一种谷胱甘肽修饰的杂化材料及其制备与应用转让专利
申请号 : CN201910243194.0
文献号 : CN111748121B
文献日 : 2021-09-28
发明人 : 欧俊杰 , 马淑娟 , 张路伟 , 叶明亮
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
权利要求 :
1.一种乙烯基杂化材料的制备方法,其特征在于:首先以四乙氧基硅烷和7‑辛烯基三甲氧基硅烷作为前驱体,采用溶胶‑凝胶法制备了一种表面具有乙烯基的杂化材料;
具体制备方法按如下步骤操作,乙烯基杂化材料的制备:首先称取5 50 mg十二胺和10~40 mg CTAB放入离心管中,并~
加入50 300 μL乙醇和50 300 μL水,超声溶解形成均一溶液后,在冰浴下加入10 300 μL四~ ~ ~
乙氧基硅烷和10 300 μL 7‑辛烯基三甲氧基硅烷,再放入温度为35~55 ℃的水浴中反应~
12~48 h;将得到杂化材料用体积比为1/2 2/1的乙醇/水溶液洗涤2 5次,50 100 ℃真空~ ~ ~
干燥12~24 h,得到乙烯基杂化材料。
2.一种权利要求1制备方法制备获得的乙烯基杂化材料。
3.一种谷胱甘肽修饰的杂化材料的制备方法,其特征在于:谷胱甘肽修饰的杂化材料的采用光引发巯基‑烯反应进行修饰制备,光引发剂为2,2‑二甲氧基‑苯基苯乙酮(2,2‑dimethoxy‑2‑phenylacetophenone,DMPA);
谷胱甘肽修饰的杂化材料的制备:首先将谷胱甘肽和0.3 3.0 mg的光引发剂溶解在乙~
醇体积含量为20% 80%的水溶液中,得到修饰液;其次将权利要求1所述制备获得的乙烯基~
杂化材料10 400 mg平铺于直径为1 10 cm的表面皿中,吸取1 10 mL谷胱甘肽修饰液于表~ ~ ~
面皿中,使材料完全浸没于溶液之中,然后将表面皿至于紫外灯下曝光10 30 min;取出后~
用药勺搅动杂化材料,再添加1 10 mL谷胱甘肽修饰液;再次将表面皿至于紫外灯下曝光10~
30 min;用乙醇体积含量为20% 80%的水溶液洗涤所得到的材料2 4次,50 100 ℃真空干~ ~ ~ ~
燥12~24 h,得到谷胱甘肽修饰的杂化材料。
4.一种权利要求3制备方法制备获得的谷胱甘肽修饰的杂化材料。
5.一种权利要求4所述谷胱甘肽修饰的杂化材料的应用,其特征在于:谷胱甘肽修饰的杂化材料作为富集材料应用于生物样品中糖肽的分离富集。
说明书 :
一种谷胱甘肽修饰的杂化材料及其制备与应用
技术领域
背景技术
50%以上的蛋白质都会在其一生的某个阶段发生糖基化修饰。许多与人类相关疾病都与蛋
白质糖基化表达程度差异和糖链异常结构变化相关,分析和鉴定蛋白质糖基化修饰对疾病
标志物发现和疾病诊断具有重要意义(文献1.Lowe,J.B.,Glycosylation,immunity,and
autoimmunity[J].Cell,2001,104(6):809‑812.)。目前临床上常用的癌症生物标志物中大
部分为糖基化蛋白质,比如甲胎蛋白是肝癌的生物标志物,前列腺特异性抗原是前列腺癌
的生物标志物(文献2.Krueger,K.E.,Srivastava,S.,Posttranslational protein
modifications:current implications for cancer detection,prevention,and
therapeutics[J].Mol.Cell.Proteomics,2006,5(10):1799‑1810.文献3.Polanski,M.,
Anderson,N.L.,Polanski,M.,Anderson,N.L.,A List of Candidate Cancer Biomarkers
for Targeted Proteomics[J].Biomarker Insights,2007,1:1‑48.)。然而在糖基化修饰
研究中,糖基化蛋白质相对丰度较低,酶解后产生的糖基化肽段仅占蛋白质酶解肽段的2~
5%,在质谱分析中的信号受到非糖基化肽段的抑制,因此,需要高效的分离富集方法去除
糖基化样品中的非糖基化蛋白质或肽段。目前富集糖肽的主要方法有凝集素亲和色谱法,
硼酸亲和色谱法,酰肼化学法,二氧化钛亲和色谱法和亲水相互作用色谱法。其中HILIC在
选择性、重复性、质谱兼容性等方面的优势,使其在糖肽富集中得到越来越多的青睐。但目
前亲水法所使用的富集材料大都存在制备过程繁琐、周期较长等缺陷。因此,发展一种制备
方法简单的亲水富集材料依然是研究人员的重点。
发明内容
在冰浴下加入50~200mg四乙氧基硅烷和50~200mg 7‑辛烯基三甲氧基硅烷,再放入温度
为35~55℃的水浴中反应12~48h;将得到杂化材料用乙醇/水溶液(1/1,v/v)洗涤三次,60
℃真空干燥12~24h,得到乙烯基功能化的杂体材料。
平铺于直径为1~10cm的表面皿中,吸取1~10mL谷胱甘肽修饰液于表面皿中,使材料完全
浸没于溶液之中。然后将表面皿至于紫外灯下曝光10~30min。取出后用药勺轻轻搅动杂化
材料,添加1~10mL谷胱甘肽修饰液。再次将表面皿至于紫外灯下曝光10~30min。用乙醇含
量为20%~80%的水溶液洗涤所得到的材料2~4次,60℃真空干燥12~24h,得到谷胱甘肽
修饰的杂化材料。
附图说明
具体实施方式
硅烷和100mg 7‑辛烯基三甲氧基硅烷,再放入温度为40℃的水浴中反应24h;将得到杂化材
料用乙醇/水溶液(1/1,v/v)洗涤三次,60℃真空干燥12h,得到乙烯基功能化的杂体材料。
径为2cm的表面皿中,吸取5mL谷胱甘肽修饰液于表面皿中,使材料完全浸没于溶液之中。然
后将表面皿至于紫外灯下曝光20min。取出后用药勺轻轻搅动杂化材料,添加5mL谷胱甘肽
修饰液。再次将表面皿至于紫外灯下曝光20min。用乙醇含量50%的水溶液洗涤所得到的材
料3次,60℃真空干燥12h,得到谷胱甘肽修饰的杂化材料。
基硅烷和100mg 7‑辛烯基三甲氧基硅烷,再放入温度为40℃的水浴中反应24h;将得到杂化
材料用乙醇/水溶液(1/1,v/v)洗涤三次,60℃真空干燥12h,得到乙烯基功能化的杂体材
料。
径为2cm的表面皿中,吸取5mL谷胱甘肽修饰液于表面皿中,使材料完全浸没于溶液之中。然
后将表面皿至于紫外灯下曝光20min。取出后用药勺轻轻搅动杂化材料,添加5mL谷胱甘肽
修饰液。再次将表面皿至于紫外灯下曝光20min。用乙醇含量50%的水溶液洗涤所得到的材
料3次,60℃真空干燥12h,得到谷胱甘肽修饰的杂化材料。
再加入40μmol碘代乙酰胺,避光40min,用100mM的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释成1M,按照
与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶,在37℃的水浴中反应时间16h,获得的酶解液
除盐,冻干后保存在‑20℃的冰箱中备用。
荡10min。离心,除去上清液。然后采用上样液(400μL×3次)清洗,以除去非糖肽和其他杂
质。接着加入60μL洗脱液(ACN/H2O/TFA,30:69.9:0.1,v/v/v)并室温震荡10min后,混合物
离心,取上清液用Triple TOF 5600质谱进行MALDI‑TOF/MS分析。另外,可将上清液冷冻干
燥后,加入60μL含1000U PNGase F酶的10mmol/L NH4HCO3溶液(pH=8.0),37℃下孵育12h,
以除去糖基片段。最后去糖基化肽段采用MALDI‑TOF/MS或者nano‑LC‑MS/MS方法进行分析。
基三甲氧基硅烷的红外谱图中,波数2974和2889cm 处的吸收峰为Si‑O‑C2H5中的C‑H伸缩
‑1 ‑1
振动。而波数1391、1296cm 处的吸收峰为‑CH3中C‑H的对称弯曲振动。1100与1073cm 处的
吸收峰为Si‑O‑C2H5中的Si‑O伸缩振动。自由基反应完成后,得到的杂化材料的红外谱图中
‑1 ‑1
出现了1602cm 处的C=C伸缩振动峰,1391、1296cm 处归属于‑CH3中的C‑H的对称弯曲振
‑1 ‑1
动,而1100与1073cm 处归属于Si‑O‑C2H5中的Si‑O伸缩振动双峰被1080cm 处Si‑O‑Si的
Si‑O宽峰取代。这说明合成的杂化材料中引入了C=C官能团,这为材料的后期修饰提供了
有利条件。
485cm/g,孔体积为0.20cm/g,有明显的4.0nm左右的介孔。
前,谱图中峰强度较高的信号绝大多数为非糖肽,糖肽的信号几乎都被抑制了,仅检测出一
条。用材料富集后,如图5b所示,非糖肽明显减少,可以检测到20条典型的N‑连接糖肽。为了
验证富集的肽段均为糖肽,肽段采用PNGase F酶进行去糖基化处理。结果发现,图5b中的糖
肽信号基本消失,图5c中仅能见到两条明显的肽段信号(EEQFNSTFR,m/z=1158.65;
EEQYNSTYR,m/z=1190.32),这说明功能材料从IgG中所富集的肽段均为糖肽。
蛋白质酶解液进行富集。富集后在C18硅胶分析柱上的色谱分离图如图6所示,三次独立分
析鉴定结果如图7所示。通过对搜库结果的处理计算,总共鉴定到了来自711个蛋白的1638
条糖肽以及674个糖基化位点。这一结果,与文献报道的使用两性金团簇颗粒以及使用聚酰
亚胺和麦芽糖分步修饰的磁性纳米颗粒作为HILIC吸附剂时的效果相当,但是本专利所采
用的方法更加简单,成本也更加低廉。
例1相同的步骤制备杂化材料。
附/脱附曲线如图4c,d所示,BET测试比表面积为1493m/g,孔体积为0.63cm/g。孔径分布图
上看不出有明显的介孔,说明材料中含有大量的微孔。在IgG酶解液中仅富集到了15条糖
肽,低于同等条件下实施案例1所制备的材料的糖肽富集效果(图8a),这可能归因于实施案
例2合成的预聚液中7‑辛烯基三甲氧基硅烷单体含量较低,导致合成的杂化材料中可供亲
水修饰的乙烯基基团较少,加上微孔里的活性位点利用率较低,进一歩导致亲水富集效果
的下降。
图8b所示,同等条件下仅可以从IgG酶解液中富集出9条糖肽。这说明较长的间隔臂可以提
高谷胱甘肽的键合量,有利于糖肽的富集。