显的活性。
这暗示研发人员可以以心肌梗死后上调表达的MMPs作为微环境响应的靶点，来设计和构建
调控心肌梗死微环境的环境响应型高效功能生物材料；同时可能抑制MMPs活性减少继发性
损伤。由于MMPs在细胞外空间的积累，以及MMPs在各种疾病中过表达的意义，MMPs可能成为
触发药物释放的优秀靶分子。
[0049] 谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签蛋白利用GST与谷胱甘肽(GSH)之间酶与底物的特异性作用力可实现GST标签蛋白的高度纯化。而GST标签蛋白表达系统非常成熟，存在现成
的GST标签载体。因此，采用GST标签载体融合表达生长因子，可实现生长因子与交联GSH的
生物材料特异性结合，提高结合能力。
的GST标签载体。因此，采用GST标签载体融合表达生长因子，可实现生长因子与交联GSH的
生物材料特异性结合，提高结合能力。
[0050] 基于以上分析，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其首先检验了GST‑TIMP‑bFGF促进Balb/c 3T3细胞增殖的能力，首次将GST‑TIMP‑bFGF生物
结合到GSH修饰的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，它既能促进血
管生成，又能降低MMP水平保护梗死心肌组织。通过体外和体内试验证明，GST‑TIMP‑bFGF重
组因子可以与生物材料高效结合，并能响应MMP‑2从材料上释放下来；经GST‑TIMP‑bFGF修
饰的胶原凝胶可以创造一个合适的心梗修复微环境以诱导血管新生及成熟，并降低了心室
不良重构，最终促进了心功能恢复。
结合到GSH修饰的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，它既能促进血
管生成，又能降低MMP水平保护梗死心肌组织。通过体外和体内试验证明，GST‑TIMP‑bFGF重
组因子可以与生物材料高效结合，并能响应MMP‑2从材料上释放下来；经GST‑TIMP‑bFGF修
饰的胶原凝胶可以创造一个合适的心梗修复微环境以诱导血管新生及成熟，并降低了心室
不良重构，最终促进了心功能恢复。
[0051] 如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0052] 本发明实施例的一个方面提供的一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白，它主要由GST标签与bFGF融合表达并在GST标签与bFGF之间插入MMP底物短肽TIMP而形成。
[0053] 进一步地，所述GST‑TIMP‑bFGF蛋白中TIMP‑bFGF表达序列如SEQ ID NO.3所示，具体为ggcccgctgggcctggcgggcggcgcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggc
agcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgca
tccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaaga
gagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggct
tctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaagga
aatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaa
agctatactttttcttccaatgtctgctaagagc，将TIMP‑bFGF表达序列插入到带有GST表达标签的
载体中与GST融合表达成GST‑TIMP‑bFGF。
agcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgca
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agctatactttttcttccaatgtctgctaagagc，将TIMP‑bFGF表达序列插入到带有GST表达标签的
载体中与GST融合表达成GST‑TIMP‑bFGF。
[0054] 本发明实施例的另一个方面提供的一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白的引物对，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序
列如SEQ ID NO.2所示。
列如SEQ ID NO.2所示。
[0055] 本发明实施例的另一个方面还提供了一种微环境控释型功能化水凝胶，其包括GSH修饰的胶原凝胶材料，以及与所述GSH修饰的胶原凝胶材料结合的前述的GST‑TIMP‑
bFGF蛋白。
bFGF蛋白。
[0056] 为了实现材料的响应释放，本案发明人构建了一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白，即将GST标签与bFGF融合表达并在两者之间插入MMP底物短肽(TIMP)，同时对水凝胶修饰GSH。这样，
用GST‑TIMP‑bFGF结合的GSH修饰水凝胶既能响应MMP裂解其底物短肽释放bFGF，也能消耗
MMP及其活性。
用GST‑TIMP‑bFGF结合的GSH修饰水凝胶既能响应MMP裂解其底物短肽释放bFGF，也能消耗
MMP及其活性。
[0057] 进一步地，所述GSH修饰的胶原凝胶材料通过酶与底物的方式负载所述的GST‑TIMP‑bFGF蛋白。
[0058] 进一步地，12mg(1ml 12mg/mL)所述GSH修饰的胶原凝胶材料负载的GST‑TIMP‑bFGF蛋白的量为0.4～0.8nmol。
[0059] 进一步地，所述微环境控释型功能化水凝胶具有响应MMP裂解其底物短肽释放bFGF和抑制MMP活性的功能。
[0060] 综上，本发明的微环境控释型功能化水凝胶不仅可以响应心肌梗死微环境刺激释放bFGF促进血管生成，同时可以发挥MMP抑制剂作用抑制MMP活性减轻心肌ECM降解。
[0061] 本发明实施例的另一个方面还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有响应心肌梗死微环境刺激释放bFGF促进血管生成的功能。
[0062] 本发明实施例的另一个方面还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制MMP活性的功能。
[0063] 本发明实施例的另一个方面还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有促进心肌梗死心功能恢复的功能。
[0064] 本发明实施例的另一个方面还提供了前述微环境控释型功能化水凝胶于制备产品中的应用，所述产品至少具有减轻梗死部位心肌不良重构的功能。
[0065] 本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于心肌梗死的功能产品，其包含前述微环境控释型功能化水凝胶。
[0066] 藉由上述技术方案，本发明将GST‑TIMP‑bFGF结合到GSH修饰的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，既能响应心肌梗死微环境刺激，裂解其底物短肽释
放bFGF，促进血管生成，又可以抑制MMP活性，促进心肌梗死心功能恢复，减轻梗死部位心肌
不良重构，可应用于心肌梗死的治疗。
放bFGF，促进血管生成，又可以抑制MMP活性，促进心肌梗死心功能恢复，减轻梗死部位心肌
不良重构，可应用于心肌梗死的治疗。
[0067] 以下通过若干实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
[0068] 实施例1
[0069] 一、微环境控释型功能化水凝胶(以下可简称为胶原‑GSH水凝胶)的制备及表征
[0070] 如图1所示，为微环境控释型功能化水凝胶的制备及在大鼠心肌梗死区域药物释放过程的示意图。图1中A表示通过蛋白重组的方法制备的GST‑TIMP‑bFGF蛋白，B表示通过
化学交联的方法将GSH结合到胶原水凝胶上形成胶原‑GSH水凝胶。C表示GST‑TIMP‑bFGF与
胶原‑GSH水凝胶混合。D表示大鼠心肌内注射混合水凝胶。E表示在心梗损伤微环境下，底物
肽段被MMP‑2/9裂解，释放特异性靶向多肽。
化学交联的方法将GSH结合到胶原水凝胶上形成胶原‑GSH水凝胶。C表示GST‑TIMP‑bFGF与
胶原‑GSH水凝胶混合。D表示大鼠心肌内注射混合水凝胶。E表示在心梗损伤微环境下，底物
肽段被MMP‑2/9裂解，释放特异性靶向多肽。
[0071] 本实施例中胶原凝胶获取自大鼠尾腱。采用Sulfo‑SMCC两步反应法将GSH与胶原凝胶进行化学交联，制备出一种特异性结合GST标签因子的功能性水凝胶。图2A显示了富含
氨基和巯基的胶原蛋白和GSH的易接合性。扫描电镜显示冻干的水凝胶具有明显的多孔微
观结构，可以为生长因子提供足够的空间。水凝胶在室温下可以很容易地通过29G针头注射
(图2B)。使用流变仪表征经GSH修饰前、后水凝胶的力学性能，具体为胶原和胶原‑GSH的应
‑1
变扫描(频率＝6.283rad.s )，结果显示胶原‑GSH的弹性模量和粘性模量分别为220Pa和
40Pa，修饰前则为140Pa和30Pa(图2C)。在1％‑100％的应变范围内，弹性模量和粘性模量均
表现出较弱的应变依赖性，且弹性模量比相应的粘性模量大5倍左右，说明是以水凝胶的形
式存在。另外，胶原‑GSH水凝胶的力学性能比修饰前要大，可能是新形成的化学键起了作
1
用。以C2H3DO2和D2O为溶剂，采用H NMR法测定了胶原‑GSH水凝胶的化学组分，在波谱中可以
看到各组分的特征峰(图2D和图2E)，证实了胶原经GSH修饰后化学结构的改变。
氨基和巯基的胶原蛋白和GSH的易接合性。扫描电镜显示冻干的水凝胶具有明显的多孔微
观结构，可以为生长因子提供足够的空间。水凝胶在室温下可以很容易地通过29G针头注射
(图2B)。使用流变仪表征经GSH修饰前、后水凝胶的力学性能，具体为胶原和胶原‑GSH的应
‑1
变扫描(频率＝6.283rad.s )，结果显示胶原‑GSH的弹性模量和粘性模量分别为220Pa和
40Pa，修饰前则为140Pa和30Pa(图2C)。在1％‑100％的应变范围内，弹性模量和粘性模量均
表现出较弱的应变依赖性，且弹性模量比相应的粘性模量大5倍左右，说明是以水凝胶的形
式存在。另外，胶原‑GSH水凝胶的力学性能比修饰前要大，可能是新形成的化学键起了作
1
用。以C2H3DO2和D2O为溶剂，采用H NMR法测定了胶原‑GSH水凝胶的化学组分，在波谱中可以
看到各组分的特征峰(图2D和图2E)，证实了胶原经GSH修饰后化学结构的改变。
[0072] 二、GST‑TIMP‑bFGF的表达、纯化及鉴定
[0073] 采用聚合酶链式反应将MMP‑2/9底物短肽编码序列与bFGF154互补DNA连接。GST‑TIMP‑bFGF的引物序列为AAGGATCCGGCCCGCTGGGCCTGGCGGGCGGCGCAGCCGGGAGCATCAC(SEQ ID
NO.1，正向引物，5’‑3’)和AAGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTG(SEQ ID NO.2，反向引物，5’‑
3’)。GST‑bFGF的引物序列为AAGGATCCGCAGCCGGGAGCATCAC(SEQ ID NO.4，正向引物，5’‑3’)
和AAGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTG(SEQ ID NO.5，反向引物，5’‑3’)。将GST‑bFGF和GST‑
TIMP‑bFGF的编码序列插入pGEX‑6P‑1中，经PCR和测序验证MMP‑2/9底物短肽的编码序列与
bFGF序列拼接成功。然后将构建好的载体转化大肠杆菌BL21细胞。经IPTG诱导表达后，SDS‑
PAGE分析显示在优化的实验条件下GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF均优先在上清液中表达。图
3A示出了GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF的表达结构示意图。进一步地，用肝素‑琼脂糖重力柱
纯化上清液，图3B示出了SDS‑PAGE电泳分析纯化后的GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF蛋白示意
图。经western blot鉴定，纯化的蛋白含有bFGF和GST两种片段，且GST‑TIMP‑bFGF的分子量
大于GST‑bFGF，说明成功插入表达了MMP‑2/9底物短肽(图3C)。
NO.1，正向引物，5’‑3’)和AAGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTG(SEQ ID NO.2，反向引物，5’‑
3’)。GST‑bFGF的引物序列为AAGGATCCGCAGCCGGGAGCATCAC(SEQ ID NO.4，正向引物，5’‑3’)
和AAGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTG(SEQ ID NO.5，反向引物，5’‑3’)。将GST‑bFGF和GST‑
TIMP‑bFGF的编码序列插入pGEX‑6P‑1中，经PCR和测序验证MMP‑2/9底物短肽的编码序列与
bFGF序列拼接成功。然后将构建好的载体转化大肠杆菌BL21细胞。经IPTG诱导表达后，SDS‑
PAGE分析显示在优化的实验条件下GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF均优先在上清液中表达。图
3A示出了GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF的表达结构示意图。进一步地，用肝素‑琼脂糖重力柱
纯化上清液，图3B示出了SDS‑PAGE电泳分析纯化后的GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF蛋白示意
图。经western blot鉴定，纯化的蛋白含有bFGF和GST两种片段，且GST‑TIMP‑bFGF的分子量
大于GST‑bFGF，说明成功插入表达了MMP‑2/9底物短肽(图3C)。
[0074] 图3D示出了重组蛋白GST‑TIMP‑bFGF的活性检测示意图。图3E示出了不同浓度下bFGF标准品、GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF蛋白促进Balb/c 3T3细胞增殖能力的比较示意图。
[0075] 三、GST‑TIMP‑bFGF的GSH靶向能力
[0076] 胶原‑GSH水凝胶通过酶与底物的方式负载GST‑TIMP‑bFGF，其中GST和GSH都必不可少。为了验证GST‑TIMP‑bFGF对GSH的靶向能力，采用多重比较的方法(无GST或无GSH)分
析不同浓度下bFGF结合到胶原上的量，图3F示出了GST‑TIMP‑bFGF与胶原‑GSH结合实验过
程。如图3G所示，示出了bFGF和GST‑TIMP‑bFGF与胶原‑GSH的结合曲线图。在405nm处，不同
浓度下GST‑TIMP‑bFGF结合胶原‑GSH水凝胶的光密度值都高于bFGF，并且从最初浓度到最
终浓度都呈现出了显著的差异。另一方面，GST‑TIMP‑bFGF与胶原的结合能力较胶原‑GSH明
显降低，图3H示出了GST‑TIMP‑bFGF与胶原和胶原‑谷胱甘肽的结合曲线图。其中*P<
0.05，**P<0.01。这些结果表明，GST和GSH对重组bFGF与生物材料的结合都是必要的。
析不同浓度下bFGF结合到胶原上的量，图3F示出了GST‑TIMP‑bFGF与胶原‑GSH结合实验过
程。如图3G所示，示出了bFGF和GST‑TIMP‑bFGF与胶原‑GSH的结合曲线图。在405nm处，不同
浓度下GST‑TIMP‑bFGF结合胶原‑GSH水凝胶的光密度值都高于bFGF，并且从最初浓度到最
终浓度都呈现出了显著的差异。另一方面，GST‑TIMP‑bFGF与胶原的结合能力较胶原‑GSH明
显降低，图3H示出了GST‑TIMP‑bFGF与胶原和胶原‑谷胱甘肽的结合曲线图。其中*P<
0.05，**P<0.01。这些结果表明，GST和GSH对重组bFGF与生物材料的结合都是必要的。
[0077] 四、MMP响应性与bFGF释放
[0078] 微环境控释型功能化水凝胶可以通过MMP介导的GST与bFGF之间底物肽裂解释放bFGF。为了评价MMPs对MMP响应性系统释放bFGF的具体调控作用，本案发明人进行了MMP‑2
存在下的体外释放实验。如图4A所示为MMP‑2介导的bFGF在不同时间点的累积释放结果示
意图，在MMP‑2干预的过程中，bFGF的释放量逐渐增加。无论是MMP‑2缺失还是MMP‑2抑制的
情况下，MMP响应系统释放的bFGF都要比MMP‑2存在时低得多，说明该系统可以特异性响应
MMP‑2，并通过裂解将bFGF作为药物分子释放。在MMP‑2存在下评价GST‑bFGF在胶原‑GSH上
的释放谱，进一步证实bFGF通过MMP‑2水解底物肽释放。以上结果表明，bFGF可以通过响应
MMPs从MMP响应性水凝胶中主动释放，从而可能允许与心肌梗死程度一致的bFGF按需释放。
存在下的体外释放实验。如图4A所示为MMP‑2介导的bFGF在不同时间点的累积释放结果示
意图，在MMP‑2干预的过程中，bFGF的释放量逐渐增加。无论是MMP‑2缺失还是MMP‑2抑制的
情况下，MMP响应系统释放的bFGF都要比MMP‑2存在时低得多，说明该系统可以特异性响应
MMP‑2，并通过裂解将bFGF作为药物分子释放。在MMP‑2存在下评价GST‑bFGF在胶原‑GSH上
的释放谱，进一步证实bFGF通过MMP‑2水解底物肽释放。以上结果表明，bFGF可以通过响应
MMPs从MMP响应性水凝胶中主动释放，从而可能允许与心肌梗死程度一致的bFGF按需释放。
[0079] 五、GST‑TIMP‑bFGF体外条件下的活性和功能鉴定
[0080] 根据释放的bFGF刺激成纤维细胞增殖的能力评价其生物学活性。CCK‑8检测累积释放24小时的bFGF刺激的Balb/c 3T3细胞的增殖活性(如图4B所示)。选取GST‑TIMP‑bFGF+
PBS、GST‑TIMP‑bFGF+MMP‑2、GST‑TIMP‑bFGF+MMP‑2+Marimastat和GST‑bFGF+MMP‑2组释放
的bFGF进行生物活性检测。以无bFGF的释放介质作为对照。对照组的相对生物活性设为
100％。各个实验组的生物活性均高于对照组(图4B)，说明所释放的bFGF均能有效刺激成纤
维细胞增殖。因此，释放的bFGF仍然具有生物活性。此外，MMP‑2介导的bFGF释放溶液的相对
生物活性最高，加入MMP‑2抑制剂(Marimastat)后相对生物活性降低。同时，在MMP‑2或其底
物肽缺失的情况下，bFGF活性也低(图4B)。结果表明MMP‑2介导了更多的bFGF释放，这应该
与成纤维细胞的增殖活性相一致。
PBS、GST‑TIMP‑bFGF+MMP‑2、GST‑TIMP‑bFGF+MMP‑2+Marimastat和GST‑bFGF+MMP‑2组释放
的bFGF进行生物活性检测。以无bFGF的释放介质作为对照。对照组的相对生物活性设为
100％。各个实验组的生物活性均高于对照组(图4B)，说明所释放的bFGF均能有效刺激成纤
维细胞增殖。因此，释放的bFGF仍然具有生物活性。此外，MMP‑2介导的bFGF释放溶液的相对
生物活性最高，加入MMP‑2抑制剂(Marimastat)后相对生物活性降低。同时，在MMP‑2或其底
物肽缺失的情况下，bFGF活性也低(图4B)。结果表明MMP‑2介导了更多的bFGF释放，这应该
与成纤维细胞的增殖活性相一致。
[0081] 为了检测GST‑TIMP‑bFGF抑制MMP‑2裂解MMP‑2底物的作用，不同浓度的新鲜制备的GST‑bFGF和GST‑TIMP‑bFGF被用于试验。首先，本案发明人检测了已知的MMPs抑制剂抑制
MMP‑2活性的效果，并设置了排除不同因素的对照(图4C)。图4C示出了检测不同浓度GST‑
TIMP‑bFGF对MMP‑2活性的抑制作用示意图。其中，(SC＝Substrate Control,VC＝Vehicle
Control,IC＝Inhibitor Control)。*P<0.05，**P<0.01。图4C显示，波长为405nm下，载体对
照的吸光度明显高于底物对照，加入MMPs抑制剂之后吸光度降低。与GST‑bFGF处理组相比，
GST‑TIMP‑bFGF处理组的MMP‑2活性显著降低，说明GST‑TIMP‑bFGF确实可以起到MMP抑制剂
的作用。
MMP‑2活性的效果，并设置了排除不同因素的对照(图4C)。图4C示出了检测不同浓度GST‑
TIMP‑bFGF对MMP‑2活性的抑制作用示意图。其中，(SC＝Substrate Control,VC＝Vehicle
Control,IC＝Inhibitor Control)。*P<0.05，**P<0.01。图4C显示，波长为405nm下，载体对
照的吸光度明显高于底物对照，加入MMPs抑制剂之后吸光度降低。与GST‑bFGF处理组相比，
GST‑TIMP‑bFGF处理组的MMP‑2活性显著降低，说明GST‑TIMP‑bFGF确实可以起到MMP抑制剂
的作用。
[0082] 六、微环境控释型功能化水凝胶在心肌梗死动物模型中的治疗评价
[0083] 1.大鼠冠状动脉左前降支结扎致心肌缺血动物模型的建立
[0084] 雄性SD大鼠200‑220g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。所有动物均提前一周订购，在新环境下饲养一周适应环境。
[0085] 1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，冠状动脉左前降支永久结扎诱导急性心肌梗死模型。实验动物随机分为5组，分别为生理盐水注射组，水凝胶注射组，水凝胶担载bFGF注
射组，水凝胶担载GST‑bFGF注射组，以及水凝胶担载GST‑TIMP‑bFGF注射组。分别在每只大
鼠的心肌梗死区域周围分五个点注射等体积的盐水或单纯的水凝胶或担载因子水凝胶。同
时将不经结扎却注射同体积盐水的大鼠设为假手术组。
射组，水凝胶担载GST‑bFGF注射组，以及水凝胶担载GST‑TIMP‑bFGF注射组。分别在每只大
鼠的心肌梗死区域周围分五个点注射等体积的盐水或单纯的水凝胶或担载因子水凝胶。同
时将不经结扎却注射同体积盐水的大鼠设为假手术组。
[0086] 2.微环境控释型功能化水凝胶促进大鼠心肌梗死后心功能恢复
[0087] 术后30天，采用超声心动检测了各组动物的心脏功能，如图5A‑图5F所示。图5A示出了向心肌梗死大鼠心肌内注射微环境控释型功能化水凝胶的过程示意图。与假手术组相
比，其余5个实验室大鼠左室内径明显增大，左室收缩功能明显下降(图5B‑图5F)，其中图5B
为各组动物超声心动图代表性图片，图5C为舒张末期左室内径示意图，图5D为收缩末期左
室内径示意图，图5E为左室短轴缩短率示意图，图5F为射血分数示意图，*P<0.05，**P<
0.01，***P<0.001。添加bFGF、GST‑bFGF或GST‑TIMP‑bFGF的功能性水凝胶，与盐水或水凝胶
组相比，均能降低舒张末期左室内径和收缩末期左室内径，改善心肌梗死后心脏的左室短
轴短缩率和射血分数。并且与水凝胶+bFGF或GST‑bFGF相比，水凝胶加载GST‑TIMP‑bFGF
(MMP响应性水凝胶)治疗能够更有效地缓解心功能障碍。
比，其余5个实验室大鼠左室内径明显增大，左室收缩功能明显下降(图5B‑图5F)，其中图5B
为各组动物超声心动图代表性图片，图5C为舒张末期左室内径示意图，图5D为收缩末期左
室内径示意图，图5E为左室短轴缩短率示意图，图5F为射血分数示意图，*P<0.05，**P<
0.01，***P<0.001。添加bFGF、GST‑bFGF或GST‑TIMP‑bFGF的功能性水凝胶，与盐水或水凝胶
组相比，均能降低舒张末期左室内径和收缩末期左室内径，改善心肌梗死后心脏的左室短
轴短缩率和射血分数。并且与水凝胶+bFGF或GST‑bFGF相比，水凝胶加载GST‑TIMP‑bFGF
(MMP响应性水凝胶)治疗能够更有效地缓解心功能障碍。
[0088] 3.微环境控释型功能化水凝胶减轻梗死部位心肌不良重构
[0089] 为了评价功能水凝胶对心室重构的影响，采用HE和Masson染色检测梗死区左室壁厚度和胶原沉积。图6A‑图6B示出了采用HE和Masson染色心脏切片的代表性图像。心肌梗死
后30天，心脏横切片显示左室壁明显变薄，胶原沉积明显。与盐水组相比，注射载有bFGF、
GST‑bFGF或GST‑TIMP‑bFGF的水凝胶均可缓解左室壁变薄(图6A、图6C)，减少胶原含量(图
6B、图6D)，*P<0.05，**P<0.01。并且水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF组心肌梗死大鼠心室壁最厚，胶
原积累最少(图6C、图6D)，这与超声心动的数据相一致。以上结果表明，微环境控释型功能
化水凝胶的bFGF释放能够较好地维持左心室的几何形状，减少心室重构。
后30天，心脏横切片显示左室壁明显变薄，胶原沉积明显。与盐水组相比，注射载有bFGF、
GST‑bFGF或GST‑TIMP‑bFGF的水凝胶均可缓解左室壁变薄(图6A、图6C)，减少胶原含量(图
6B、图6D)，*P<0.05，**P<0.01。并且水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF组心肌梗死大鼠心室壁最厚，胶
原积累最少(图6C、图6D)，这与超声心动的数据相一致。以上结果表明，微环境控释型功能
化水凝胶的bFGF释放能够较好地维持左心室的几何形状，减少心室重构。
[0090] 4.微环境控释型功能化水凝胶在心肌梗死部位诱导血管化并保护梗死心肌组织
[0091] 术后30天，本案发明人通过α‑SMA,vWF和CD31染色检测了缺血心肌的血管化情况(图7A)。与其它实验组相比，水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF治疗明显增加梗死区域的血管密度(图
7B)。生理盐水组、水凝胶组、水凝胶+bFGF组、水凝胶+GST‑bFGF组间差异无统计学意义。图
7C示出了定量分析心肌梗死大鼠心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达水平示意图。上调的MMPs
调控bFGF按需释放明显增加了血管密度，表明水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF治疗对心肌梗死后血
管化更为有利。
7B)。生理盐水组、水凝胶组、水凝胶+bFGF组、水凝胶+GST‑bFGF组间差异无统计学意义。图
7C示出了定量分析心肌梗死大鼠心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达水平示意图。上调的MMPs
调控bFGF按需释放明显增加了血管密度，表明水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF治疗对心肌梗死后血
管化更为有利。
[0092] 为探讨MMP响应性水凝胶对心肌梗死的保护作用，本案发明人采用免疫组织化学染色法检测了心肌梗死后30天MMP‑2和MMP‑9的表达(图7A)。如图7C所示，心肌梗死大鼠心
肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达增加，通过水凝胶治疗(添加/不添加bFGF或重组bFGF)心肌
梗死大鼠心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达减弱，其中*P<0.05，**P<0.01。与其它各组相比，
水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF组心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达明显降低。这说明了心肌注射水
凝胶+GST‑TIMP‑bFGF对胶原沉积、左室重构及心功能障碍具有有效的保护作用。
肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达增加，通过水凝胶治疗(添加/不添加bFGF或重组bFGF)心肌
梗死大鼠心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达减弱，其中*P<0.05，**P<0.01。与其它各组相比，
水凝胶+GST‑TIMP‑bFGF组心肌组织中MMP‑2和MMP‑9的表达明显降低。这说明了心肌注射水
凝胶+GST‑TIMP‑bFGF对胶原沉积、左室重构及心功能障碍具有有效的保护作用。
[0093] 综合分析以上结果，本发明发明人构建了一种GST‑TIMP‑bFGF蛋白，即将GST标签与bFGF融合表达并在两者之间插入MMP底物短肽(TIMP)，同时对水凝胶修饰GSH，将GST‑
TIMP‑bFGF生物结合到GSH修饰的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，
既能响应心肌梗死微环境刺激，裂解其底物短肽释放bFGF，促进血管生成及成熟，同时可以
发挥MMP抑制剂作用抑制MMP活性减轻心肌ECM降解，降低MMP水平保护梗死心肌组织。
TIMP‑bFGF生物结合到GSH修饰的胶原凝胶上形成了具有高结合力的bFGF修饰的生物材料，
既能响应心肌梗死微环境刺激，裂解其底物短肽释放bFGF，促进血管生成及成熟，同时可以
发挥MMP抑制剂作用抑制MMP活性减轻心肌ECM降解，降低MMP水平保护梗死心肌组织。
[0094] 应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都
属于本发明的保护范围。
属于本发明的保护范围。