一种维斯假丝酵母及其应用

摘要

本发明公开了一种维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113、其应用和一种发酵生产长链二元酸的方法及其制备的长链二元酸。本发明的维斯假丝酵母CAES2113在pH值低于或高于7.0的环境下可长时间保持高活力，具有较高的氧气利用率；能有效减少发酵过程中碱液的用量和后续长链二元酸提取时酸的用量，简化了二元酸产品的提取工艺，使长链二元酸生产工艺中产生的盐的量大幅度减少。本发明制备方法还具有产酸量高、适用于多种类的长链二元酸生产等诸多优点。与现有生产工艺相比，不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业化价值优势。

权利要求

1.一种维斯假丝酵母（Candida viswanathii）CAES2113，其保藏编号为CCTCC NO：M 

2020048。

2.如权利要求1所述的维斯假丝酵母CAES2113在发酵生产长链二元酸中的应用，所述长链二元酸为化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7。

3.一种发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的维斯假丝酵母CAES2113进行发酵生产长链二元酸。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时控制发酵体系的pH值为7.0以上或7.0以下。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时，所述菌株生长至稀释30倍后的菌体光密度OD620大于0.5时，控制发酵体系的pH值为7.0以上或7.0以下。

6.如权利要求3或5所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时，所述菌株生长至稀释30倍后的菌体光密度OD620大于0.5时，控制发酵体系的pH值为4.0 6.8。

~

7.如权利要求3或5所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时，所述菌株生长至稀释30倍后的菌体光密度OD620大于0.5时，控制发酵体系的pH值为5.0 6.5。

~

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时，控制溶氧在5%以上。

9.如权利要求3或8所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时，控制溶氧为10~

30%。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵生产长链二元酸时，控制温度为28 32~℃，通风量0.1 0.7vvm，罐压0.03 0.14MPa。

~ ~

11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵底物包括烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的任意一种或几种的组合。

12.如权利要求3或11所述的方法，其特征在于，发酵底物包括C9 C22的正烷烃。

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13.一种长链二元酸的制备方法，包括：S1：发酵制得长链二元酸发酵液；以及

S2：对所得的长链二元酸发酵液进行提取、精制处理制得所述长链二元酸；

其中，所述步骤S1采用权利要求3 12任一项所述的方法制得所述长链二元酸发酵液。

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14.如权利要求13所述的制备方法制得的长链二元酸。

说明书

一种维斯假丝酵母及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术和生物发酵领域，具体涉及一种维斯假丝酵母及其应用。

背景技术

[0002] 长链二元酸是指碳链中含有10个及以上碳原子的脂肪族二羧酸(简称DCn)，包括饱和二 羧酸及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中高性能 聚酰胺纺织品、高性能聚酰胺工程塑料、合成高级香料、高档聚酰胺热熔胶、高温电解质、耐 寒增塑剂、高级润滑油、高级油漆和涂料、医药和农药等的重要原料。生物发酵法生产长链二 元酸可以以石油副产物蜡油、烷烃、脂肪酸或其衍生物等为原料，在低温、低压下利用微生物 特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用发酵生产长链二元酸，因此具有原料来源广，生产工艺 简单，生产条件温和等优点，较传统的化学合成法具有明显的优势。

[0003] 假丝酵母属(Candida)的酵母菌是一类发酵生产二元酸的常用高产微生物。酵母菌发酵 生产长链二元酸的发酵过程通常分为菌体生长期和产酸期两大阶段。张志禹(微生物学杂 质,1998,18(4):17‑20)报道了二元酸分泌是烷烃代谢过程中的重要步骤，pH在7.4～8.2范围内， 足够高的pH对分泌和产酸是必需的；中国发明专利CN1292072C公开了通过微生物发酵法转化 为相应的长链二元酸时，pH：发酵前期菌体生长3.5～6.5；发酵中后期转化7.0～8.5。发酵过 程中，特别是在产酸期要将发酵液的pH值调整到7.0以上，主要是因为较多假丝酵母菌在偏碱 性环境下具有更高的酶活力和催化效率；碱性环境还可使长链二元酸以二元酸盐的形式存在， 促进发酵过程的传质。因此，发酵过程通常需要添加大量的碱来中和不断生成的长链二元酸以 维持偏碱性环境，发酵结束后又需要使用大量的酸将体系中长链二元酸的盐重新转化为长链二 元酸，由此将产生大量高浓度盐发酵处理液，高盐废水的处理严重影响了生物法长链二元酸产 业的发展。

[0004] 此外，酵母菌发酵过程中通常需要充足的氧以维持代谢，并将烷烃等原料氧化成长链二元 酸，生产中可以通过控制通风量、罐压、搅拌器等的形式来提高溶氧能力，保持较高含氧量。

发明内容

[0005] 为了降低生物法长链二元酸产业中废水处理压力，进一步降低发酵工艺能耗和成本，本发 明的第一个目的是提供了一种新型维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113，其保藏编 号为CCTCC NO：M 2020048，其在7.0以上以及7.0以下的发酵体系中均具有很高活性，而且 具有更高的氧气利用率，非常适用于发酵生产长链二元酸。

[0006] 本发明所述的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113已于2020年2月24日进行生 物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号：CCTCC M 2020048，分类命名为Candida viswanathii。

[0007] 本发明的第二个目的是提供一种所述维斯假丝酵母菌的应用，所述长链二元酸包括化学式 HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7。

[0008] 本发明的第三个目的是提供一种发酵生产长链二元酸的方法，采用维斯假丝酵母 CAES2113进行发酵生产长链二元酸。

[0009] 本发明提供的发酵生产长链二元酸的方法中，发酵生产长链二元酸时控制发酵体系的pH 值为7.0以上或7.0以下。

[0010] 本发明提供的发酵生产长链二元酸的方法中，发酵生产长链二元酸时，所述菌株生长至稀 释30倍后的菌体光密度OD620大于0.5时，控制发酵体系的pH值为7.0以上或7.0以下；优选为 4.0～6.8；更优选为5.0～6.5。

[0011] 本发明提供的发酵生产长链二元酸的方法中，发酵生产长链二元酸时，控制溶氧在5％以 上，优选控制溶氧为10～30％。

[0012] 本发明提供的发酵生产长链二元酸的方法中，发酵底物包括烷烃、直链饱和脂肪酸、直链 饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的任意一种或几种的组合，优选包括C9～C22的正烷烃。

[0013] 本发明的第四个目的是提供一种长链二元酸的制备方法，包括

[0014] S1：发酵制得长链二元酸发酵液；以及

[0015] S2：对所得的长链二元酸发酵液进行提取、精制处理制得所述长链二元酸；

[0016] 其中，所述步骤S1采用前述技术方案任一项所述的方法制得所述长链二元酸发酵液。

[0017] 本发明的第五个目的是提供一种长链二元酸。

[0018] 本发明的有益效果在于：筛选得到了新的维斯假丝酵母菌株CAES2113，其在pH值低于或 高于7.0的环境下均可长时间保持高活力，并且具有较高的氧气利用率；而且能有效减少发酵 过程中碱液的用量和后续长链二元酸提取时酸的用量，简化了二元酸产品的提取工艺，使长链 二元酸生产工艺中产生的盐的量大幅度减少。本发明的制备方法还具有缩短发酵时间、提高产 酸量、减少培养基用量、适用于多种类的长链二元酸生产等诸多优点。与现有生产工艺相比， 不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业 化价值优势。

附图说明

[0019] 图1为本发明实施例1的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113的第一代的菌落形 态图片。

[0020] 图2为本发明实施例1的维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113的第六代的菌落形 态图片。

具体实施方式

[0021] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背 离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0024] 本发明提供了一种新型维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113，其保藏编号为 CCTCC NO：M 2020048，其在7.0以上以及7.0以下的发酵体系中均具有很高酶活性，不仅产 酸量高，而且能够有效降低高浓度含盐废水的处理压力；该菌株还具有较高的氧气利用率，控 制较低溶氧即可维持代谢和氧化能力，大大降低供氧能耗。

[0025] 本发明的第二个方面提供了所述维斯假丝酵母CAES2113的应用，该应用为维斯假丝 酵母CAES2113在发酵生产长链二元酸中的应用。

[0026] 本发明所述的长链二元酸(或称为LCDA、长链二羧酸、长链二酸)包括化学式 HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7；优选地，20≥n≥7；更优选地，18≥n≥7。本发明 所述的长链二元酸的实例包括：壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)、癸二酸(HOOC(CH2)8COOH)、 十一碳二元酸(HOOC(CH2)9COOH，1,9‑九碳二羧酸或1,11‑十一碳二元酸，本发明中标记为 “DC11”)、十二碳二元酸(HOOC(CH2)10COOH，1,10‑十碳二羧酸或1,12‑十二碳二元酸，本 发明中标记为“DC12”)、十三碳二元酸(HOOC(CH2)11COOH，1,11‑十一碳二羧酸或1,13‑十 三碳二元酸，本发明中标记为“DC13”)、十四碳二元酸(HOOC(CH2)12COOH，1,12‑十二碳二 羧酸或1,14‑十四碳二元酸，本发明中标记为“DC14”)、十五碳二元酸(HOOC(CH2)13COOH， 1,13‑十三碳二羧酸或1,15‑十五碳二元酸、本发明中标记为“DC15”)、十六碳二元酸 (HOOC(CH2)14COOH，1,14‑十四碳二羧酸或1,16‑十六碳二元酸，本发明中标记为“DC16”)、 十七碳二元酸(HOOC(CH2)15COOH，1,15‑十五碳二羧酸或1,17‑十七碳二元酸，本发明中标 记为“DC17”)、十八碳二元酸(HOOC(CH2)16COOH，1,16‑十六碳二羧酸或1,18‑十八碳二元 酸，本发明中标记为“DC18”)等。

[0027] 本发明的第三个方面提供了一种发酵生产长链二元酸的方法，其采用上述的维斯假丝酵 母CAES2113进行发酵以生产长链二元酸。

[0028] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，发酵生产长链二元酸时控 制发酵体系的pH值为7.0以上或7.0以下。

[0029] 发酵生产长链二元酸的过程可包括菌株生长期和产酸期。

[0030] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，在菌株生长期，菌株培养 生长时，控制体系的pH值为3.0以上，例如为3.5～6.5。在发酵的产酸期中，控制发酵体系的pH 值为7以上，例如为7.0～11.0，优选为7.0～8.5；或者，控制发酵体系的pH值为7以下，例如为4.0～6.8， 优选为5.0～6.5。

[0031] 在一些优选地实施方式中，当菌株生长至菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时， 控制发酵体系的pH值为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5；具体的pH值示例可以为： 3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8， 4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，
6.6， 6.7，6.8，6.9，7.0。pH值的调节或控制方式没有特别限制，可以是恒控某一pH值、不控制 pH值、不低于某pH值、不高于某pH值、上调pH值、下调pH值、从范围外控制进入或自 然进入所述pH值范围内的方式中的一种或多种的组合。本发明对于pH值的调控方法亦不做 限定，可采用发酵领域的常用手段，如加入适当浓度的酸或碱液。

[0032] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵生产长链二 元酸时，控制溶氧在5％以上，优选为10～30％，具体可以是10～15％，15～20％，20～25％ 或25～30％。

[0033] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，所述发酵过程中控制 温度为28～32℃，通风量0.1～0.7vvm，罐压(表压)0.03～0.14MPa。

[0034] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，发酵转化过程可在发酵培 养基或缓冲溶液中进行。具体而言，当维斯假丝酵母CAES2113培养至菌体稀释三十倍后 OD620大于0.5时，可加入发酵底物进行发酵转化。当发酵转化过程于发酵培养基中进行 时，可直接向培养基中加入底物，也可将菌株转移至发酵罐中，再加入发酵培养基和底物 进行发酵转化；当发酵转化过程于缓冲溶液中进行时，可先将培养得到的菌体进行分离， 转至缓冲溶液中，并加入底物进行发酵转化。

[0035] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，发酵的底物包括烷烃、直 链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的任意一种或几种的组合，优选包括 C9～C22的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16或C18的正烷烃。

[0036] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，当于发酵培养基中进行发 酵转化时，发酵使用的培养基的成分可选地包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等。其中，碳 源可以为假丝酵母可发酵性糖，包括：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯 糖和山梨醇等，所述碳源的添加量可以为1％～10％(w/v)；氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸钾、硝酸铵等，所述氮源的添加量可以为0.1％～3％(w/v)；无机盐 包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜、氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢 钠、磷酸氢二钠等，所述无机盐的添加量可以为0.1％～1.5％(w/v)；营养因子包括：维生素B1、 维生素B2，维生素C、生物素、氨基酸等，所述营养因子的添加量可以为0％～1％(w/v)。

[0037] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵培养基包括以下 成分：葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～0.9％、酵母膏0.1％～0.5％、硝酸钾0.05％～1.2％、磷酸二氢 钾0.05％～1.0％、尿素0.05％～0.3％、硫酸铵0.05％～0.3％以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)。

[0038] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵培养基包括以下 成分：葡萄糖1％～5％、硝酸钾0.05％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.6％、硫酸铵0.05％～0.3％以及 硫酸镁0.05％～0.3％(w/v)。

[0039] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，当发酵转化过程于缓冲溶 液中进行时，缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲溶液。在一个优选实施方式中，缓冲溶液可以为磷酸 二氢钾‑磷酸氢二钠缓冲溶液。

[0040] 在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，发酵过程中，维斯假丝酵 母CAES2113的接种量可以为10％～30％。

[0041] 具体地，本发明所述的发酵生产长链二元酸的方法包括如下步骤：

[0042] (1)菌种活化培养：取维斯假丝酵母CAES2113的甘油管菌种接种于装有YPD培养液的种 子瓶中，pH自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。

[0043] (2)种子培养：取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％，接种 后发酵体系的起始pH值为6.0～6.8，28～32℃下，通风量0.3～0.7vvm，罐压
0.05～0.14MPa，培养 成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为大于0.5，更优为OD620为0.5～
1.0。

[0044] 优选使用的种子培养基包含如下成分：蔗糖1％～3％、玉米浆0.15％～1％、酵母膏0.2％～1.5％、 KH2PO4 0.4％～1.5％、尿素0.05％～0.5％。

[0045] (3)发酵培养：将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种 后起始体积为4～6L，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加0～10％(v/v， 相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度28～32℃，通风量约为0.3～
0.7vvm，罐压(表 压)约为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧在5％以上。控制发酵液的pH值，发 酵起始pH约为5.0～6.8，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH为3.0以上，待菌体 光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH值为7.0以下，优选为
4.0～6.8，更优选为5.0～6.5， 直至发酵结束。在发酵周期为10～20小时时开始批次加入发酵底物，控制发酵液中发酵底物含 量不超过10％。

[0046] 本发明的第四个方面提供了一种长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：

[0047] S1：发酵制得长链二元酸发酵液；以及

[0048] S2：对所得的长链二元酸发酵液进行提取、精制处理制得所述长链二元酸；

[0049] 其中，步骤S1采用本发明的第三个方面的发酵生产长链二元酸的方法来制得所述长链二 元酸发酵液。

[0050] 本发明的长链二元酸的制备方法中，对所得的长链二元酸发酵液可采用现有的提取、精 制工艺来制得最终的长链二元酸产品，例如PCT国际公开专利PCT/CN2016/089615中公开的 从发酵液中分离长链二元酸的方法。

[0051] 在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个实施方式中，步骤S2的提取、精制处理可 包括以下过程：将所得的长链二元酸发酵液酸化，分离得固形物，再将所述固形物溶解在有机 溶剂中，分离得清液，结晶，由此得到长链二元酸。

[0052] 在一个优选的实施方式中，酸化的pH值可以为2.5～5，优选可以为3～4；在另一个优选 的实施方式中，酸化后分离固形物的分离方式可以为离心、过滤等方式；在另一个优选的实施 方式中，用于溶解固形物的有机溶剂可以为醇、酸、酮和酯的一种或多种，包括但不限于甲醇、 乙醇、异丙醇、正丁醇等醇，乙酸等酸，丙酮等酮，乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯；在另一个优选 的实施方式中，固形物溶解在有机溶剂后进行脱色，再分离得到清液，脱色的方法优选使用活 性炭脱色，活性炭的添加量为溶液中二元酸含量的0.1～10wt％，脱色的温度为85～100℃，脱 色的时间为15～165min；在另一个优选的实施方式中，分离清液后，降温结晶，降温结晶可包 括以下步骤：首先降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶；在另一个优 选的实施方式中，结晶之后，分离出所得晶体，由此得到长链二元酸，分离晶体的方式可以为 卧螺离心式过滤、板框过滤、厢式过滤、转鼓过滤、真空负压过滤等方式。

[0053] 在根据本发明发酵生产长链二元酸的方法的一些实施例中，在10L发酵罐发酵工艺中， 与传统工艺相比，可节约至少60％碱用量；另一些实施例中，可以节约90％左右的碱用量。

[0054] 本发明的第五个方面提供了前述长链二元酸的制备方法制得的长链二元酸产品。

[0055] 下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出， 实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

[0056] 如没有特别说明，按照发酵领域常识，本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％ 表示g/100mL。

[0057] 本发明实施例及对比例采用本领域技术人员熟知的技术，例如中国专利ZL 95117436.3公 开的测定方法测定发酵液中的二元酸浓度，具体测定过程为：用盐酸溶液调节发酵液的pH到 3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉 末，将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液 中的二元酸滴定量。

[0058] 如下实施例中使用的YPD培养基配方为：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％；种子培 养基配方为：蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.8％，尿素0.3％；发酵培养基 配方为：葡萄糖4％、玉米浆0.5％、酵母膏0.4％、硝酸钾1％、磷酸二氢钾0.1％、尿素0.12％、 硫酸铵0.06％以及氯化钠0.1％。

[0059] 实施例1维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113菌株的获得

[0060] 从油田废渣筛选了维斯假丝酵母(Candida viswanathii)，经过物理诱变处理得到维斯假丝 酵母(Candida viswanathii)CAES2113菌株。

[0061] 1、样品采集：山西潞安煤制油示范厂采集的石蜡油废渣样。

[0062] 2、采集标本的菌种分离：将采集到的样品分别制成稀释度为10‑3、10‑4、10‑5、10‑6的稀 释液并分别在YPD培养基平板上进行涂布。培养条件为30℃，48小时。经多次分离培养，获 得酵母菌的纯化单菌落。

[0063] 3、鉴定：使用ITS(Internal Transcribed Spacer)序列鉴定，对步骤2获得的纯化单菌落ITS 序列进行DNA测序，并与已知维斯假丝酵母(Candida viswanathii)的ITS序列(如SEQ ID NO:1 所示)比较，鉴定其属于维斯假丝酵母。ITS序列可参考GenBank号MK394122.1。

[0064] 4、诱变筛选：将步骤2获得的纯化单菌落进行测试分离得到一株产长链二元酸含量最高 的菌株，然后以其作为出发菌株进行诱变筛选。

[0065] 将出发菌株甘油管接入装有YPD培养基的摇瓶中，并加入0.01％的5‑氟尿嘧啶，30℃、 200rpm震荡培养20h。取生长好的培养液离心收集菌体并用生理盐水洗涤3～5次，用10％的 甘油水溶液悬浮细胞，利用ARTP进行诱变，处理条件为：功率120W，气量10SLM，距离 
2mm，处理时间为100s，经过诱变的菌株在包含有YPD培养基的平板上培养50h，培养温度 29℃，挑取生长良好的单克隆至装有初筛培养基(培养基中包含发酵底物十二碳烷烃)的孔板， 29℃下自然pH值发酵，摇床转速220rpm，发酵周期70小时。发酵结束后初筛，从中挑取相 对高产长链二元酸的菌株，然后再将这些菌株经孔板进行复筛，复筛的菌株再经过
500ml摇瓶 发酵复筛，500ml摇瓶发酵在29℃下自然pH值发酵，摇床转速220rpm，发酵周期
110小时。 最终得到稳定高产菌株，命名为维斯假丝酵母菌株CAES2113，保存于甘油管中。

[0066] 实施例2维斯假丝酵母(Candida viswanathii)CAES2113菌株的稳定性验证

[0067] 本发明的维斯假丝酵母CAES2113，经连续传代实验验证，其形态、生长和生产性能的稳 定性良好。经五次传代后菌落形态未出现明显变化：菌落表面光滑湿润呈乳白色有光泽、圆形、 边缘整齐(如图1和图2所示)。结果表明，维斯假丝酵母CAES2113的传代稳定性良好。

[0068] 将第一代和第六代菌株进行摇瓶发酵生产DC12的性能验证：取1支维斯假丝酵母 CAES2113的甘油管种子接入YPD培养基中，培养24h后接种于种子培养基，在30℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.8(稀释30倍测定)。将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶 中，发酵培养基中还添加底物十二碳烷烃，添加量为235mL/L。在30℃条件下发酵，发酵结束 后，测定第一代和第六代菌株的DC12产量分别为185.7g/L和186.3g/L。

[0069] 实施例3～9维斯假丝酵母CAES2113在10L发酵罐中发酵生产不同二元酸

[0070] 取维斯假丝酵母CAES2113的甘油管菌种接种于装有30ml YPD培养基的种子瓶中，pH 自然，29℃下，220rpm摇床培养1天。取摇瓶种子接入装有5L种子培养基的种子罐中，接 种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风量0.4vvm，罐压0.08MPa，培养 18h，培养过程中pH自然下降至3，种子液菌体光密度(OD620)长至0.7(稀释30倍)时 接种到含有6L发酵培养基的发酵罐中，接种量20％(v/v)，发酵过程控制温度30℃，通风 量为
0.4vvm，罐压约为0.12MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧在15～20％。补加液碱控制 发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长， 发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍) 时，控制pH约为5.5，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制 发酵液中烷烃含量不超过10％(v/v)，发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵。

[0071] 实施例3～9分别按上述发酵方法，使用的烷烃分别为癸烷(实施例3)、十一碳烷烃(实 施例4)、十二碳烷烃(实施例5)、十三碳烷烃(实施例6)、十四碳烷烃(实施例7)、十 五碳烷烃(实施例8)、十六碳烷烃(实施例9)，进行发酵制得相应的长链二元酸，产量结 果如表1。

[0072] 表1维斯假丝酵母CAES2113的发酵结果

[0073] 实施例 原料 长链二元酸 产酸量(mg/g)实施例3 C10烷烃 DC10 141.4
实施例4 C11烷烃 DC11 127.3
实施例5 C12烷烃 DC12 186.4
实施例6 C13烷烃 DC13 149.1
实施例7 C14烷烃 DC14 164.8
实施例8 C15烷烃 DC15 154.9
实施例9 C16烷烃 DC16 155.7

[0074] 由表1结果可知，本发明的维斯假丝酵母CAES2113在菌体光密度(OD620)大于0.5(稀 释30倍)时，控制pH约为5.5(7.0以下)，使用底物长链烷烃可制备相应的长链二元酸， 且产量较高，可以适应多种长链二元酸的制备。

[0075] 实施例10～16维斯假丝酵母CAES2113在10L发酵罐中发酵生产不同二元酸

[0076] 实施例10～16与实施例3～9发酵生产二元酸的方法相同，区别在于：种子液菌体接种到发 酵罐中进行发酵后，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为7.2， 直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，发酵过程中控制发酵液内的烷 烃的浓度不高于10％(v/v)，发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发酵。

[0077] 实施例10～16分别按上述发酵方法，使用的烷烃分别为癸烷(实施例10)、十一碳烷烃 (实施例11)、十二碳烷烃(实施例12)、十三碳烷烃(实施例13)、十四碳烷烃(实施例 14)、十五碳烷烃(实施例15)、十六碳烷烃(实施例16)，进行发酵制得相应的长链二元 酸，产量结果如表2。

[0078] 表2维斯假丝酵母CAES2113在高pH下的发酵结果

[0079]实施例 原料 长链二元酸 产酸量(mg/g)
实施例10 C10烷烃 DC10 135.4
实施例11 C11烷烃 DC11 133.1
实施例12 C12烷烃 DC12 181.7
实施例13 C13烷烃 DC13 154.2
实施例14 C14烷烃 DC14 167.9
实施例15 C15烷烃 DC15 143.1
实施例16 C16烷烃 DC16 139.2

[0080] 由表2结果可知，本发明的维斯假丝酵母CAES2113在菌体光密度(OD620)大于0.5(稀 释30倍)时，控制pH约为7.2(7.0以上)，使用底物长链烷烃同样可制备相应的长链二元 酸，且产量较高，可以适应多种长链二元酸的制备。但是与实施例3～9相比，控制更高的pH 值将会消耗更多的碱液。

[0081] 实施例17维斯假丝酵母CAES2113在10L发酵罐中发酵生产十二碳二元酸

[0082] 取维斯假丝酵母CAES2113的甘油管菌种接种于装有25mL YPD培养基的种子瓶中，pH自 然，30℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有6L种子培养基的种子罐中，接种量为 20％，接种后体系的起始pH值为6.2，30℃下，通风量0.6vvm，罐压0.1MPa，培养20h，培养过 程中pH自然下降至3.2。种子液菌体光密度OD620长至0.8(稀释30倍)时接种到含有6L发酵培 养基的发酵罐中，接种量15％(v/v)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳 烷烃，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.6vvm，罐压约为0.11MPa，保持一定的搅拌速度， 控制溶氧25～30％，补加液碱控制发酵液的pH值。发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH 约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于
3.0，待菌体光密度(OD620) 大于0.5(稀释30倍)时，控制pH 5.3，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加 入十二碳烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％，发酵液内的发酵底物检测为0时，停止发 酵。

[0083] 对比例1热带假丝酵母CCTCC NO：M 203052在10L发酵罐中发酵生产长链二元酸[0084] 将热带假丝酵母CCTCC NO：M 203052替换维斯假丝酵母CAES2113，采用实施例17 发酵生产十二碳二元酸的方法进行发酵。

[0085] 对比例2热带假丝酵母CCTCC NO：M 203052在10L发酵罐中发酵生产长链二元酸[0086] 热带假丝酵母CCTCC NO：M 203052采用现有的传统工艺发酵：种子罐培养成熟的种子 接种到含发酵培养基的发酵罐中，十二碳烷烃和补料糖分消。于29℃通气量0.5vvm、罐压 0.1Mpa条件下培养。发酵前20小时pH自然，以菌体生长为主，当菌体生长光密度(OD620) 大于0.6，开始批式补加十二碳烷烃，此后每8小时补加一次，控制发酵液中烷烃浓度维持在 5％(V:V)左右，同时调节pH至6.5。每4小时用NaOH溶液调节pH至7.0；48～72小时， 每4小时用NaOH溶液调节pH至7.5；72～120小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.8； 120小时至放罐，每4小时用NaOH溶液调节pH至8.0。发酵至24、48、72小时批式补加1％ (W:
V)的葡萄糖。

[0087] 上述实施例17，对比例1和对比例2的发酵结果见表3。

[0088] 表3不同菌株在不同工艺下的发酵结果

[0089]

[0090]

[0091] 由表3可知，本发明的维斯假丝酵母CAES2113在pH值＜7下发酵能够获得明显优于pH 值＞7发酵工艺及相关菌株获得的产酸量和转化率，而且具有能够长时间催化活力，显著降低 了加碱量。

[0092] 实施例18～实施例20维斯假丝酵母CAES2113在10L发酵罐中发酵生产十二碳二元酸

[0093] 实施例18～20的制备方法与实施例17相同，区别在于：发酵过程中控制溶氧15～20％(实施 例18)，溶氧10～15％(实施例19)，溶氧不低于5～10％(实施例20)，发酵结果见表4。

[0094] 表4维斯假丝酵母CAES2113在发酵过程中不同溶氧下的发酵结果

[0095]组别 溶氧(％) 产酸(mg/g) 周期(h) 转化率(％) 加碱量(mL)
实施例18 15～20 185 154 95 125
实施例19 10～15 181 159 94 120
实施例20 5～10 180 160 93 119

[0096] 由表4可知，本发明的维斯假丝酵母CAES2113在控制较低溶氧的条件下仍然具有较高的 氧气利用率，获得了较高的产酸量。

[0097] 实施例21长链二元酸产品的制备

[0098] 将实施例17制得的发酵液用硫酸调节pH值至3，进行酸化，离心分离得固形物，再将固 形物溶解在醋酸中，加入溶液中二元酸含量的5％的活性炭，在90℃条件下脱色60min，过滤 分离得清液，将清液降温至80℃保温1.5h，再降温至30℃，结晶，离心分离得十二碳二元酸 产品，纯度为99.32％。

[0099] 实施例22长链二元酸产品的制备

[0100] 将实施例17制得的发酵液用硫酸调节pH值至3.5，进行酸化，离心分离得固形物，再将 固形物溶解在乙醇中，加入溶液中二元酸含量的5％的活性炭，在95℃条件下脱色75min，过 滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1h，再降温至35℃，结晶，离心分离得十二碳二元酸 产品，纯度为99.40％。

[0101] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本 发明的保护范围。

[0102] 序列表

[0103] SEQ ID NO:1

[0104] 维斯假丝酵母(Candida viswanathii)的ITS序列

[0105] >ITS

[0106] ATTGCACCACATGTGTTTTTTACTGGACAGCTGCTTTGGCGGTGGGGACTCGTTTCCGCCGCCAGAGGTCACAAC TAAACCAAACTTTTTATTACCAGTCAACCATACGTTTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCA T

[0107] CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT TG

[0108] CGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAGCCCGCGGGTTTGGTGTTGAGCAAT AC

[0109] GCCAGGTTTGTTTGAAAGACGTACGTGGAGACTATATTAGCGACTTAGGTTCTACCAAAACGCTTGTGCAGTCGGCC CAC

[0110] CACAGCTTTTCTAACTTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAA GA

[0111] AACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCC GAG

[0112] TTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGCCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAAT CC

[0113] CGTGCGATGAGATGACCCAGGTCCGTGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGG TGG

[0114] TAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTT TGA

[0115] AAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGCATTTTGCATGTTGCTTC TTC

[0116] GGGGGCGGCCTCTGCGGTTTGTCGGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGCAGGACAATCGCGTGGGAATGTGGCACGGCC TCGG

[0117] CTGTGTGTTATAGCCCGCGTGGATACTGCCAGCCTAGACTGAGGACTGCGGTTTATACCTAGGATGTTGGCATAATGAT C

[0118] TTAAGTCGCCCGTCTTGAAACACGG

[0119]

[0120]