一种双链RNA分子及其用途转让专利
申请号 : CN202010083971.2
文献号 : CN111763669B
文献日 : 2021-06-15
发明人 : 姜志宏 , 曹凯悦 , 潘聿 , 严通萌
申请人 : 澳门科技大学
摘要 :
本发明涉及一种双链RNA分子及其用途，及其用于治疗癌症的方法和药物组合物。具体地，本发明提供了一种双链RNA分子或其功能变体或同源物，及其在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物或用于抑制癌细胞生长、增殖或转移的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的双链RNA分子的步骤，其中该双链RNA分子源自埃希氏菌属细菌。本发明还提供了一种抑制癌细胞生长、增殖或转移的方法，包括使所述细胞与所述双链RNA分子接触的步骤；和用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含所述双链RNA分子和药学上可接受的赋形剂。本发明还涉及包含该双链RNA分子的重组载体。
权利要求 :
1.一种双链RNA分子，其核苷酸序列的反义链如SEQ ID NO: 201‑224、226‑233、235‑
247、249‑254、256‑258、261‑268、270‑271、273‑274和277‑292之一所示，其核苷酸序列的正义链如SEQ ID NO: 295‑318、320‑327、329‑341、343‑348、350‑352、355‑362、364‑365、367‑
368和371‑386之一所示，其中所述反义链和正义链按照各自的核苷酸序列编号一一顺序配对。
2.根据权利要求1所述的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:241、242、283、284、285和286所示，并且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:335、336、377、378、379和380所示，其中所述反义链和正义链按照各自的核苷酸序列编号一一顺序配对。
3. 根据权利要求2所述的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 283所示，并且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 377所示。
4.根据权利要求1所述的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子还包含3’悬突。
5. 根据权利要求1所述的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子的反义链和/或正义链的核苷酸序列包含一个或多个经过化学修饰的核苷酸；其中，所述化学修饰选自1‑甲基、2‑甲基、5‑甲基、7‑甲基、N2‑甲基、N6‑甲基、N2,N2‑二甲基、2'‑O‑甲基、N6‑异戊烯基、2‑甲硫基‑N6‑异戊烯基、N6‑苏糖氨甲酰基、N6‑甲基‑N6‑苏糖氨甲酰基、2‑硫基、4‑硫基、N4‑乙酰基、5‑甲酰基、3‑(3‑氨基‑3‑羧丙基)、5‑甲氧基、5‑氧乙酸、5‑氧乙酸甲酯、5‑甲氧基羰基甲基、5‑甲氧基羰基甲基‑2'‑O‑甲基、5‑甲氧基羰基甲基‑2‑硫基、5‑氨基甲基‑2‑硫基、5‑甲基氨基甲基、5‑甲基氨基甲基‑2‑硫基、5‑氨基甲酰基甲基、5‑氨基甲酰基甲基‑2'‑O‑甲基、
5‑羧基甲基氨基甲基、5‑羧基甲基氨基甲基‑ 2'‑O‑甲基、5‑羧基甲基氨基甲基‑2‑甲基、5‑牛磺酸甲基、5,2'‑O‑二甲基和5‑牛磺酸甲基‑2‑硫基中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子的反义链和/或正义链的核苷酸序列包含1或2个经过化学修饰的核苷酸。
7.根据权利要求5所述的双链RNA分子，其中所述化学修饰选自1‑甲基、7‑甲基、N6‑甲基、2'‑O‑甲基、5,2'‑O‑二甲基、4‑硫基和5‑氧乙酸中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的双链RNA分子，其中所述化学修饰的核苷酸选自尿苷和/或鸟苷。
9.根据权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述化学修饰的核苷酸选自4‑硫基尿苷和/或2'‑O‑甲基鸟苷。
10. 根据权利要求9所述的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 389、390或391所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 392、393或394所示，其中所述反义链和正义链按照各自的核苷酸序列编号一一顺序配对。
11.一种预防和/或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1至10任一项所述的双链RNA分子，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂；其中所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗结直肠癌。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含核酸稳定剂。
13.一种预防和/或治疗癌症的递送载体，其包含权利要求1至10任一项所述的双链RNA分子，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂；其中所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗结直肠癌。
14.权利要求1至10任一项所述的双链RNA分子在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途，其中所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗结直肠癌。
15.权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述预防和/或治疗癌症为抑制结直肠癌细胞生长、增殖或转移。
16.权利要求13所述的递送载体，其中所述预防和/或治疗癌症为抑制结直肠癌细胞生长、增殖或转移。
17.权利要求14所述的用途，其中所述预防和/或治疗癌症为抑制结直肠癌细胞生长、增殖或转移。
18.权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗氟尿嘧啶抗性癌症。
19.权利要求13所述的递送载体，其中所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗氟尿嘧啶抗性癌症。
20.权利要求14所述的用途，其中所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗氟尿嘧啶抗性癌症。
说明书 :
一种双链RNA分子及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种来自肠道细菌的双链RNA分子及其用途，以及通过向患有癌症的受试者施用该双链RNA分子治疗受试者的方法。本发明还涉及包含
该双链RNA分子的药物组合物及其用途。
该双链RNA分子的药物组合物及其用途。
[0002] 发明背景
[0003] 癌症已经成为全球范围内导致死亡的最常见疾病。小分子，如生物碱、萜类化合物、黄酮类化合物等在治疗癌症中的有效性均已被证明。还发现一些生物碱具有促进抑制
癌症的作用，例如通过增强抗癌药物的功效。然而，它们中的大多数通常对人体有毒。此外，
诸如DNA、RNA和蛋白质的大分子通常被认为是不稳定的，并且在人活体中的活性效果差，因
此在癌症治疗中没有被广泛认为是合适的。
癌症的作用，例如通过增强抗癌药物的功效。然而，它们中的大多数通常对人体有毒。此外，
诸如DNA、RNA和蛋白质的大分子通常被认为是不稳定的，并且在人活体中的活性效果差，因
此在癌症治疗中没有被广泛认为是合适的。
[0004] 目前，一些研究表明，小非编码RNA(small ncRNA)，如微小RNA通过在几乎所有真核生物中靶向RNA转录或转录后过程的不同方面，从而具有不同的调节作用。Mlotshwa,S.
等人(Cell research 2015,25(4),521‑4)提出，食物中的外源植物微小RNA可被哺乳动物
的消化道吸收并通过血流输送到各种组织细胞，在那里它们能够调节哺乳动物基因的表
达。Goodarzi,H.等人(Cell 2015,161(4),790‑802)揭示源自内源性tRNA的片段可通过结
合和拮抗与发病机制相关的RNA结合蛋白的活性来抑制乳腺癌细胞中多种致癌转录物的稳
定性。
等人(Cell research 2015,25(4),521‑4)提出，食物中的外源植物微小RNA可被哺乳动物
的消化道吸收并通过血流输送到各种组织细胞，在那里它们能够调节哺乳动物基因的表
达。Goodarzi,H.等人(Cell 2015,161(4),790‑802)揭示源自内源性tRNA的片段可通过结
合和拮抗与发病机制相关的RNA结合蛋白的活性来抑制乳腺癌细胞中多种致癌转录物的稳
定性。
[0005] 大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌属(Escherichia)的物种，是人和动物肠道中一种著名的
细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌的0.1％。无害的大肠杆菌菌株是人体肠道中正常菌
丛的一部分，会制造维生素K、防止肠道中其他致病菌的生长，对人体有益。
细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌的0.1％。无害的大肠杆菌菌株是人体肠道中正常菌
丛的一部分，会制造维生素K、防止肠道中其他致病菌的生长，对人体有益。
[0006] 然而，目前仍然需要从各种来源，如对于人体有益的肠道菌群获得有效分子用于癌症的治疗。
[0007] 发明概述
[0008] 鉴于现有技术存在上述不足之处，本发明人经大量实验和研究成功地将分离自埃希氏菌属细菌的转运RNA分子的衍生物，特别是包含具有选自SEQ ID NO:389至391所示的
核苷酸序列的反义链和具有选自SEQ ID NO:392至394所示的核苷酸序列的正义链的双链
RNA分子应用于癌症的预防和/或治疗，从而提供了一种预防和/或治疗各种癌症的新颖且
有效的方法。
核苷酸序列的反义链和具有选自SEQ ID NO:392至394所示的核苷酸序列的正义链的双链
RNA分子应用于癌症的预防和/或治疗，从而提供了一种预防和/或治疗各种癌症的新颖且
有效的方法。
[0009] 第一方面，本发明提供了一种双链RNA分子或其功能变体或同源物，其包含具有SEQ ID NO:201至294之一所示的核苷酸序列的反义链和具有SEQ ID NO:295至388之一所
示的核苷酸序列的正义链。
示的核苷酸序列的正义链。
[0010] 优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物包含具有SEQ ID NO:241、242、283、284、285和286之一所示的核苷酸序列的反义链和具有SEQ ID NO:335、336、377、378、
379和380之一所示的核苷酸序列的正义链。
379和380之一所示的核苷酸序列的正义链。
[0011] 更优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:241、242、283、284、285或286所示，并且所述双链RNA分子或其功能变体或同源物的
正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:335、336、377、378、379或380所示。
正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:335、336、377、378、379或380所示。
[0012] 最优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:283所示，并且所述双链RNA分子或其功能变体或同源物的正义链的核苷酸序列如
SEQ ID NO:377所示。
SEQ ID NO:377所示。
[0013] 优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物还包含3’悬突。
[0014] 优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物的反义链和/或正义链的核苷酸序列包含一个或多个，优选1或2个经过化学修饰的核苷酸。其中，所述化学修饰可以选自1‑
甲基、2‑甲基、5‑甲基、7‑甲基、N2‑甲基、N6‑甲基、N2,N2‑二甲基、2'‑O‑甲基、N6‑异戊烯基、
2‑甲硫基‑N6‑异戊烯基、N6‑苏糖氨甲酰基、N6‑甲基‑N6‑苏糖氨甲酰基、2‑硫基、4‑硫基、
N4‑乙酰基、5‑甲酰基、3‑(3‑氨基‑3‑羧丙基)、5‑甲氧基、5‑氧乙酸、5‑氧乙酸甲酯、5‑甲氧
基羰基甲基、5‑甲氧基羰基甲基‑2'‑O‑甲基、5‑甲氧基羰基甲基‑2‑硫基、5‑氨基甲基‑2‑硫
基、5‑甲基氨基甲基、5‑甲基氨基甲基‑2‑硫基、5‑氨基甲酰基甲基、5‑氨基甲酰基甲基‑2'‑
O‑甲基、5‑羧基甲基氨基甲基、5‑羧基甲基氨基甲基‑2'‑O‑甲基、5‑羧基甲基氨基甲基‑2‑
甲基、5‑牛磺酸甲基和5‑牛磺酸甲基‑2‑硫基中的一种或多种；优选地，所述化学修饰选自
1‑甲基、7‑甲基、N6‑甲基、2'‑O‑甲基、5,2'‑O‑二甲基、4‑硫基和5‑氧乙酸中的一种或多种。
优选地，所述化学修饰的核苷酸选自尿苷和/或鸟苷；更优选地，所述化学修饰的核苷酸选
自4‑硫基尿苷和/或2'‑O‑甲基鸟苷；进一步优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源
物包含具有SEQ ID NO:389、390或391所示的核苷酸序列的反义链和具有SEQ ID NO:392、
393或394所示的核苷酸序列的正义链。最优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物
的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:389、390或391所示，并且所述双链RNA分子或其功能
变体或同源物的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:392、393或394所示。
甲基、2‑甲基、5‑甲基、7‑甲基、N2‑甲基、N6‑甲基、N2,N2‑二甲基、2'‑O‑甲基、N6‑异戊烯基、
2‑甲硫基‑N6‑异戊烯基、N6‑苏糖氨甲酰基、N6‑甲基‑N6‑苏糖氨甲酰基、2‑硫基、4‑硫基、
N4‑乙酰基、5‑甲酰基、3‑(3‑氨基‑3‑羧丙基)、5‑甲氧基、5‑氧乙酸、5‑氧乙酸甲酯、5‑甲氧
基羰基甲基、5‑甲氧基羰基甲基‑2'‑O‑甲基、5‑甲氧基羰基甲基‑2‑硫基、5‑氨基甲基‑2‑硫
基、5‑甲基氨基甲基、5‑甲基氨基甲基‑2‑硫基、5‑氨基甲酰基甲基、5‑氨基甲酰基甲基‑2'‑
O‑甲基、5‑羧基甲基氨基甲基、5‑羧基甲基氨基甲基‑2'‑O‑甲基、5‑羧基甲基氨基甲基‑2‑
甲基、5‑牛磺酸甲基和5‑牛磺酸甲基‑2‑硫基中的一种或多种；优选地，所述化学修饰选自
1‑甲基、7‑甲基、N6‑甲基、2'‑O‑甲基、5,2'‑O‑二甲基、4‑硫基和5‑氧乙酸中的一种或多种。
优选地，所述化学修饰的核苷酸选自尿苷和/或鸟苷；更优选地，所述化学修饰的核苷酸选
自4‑硫基尿苷和/或2'‑O‑甲基鸟苷；进一步优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源
物包含具有SEQ ID NO:389、390或391所示的核苷酸序列的反义链和具有SEQ ID NO:392、
393或394所示的核苷酸序列的正义链。最优选地，所述双链RNA分子或其功能变体或同源物
的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:389、390或391所示，并且所述双链RNA分子或其功能
变体或同源物的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:392、393或394所示。
[0015] 再一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的药物组合物，其包含上述双链RNA分子或其功能变体或同源物，以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
优选地，药物组合物还包含所述核酸稳定剂。
优选地，药物组合物还包含所述核酸稳定剂。
[0016] 再一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的递送载体，其包含上述双链RNA分子或其功能变体或同源物，以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0017] 另一方面，本发明还提供了上述双链RNA分子或其功能变体或同源物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
[0018] 与之相对应地，本发明亦提供了一种预防和/治疗癌症的方法，其包括向有预防和/治疗癌症的需求的对象给予有效量的上述双链RNA分子或其功能变体或同源物。
[0019] 在上述药物组合物、递送载体、用途或方法中，所述预防和/或治疗癌症可以为抑制癌细胞生长、增殖或转移。
[0020] 根据本发明的一个示例性实施方案，在上述药物组合物、递送载体、用途或方法中，所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗结直肠癌；优选地，所述预防和/或治疗癌症
为抑制结直肠癌细胞。优选地，所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗氟尿嘧啶抗性癌
症。
为抑制结直肠癌细胞。优选地，所述预防和/或治疗癌症为预防和/或治疗氟尿嘧啶抗性癌
症。
[0021] 具体地，本发明人发现源自埃希氏菌属(Escherichia)细菌的非编码RNA分子，特别是转运RNA分子，和源自埃希氏菌属细菌的双链RNA分子衍生物在预防和/或治疗癌症方
面特别有用。核苷酸序列长度为约10至200个核苷酸的RNA分子以及其长度为10至30个碱基
对的双链RNA分子衍生物在体外抑制癌细胞的生长和增殖方面非常有效。所述转运RNA分子
的双链衍生物分子对氟尿嘧啶抗性细胞系也有效。包含源自埃希氏菌属细菌的双链RNA分
子和药学上可接受的赋形剂的药物组合物可以直接作用于癌细胞或肿瘤，因此可以具有更
快作用的治疗效果。
面特别有用。核苷酸序列长度为约10至200个核苷酸的RNA分子以及其长度为10至30个碱基
对的双链RNA分子衍生物在体外抑制癌细胞的生长和增殖方面非常有效。所述转运RNA分子
的双链衍生物分子对氟尿嘧啶抗性细胞系也有效。包含源自埃希氏菌属细菌的双链RNA分
子和药学上可接受的赋形剂的药物组合物可以直接作用于癌细胞或肿瘤，因此可以具有更
快作用的治疗效果。
[0022] 本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的发明易于进行变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指
出的所有步骤和特征，以及步骤或特征的任何和所有组合。
出的所有步骤和特征，以及步骤或特征的任何和所有组合。
[0023] 通过考虑以下详细描述和附图，本发明的其他特征和方面将变得显而易见。
[0024] 附图简述
[0025] 图1A显示根据一个示例性实施方案由高效液相阴离子交换色谱方法分离的大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)混合tRNA在紫外260纳米下的图
谱。
谱。
[0026] 图1B显示根据一个示例性实施方案由高效液相阴离子交换色谱方法分离的6个混合的tRNA组分的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0027] 图2A显示根据一个示例性实施方案由高效液相离子对色谱方法分离的组分2在紫外260纳米下的图谱、超高效液相色谱‑质谱分析tRNA‑1的总离子流图，tRNA‑1的多电荷分
布图，以及tRNA‑1的解卷积图谱。
布图，以及tRNA‑1的解卷积图谱。
[0028] 图2B显示根据一个示例性实施方案由高效液相离子对色谱方法分离的组分3在紫外260纳米下的图谱、超高效液相色谱‑质谱分析tRNA‑2的总离子流图、tRNA‑2的多电荷分
布图，以及tRNA‑2的解卷积图谱。
布图，以及tRNA‑2的解卷积图谱。
[0029] 图2C显示根据一个示例性实施方案，利用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析tRNA‑1和tRNA‑2的图谱，包括微小RNA标准对照品(表示为“microRNA marker”)、总tRNA
组分和小RNA标准对照品(表示为“Low range ssRNA ladder”)。
组分和小RNA标准对照品(表示为“Low range ssRNA ladder”)。
[0030] 图3显示根据一个示例性实施方案，应用于纯化的tRNA表征的方法的寡核苷酸质谱裂解规律。
[0031] 图4A显示根据一个示例性实施方案，tRNA‑1经RNA内切酶T1产生的特征性片段在总离子流图中的指认。
[0032] 图4B显示根据一个示例性实施方案，tRNA‑2经RNA内切酶T1产生的特征性片段在总离子流图中的指认。
[0033] 图5A显示根据一个示例性实施方案，tRNA‑2经RNA内切酶S1产生的片段、5’‑tRNA‑half分子和3’‑tRNA‑half分子在超高效液相色谱中在紫外260nM下的图谱。
[0034] 图5B是显示根据一个示例性实施方案，tRNA‑2经RNA内切酶S1产生的片段的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，包括小RNA标准对照品(表示为“Low range ssRNA
ladder”)、总tRNA组分和tRNA‑2。
ladder”)、总tRNA组分和tRNA‑2。
[0035] 图6A是显示根据一个示例性实施方案，与对照组和脂质体组相比，使用来自大肠杆菌Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的RNA分子tRNA‑Val(UAC)和tRNA‑
Leu(CAG)的5’‑tRNA half片段，3’‑tRNA half片段，5’‑tRF mimic和3’‑tRF mimic，在50nM
作用下处理后，HCT‑8细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；***，p<0.001，****，p<
0.0001，相对于载体对照)。
Leu(CAG)的5’‑tRNA half片段，3’‑tRNA half片段，5’‑tRF mimic和3’‑tRF mimic，在50nM
作用下处理后，HCT‑8细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；***，p<0.001，****，p<
0.0001，相对于载体对照)。
[0036] 图6B是显示根据一个示例性实施方案，与对照组相比，在使用源自大肠杆菌Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的序列长度为22bp的表3中的EC1‑
EC24,EC26‑EC33,EC35‑EC47,EC49‑EC54,EC56‑EC58,EC61‑EC68,EC70‑EC71,EC73‑EC74,
EC77‑EC92共82条序列的RNA分子以50nM的剂量处理后，HCT‑8细胞死亡率的热图(平均值±
SD n＝3)。
EC24,EC26‑EC33,EC35‑EC47,EC49‑EC54,EC56‑EC58,EC61‑EC68,EC70‑EC71,EC73‑EC74,
EC77‑EC92共82条序列的RNA分子以50nM的剂量处理后，HCT‑8细胞死亡率的热图(平均值±
SD n＝3)。
[0037] 图6C是显示根据一个示例性实施方案，与对照组相比，在使用不同浓度，即3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM的源自大肠杆菌Escherichia coli(Migula)
Castellani&Chalmers)的RNA分子EC83mimic处理后，HCT‑8细胞的细胞活力线型图(平均值
±SD n＝3)。
Castellani&Chalmers)的RNA分子EC83mimic处理后，HCT‑8细胞的细胞活力线型图(平均值
±SD n＝3)。
[0038] 图7是显示根据一个示例性实施方案，与对照组和脂质体组相比，在使用不同浓度，即3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM的源自大肠杆菌Escherichia coli
(Migula)Castellani&Chalmers)的RNA分子EC83 mimic、EC83‑M1 mimic、EC83‑M2 mimic和
EC83‑M3 mimic处理后，HCT‑8细胞、氟尿嘧啶抗性HCT‑8细胞(表示为HCT‑8/5‑FU细胞)、
LoVo细胞、氟尿嘧啶抗性LoVo‑8细胞(表示为LoVo/5‑FU细胞)的细胞活力的条形图(平均值
±SD n＝3；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，****；p<0.0001，相对于载体对照)。
(Migula)Castellani&Chalmers)的RNA分子EC83 mimic、EC83‑M1 mimic、EC83‑M2 mimic和
EC83‑M3 mimic处理后，HCT‑8细胞、氟尿嘧啶抗性HCT‑8细胞(表示为HCT‑8/5‑FU细胞)、
LoVo细胞、氟尿嘧啶抗性LoVo‑8细胞(表示为LoVo/5‑FU细胞)的细胞活力的条形图(平均值
±SD n＝3；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，****；p<0.0001，相对于载体对照)。
[0039] 图8A是显示根据一个示例性实施方案，与对照组相比，来自大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的50nM RNA分子EC83 mimic、EC83‑M1
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对HCT‑8细胞系的增殖抑制作用(平均值±SD n＝
3；****，p<0.0001，相对于载体对照)。
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对HCT‑8细胞系的增殖抑制作用(平均值±SD n＝
3；****，p<0.0001，相对于载体对照)。
[0040] 图8B是显示根据一个示例性实施方案，与对照组相比，来自大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的25nM RNA分子EC83 mimic、EC83‑M1
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对LoVo细胞系的增殖抑制作用(平均值±SD n＝
3；****，p<0.0001，相对于载体对照)。
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对LoVo细胞系的增殖抑制作用(平均值±SD n＝
3；****，p<0.0001，相对于载体对照)。
[0041] 图9A是显示根据一个示例性实施方案，与对照组相比，来自大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的50nM RNA分子EC83 mimic、EC83‑M1
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对HCT‑8细胞系的迁移抑制作用(平均值±SD n＝
3；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001，相对于载体对照)。
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对HCT‑8细胞系的迁移抑制作用(平均值±SD n＝
3；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001，相对于载体对照)。
[0042] 图9B是显示根据一个示例性实施方案，与对照组相比，来自大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的25nM RNA分子EC83 mimic、EC83‑M1
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对LoVo细胞系的迁移抑制作用(平均值±SD n＝
3；*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，相对于载体对照)。
mimic、EC83‑M2 mimic和EC83‑M3 mimic对LoVo细胞系的迁移抑制作用(平均值±SD n＝
3；*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，相对于载体对照)。
具体实施方式
[0043] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0044] 如本文所使用，“包含”意指包括以下要素但不排除其他要素。“基本上由……组成”是指由相应的要素以及通常和不可避免的杂质组成，例如通常由用于获得材料的相应
的制备或方法产生的副产物和组分，例如痕量的另外的组分或溶剂。“由……组成”是指仅
由相应的要素组成，即由相应的要素形成。
的制备或方法产生的副产物和组分，例如痕量的另外的组分或溶剂。“由……组成”是指仅
由相应的要素组成，即由相应的要素形成。
[0045] 本发明的第一方面提供了治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的RNA分子的步骤。根据本发明施用的RNA分子可以根据本发明公开的序列天
然存在、修饰或人工合成，并且优选地，RNA分子分离自或源自埃希氏菌属细菌。本发明的
RNA分子不是以从细菌中获得的煮沸提取物，例如煎煮液的形式提供的，因为可以理解，RNA
分子在高温、碱性pH和核酸酶或二价金属离子的存在下易于自发降解。在一个实施方案中，
本发明的RNA分子与基因递送载体一起提供，其将在后面详细描述。
然存在、修饰或人工合成，并且优选地，RNA分子分离自或源自埃希氏菌属细菌。本发明的
RNA分子不是以从细菌中获得的煮沸提取物，例如煎煮液的形式提供的，因为可以理解，RNA
分子在高温、碱性pH和核酸酶或二价金属离子的存在下易于自发降解。在一个实施方案中，
本发明的RNA分子与基因递送载体一起提供，其将在后面详细描述。
[0046] 本发明的RNA分子的序列长度为约10至200个核苷酸，其可被视为小RNA分子。优选地，RNA分子的序列长度为约50至约200个核苷酸，约60至约150个核苷酸，特别是约70至约
100个核苷酸。
100个核苷酸。
[0047] 本发明的RNA分子或其功能变体或同源物具有选自SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:147的序列。术语RNA分子的“功能变体”是指与所述RNA分子基本相似的分子，其具有一个或
多个不影响所述RNA分子的生物活性或功能的序列改变。不影响得到的RNA分子的功能特性
的序列改变是本领域熟知的。例如，预期导致分子的‑5’‑末端和‑3’‑末端部分改变的核苷
酸变化不会改变多核苷酸的活性。在一个实施方案中，本发明的RNA分子包含至少一种选自
6 6
以下的修饰核苷：肌苷、1‑甲基腺苷、2‑甲基腺苷、N ‑甲基腺苷、N ‑异戊烯基腺苷、2'‑O‑甲
6 6
基腺苷、N‑乙酰基腺苷、1‑甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2‑甲硫基‑N‑甲基腺苷。
多个不影响所述RNA分子的生物活性或功能的序列改变。不影响得到的RNA分子的功能特性
的序列改变是本领域熟知的。例如，预期导致分子的‑5’‑末端和‑3’‑末端部分改变的核苷
酸变化不会改变多核苷酸的活性。在一个实施方案中，本发明的RNA分子包含至少一种选自
6 6
以下的修饰核苷：肌苷、1‑甲基腺苷、2‑甲基腺苷、N ‑甲基腺苷、N ‑异戊烯基腺苷、2'‑O‑甲
6 6
基腺苷、N‑乙酰基腺苷、1‑甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2‑甲硫基‑N‑甲基腺苷。
[0048] 特别地，RNA分子的功能变体与根据本发明的非变体RNA分子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％的总体序列同一性。
97％、98％或99％的总体序列同一性。
[0049] 本文使用的术语“同源物”是指与根据本发明的RNA分子具有至50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸。在一个实施方案中，RNA分
子的同源物与所述RNA分子具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％的总体序列同一性。
子的同源物与所述RNA分子具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％的总体序列同一性。
[0050] 在一个实施方案中，RNA分子是非编码分子，优选地选自转运RNA分子(tRNA)、核糖体RNA分子、微小RNA分子、siRNA分子或与piwi相互作用的RNA分子；更优选的是转运RNA分
子。tRNA分子是高度保守的RNA，其在各种细胞过程中起作用，例如逆转录、卟啉生物合成
等。在一个具体实施方案中，本发明的双链RNA分子或为其功能变体或同源物包含SEQ ID
NO:201至SEQ ID NO:294的序列的反义链，和/或SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的序列的
正义链；或双链RNA分子或其功能变体或同源物由SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的序列
的反义链和SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的序列的正义链组成。
子。tRNA分子是高度保守的RNA，其在各种细胞过程中起作用，例如逆转录、卟啉生物合成
等。在一个具体实施方案中，本发明的双链RNA分子或为其功能变体或同源物包含SEQ ID
NO:201至SEQ ID NO:294的序列的反义链，和/或SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的序列的
正义链；或双链RNA分子或其功能变体或同源物由SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的序列
的反义链和SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的序列的正义链组成。
[0051] 在供选择的实施方案中，双链RNA分子是小双链RNA分子，其序列长度为约10至约30个碱基对，约15至约25个碱基对，约19至约22个碱基对，19个碱基对或22个碱基对。
[0052] 在供选择的实施方案中，RNA分子或其功能变体或同源物具有选自SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:147的序列，特别是SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:143的序列；或由选自SEQ ID
NO:101至SEQ ID NO:147的序列，特别是SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:143的序列组成。优选
地，双链RNA分子或其功能变体或同源物具有选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294之一的
反义序列，和互补正义序列，反义序列与正义序列互补。反义序列源自选自SEQ ID NO:101
至147的序列的RNA分子或其功能变体或同源物。优选地，所述双链RNA分子的反义链的核苷
酸序列如SEQ ID NO:241、242、283、284、285或286所示，且所述双链RNA分子的正义链的核
苷酸序列如SEQ ID NO:335、336、377、378、379或380所示；优选地，所述双链RNA分子的反义
链的核苷酸序列如SEQ ID NO:283所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ
ID NO:377所示。特别地，在本发明的一个实施方案中，RNA分子是修饰的双链RNA分子或其
功能变体或同源物，其具有选自SEQ ID NO:389至SEQ ID NO:391的反义序列，以及选自SEQ
ID NO:392至SEQ ID NO:394的互补正义序列。本发明人意外地发现，本发明的双链RNA分子
在预防和/或治疗癌症，如下文详细描述的氟尿嘧啶抗性癌症中是特别有用的。
NO:101至SEQ ID NO:147的序列，特别是SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:143的序列组成。优选
地，双链RNA分子或其功能变体或同源物具有选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294之一的
反义序列，和互补正义序列，反义序列与正义序列互补。反义序列源自选自SEQ ID NO:101
至147的序列的RNA分子或其功能变体或同源物。优选地，所述双链RNA分子的反义链的核苷
酸序列如SEQ ID NO:241、242、283、284、285或286所示，且所述双链RNA分子的正义链的核
苷酸序列如SEQ ID NO:335、336、377、378、379或380所示；优选地，所述双链RNA分子的反义
链的核苷酸序列如SEQ ID NO:283所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ
ID NO:377所示。特别地，在本发明的一个实施方案中，RNA分子是修饰的双链RNA分子或其
功能变体或同源物，其具有选自SEQ ID NO:389至SEQ ID NO:391的反义序列，以及选自SEQ
ID NO:392至SEQ ID NO:394的互补正义序列。本发明人意外地发现，本发明的双链RNA分子
在预防和/或治疗癌症，如下文详细描述的氟尿嘧啶抗性癌症中是特别有用的。
[0053] 本发明的RNA分子优选分离自或源自埃希氏属细菌。埃希氏属细菌包括且仅有大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)。在一个实施方案中，RNA分子
分离自或源自大肠杆菌。
分离自或源自大肠杆菌。
[0054] 更详细地，本发明的RNA分子和双链RNA分子的优选序列列于下表1和3中。在一个实施方案中，如表1中所示的SEQ ID NO:101至147的RNA分子分离自大肠杆菌。这些序列通
过大肠杆菌的RNA纯化获得。在实施例1中说明了从特定细菌大肠杆菌(Escherichia coli
(Migula)Castellani&Chalmers)获得RNA分子的一种可能的方法。应当理解，可以应用根据
本文公开的内容获得本发明的分离和纯化的RNA分子的其他合适方法，并且在不脱离本发
明范围的情况下，可以对所述方法进行适当改变以获得改善的RNA分子产率。
过大肠杆菌的RNA纯化获得。在实施例1中说明了从特定细菌大肠杆菌(Escherichia coli
(Migula)Castellani&Chalmers)获得RNA分子的一种可能的方法。应当理解，可以应用根据
本文公开的内容获得本发明的分离和纯化的RNA分子的其他合适方法，并且在不脱离本发
明范围的情况下，可以对所述方法进行适当改变以获得改善的RNA分子产率。
[0055] 表1.根据本发明的源自大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)中的tRNA分子。
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061] SEQ ID NO.:101‑147依次对应于作为本申请的申请文件一部分提交的计算机可读形式的核苷酸或氨基酸序列表中的SEQ ID NO.:207‑253。
[0062] 表2.tRNA序列中修饰符号缩略词表
[0063]
[0064]
[0065] 如表3中所示的SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的反义序列和SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的正义序列是根据本发明人工合成的。特别地，这些序列是根据表1的从大
肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)分离的序列制备的衍生序列片
段。所述衍生序列片段分为以下两类：第一类为5'‑tRFs，即包括成熟tRNA序列的5'末端，在
D环、D环臂、反密码子环或反密码子环臂切断而形成的长度为2‑35个核苷酸的片段；第二类
为3'‑tRFs，即包括成熟tRNA序列的3'‑CCA末端，在T环、T环臂、反密码子环或反密码子环臂
切断而形成的长度为2‑35个核苷酸的片段。例如从tRNA‑Cys(GCA)得到的tRF包括22个核苷
酸长度的5'‑tRFs“GGCGCGUUAACAAAGCGGUUAU”，22个核苷酸长度的3'‑tRFs
“UCGACUCCGGAACGCGCCUCCA”。
肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)分离的序列制备的衍生序列片
段。所述衍生序列片段分为以下两类：第一类为5'‑tRFs，即包括成熟tRNA序列的5'末端，在
D环、D环臂、反密码子环或反密码子环臂切断而形成的长度为2‑35个核苷酸的片段；第二类
为3'‑tRFs，即包括成熟tRNA序列的3'‑CCA末端，在T环、T环臂、反密码子环或反密码子环臂
切断而形成的长度为2‑35个核苷酸的片段。例如从tRNA‑Cys(GCA)得到的tRF包括22个核苷
酸长度的5'‑tRFs“GGCGCGUUAACAAAGCGGUUAU”，22个核苷酸长度的3'‑tRFs
“UCGACUCCGGAACGCGCCUCCA”。
[0066] 每条正义序列与相应的反义序列一起形成双链RNA分子。如表3所示，SEQ ID NO:295的正义序列和SEQ ID NO:201的反义序列形成长度为22个碱基对的双链RNA分子，并且
得到的RNA分子表示为EC以便于参考。表中列出了本发明的其他RNA分子。
得到的RNA分子表示为EC以便于参考。表中列出了本发明的其他RNA分子。
[0067] 双链RNA分子分为2组，即5’‑末端基团(5’‑t)和3’‑末端基团(3’‑t)。5’‑t组RNA分子含有从细菌中分离的相应全长RNA分子的5’末端部分，3’‑t组RNA分子含有从细菌中分离
的相应全长RNA分子的3’末端部分。在另一个实施方案中，RNA分子可以包含从肠道菌分离
的相应全长RNA分子的反密码子环部分，并称为反密码子组RNA分子。SEQ ID NO:201至SEQ
ID NO:294的反义序列可以通过在全长RNA分子SEQ ID NO:101至147上的不同位点处切割
来生成。
的相应全长RNA分子的3’末端部分。在另一个实施方案中，RNA分子可以包含从肠道菌分离
的相应全长RNA分子的反密码子环部分，并称为反密码子组RNA分子。SEQ ID NO:201至SEQ
ID NO:294的反义序列可以通过在全长RNA分子SEQ ID NO:101至147上的不同位点处切割
来生成。
[0068] 此外，本发明的RNA分子可以包含3’悬突，优选包含2个核苷酸的3’悬突。提供3’悬突改善了RNA分子的稳定性。
[0069] 表3.根据本发明通过人工合成由表1中的序列衍生的RNA分子。
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074] SEQ ID NO.:201‑388依次对应于作为本申请的申请文件一部分提交的计算机可读形式的核苷酸或氨基酸序列表中的SEQ ID NO.:19‑206。
[0075] 特别地，本发明人意外地发现了来源于表3中EC83的RNA序列，其带有的天然化学修饰能增强自身对结肠癌细胞的增殖抑制作用。如表4中所述的RNA序列SEQ ID NO:389至
SEQ ID NO:391的反义序列和SEQ ID NO:392至SEQ ID NO:394的正义序列是根据本发明人
工合成的。
SEQ ID NO:391的反义序列和SEQ ID NO:392至SEQ ID NO:394的正义序列是根据本发明人
工合成的。
[0076] 表4.根据本发明通过人工合成由表2中的序列EC83衍生(mimic)的RNA分子。
[0077]
[0078] SEQ ID NO.:389‑394依次对应于作为本申请的申请文件一部分提交的计算机可读形式的核苷酸或氨基酸序列表中的SEQ ID NO.:13‑18。
[0079] 本发明人意外地发现了分离自或源自埃希氏属细菌，特别是大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani&Chalmers)的RNA分子有效对抗癌细胞，特别是它
们能够抑制癌细胞的生长、增殖和/或转移。
们能够抑制癌细胞的生长、增殖和/或转移。
[0080] 转回到治疗方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的如上所述的RNA分子的步骤。在一个实施方案中，向受试者施用RNA分子的步骤包括使受试者的癌细胞与
RNA分子接触。
RNA分子接触。
[0081] 术语“癌症”描述了受试者的生理病症，其中细胞群体的特征在于不受调节的恶性(癌性)细胞生长。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌或肺
癌。在具体实施方案中，癌症是结直肠癌。在供选择的实施方案中，本发明的RNA分子可有效
治疗对目前存在的药物如氟尿嘧啶具有抗性的癌症，即可以用于治疗对氟尿嘧啶具有抗性
的癌症。具体地，本发明的RNA分子可以用于治疗氟尿嘧啶抗性结直肠癌。因此，本发明的方
法可以应用于治疗患有多药耐药性癌症和相关障碍的受试者。
癌。在具体实施方案中，癌症是结直肠癌。在供选择的实施方案中，本发明的RNA分子可有效
治疗对目前存在的药物如氟尿嘧啶具有抗性的癌症，即可以用于治疗对氟尿嘧啶具有抗性
的癌症。具体地，本发明的RNA分子可以用于治疗氟尿嘧啶抗性结直肠癌。因此，本发明的方
法可以应用于治疗患有多药耐药性癌症和相关障碍的受试者。
[0082] 本文使用的术语“受试者”是指活生物体，并且可以包括但不限于人和动物。受试者优选是哺乳动物，优选人。RNA分子可以通过注射向受试者，优选人施用。术语注射包括静
脉内、肌肉内、皮下和皮内施用。在一个实施方案中，通过静脉内注射将本发明的RNA分子与
合适的赋形剂(多种赋形剂)一起施用于受试者。例如，RNA分子可以通过转染、电穿孔或病
毒介导的递送递送至受试者或细胞。
脉内、肌肉内、皮下和皮内施用。在一个实施方案中，通过静脉内注射将本发明的RNA分子与
合适的赋形剂(多种赋形剂)一起施用于受试者。例如，RNA分子可以通过转染、电穿孔或病
毒介导的递送递送至受试者或细胞。
[0083] 表述“有效量”通常表示足以产生治疗上期望的结果的量，其中结果的确切性质根据所治疗的具体病症而变化。在本发明中，癌症是待治疗的病症，因此结果通常是抑制癌细
胞的生长、增殖或转移、减少癌细胞或改善与癌细胞相关的症状，特别是抑制癌细胞的增殖
或诱导细胞死亡，即癌细胞的凋亡。在癌症是转移性癌症的实施方案中，结果通常是抑制癌
细胞迁移，抑制癌细胞侵入其他组织，抑制远离原发部位的继发位点处的转移癌细胞形成，
或者改善与转移性癌症相关的症状。
胞的生长、增殖或转移、减少癌细胞或改善与癌细胞相关的症状，特别是抑制癌细胞的增殖
或诱导细胞死亡，即癌细胞的凋亡。在癌症是转移性癌症的实施方案中，结果通常是抑制癌
细胞迁移，抑制癌细胞侵入其他组织，抑制远离原发部位的继发位点处的转移癌细胞形成，
或者改善与转移性癌症相关的症状。
[0084] 本发明的RNA分子的有效量可以取决于受试者的物种、体重、年龄和个别病症，并且可以例如用细胞培养物或实验动物，通过标准程序测定。
[0085] 本发明的RNA分子可以以包含RNA分子和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形式施用。药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑
剂、着色剂、表面活性剂、基因递送载体和防腐剂中的一种或多种。药物组合物可以以固体、
半固体或液体形式存在，优选以液体形式存在。药物制剂可以为脂质体冻干粉；多肽纳米冻
干粉；喷雾剂；片剂。药物组合物可包含另外的药物有效成分，例如用于治疗癌症的治疗化
合物，例如氟尿嘧啶。技术人员能够根据药物组合物的形式选择合适的药学上可接受的赋
形剂，并且知道制备药物组合物的方法，以及能够根据药学上可接受的赋形剂的种类和药
物组合物的形式选择合适的制备药物组合物的方法。
剂、着色剂、表面活性剂、基因递送载体和防腐剂中的一种或多种。药物组合物可以以固体、
半固体或液体形式存在，优选以液体形式存在。药物制剂可以为脂质体冻干粉；多肽纳米冻
干粉；喷雾剂；片剂。药物组合物可包含另外的药物有效成分，例如用于治疗癌症的治疗化
合物，例如氟尿嘧啶。技术人员能够根据药物组合物的形式选择合适的药学上可接受的赋
形剂，并且知道制备药物组合物的方法，以及能够根据药学上可接受的赋形剂的种类和药
物组合物的形式选择合适的制备药物组合物的方法。
[0086] 在一个实施方案中，RNA分子在包含基因递送载体的药物组合物中提供。基因递送载体是指可以充当将基因递送到细胞中的载体的任何分子。在RNA分子被转染到细胞中的
实施方案中，基因递送载体被认为是转染剂。在其中通过重组病毒载体递送RNA分子的实施
方案中，基因递送载体是携带本发明的双链RNA分子的病毒载体。基因递送载体包括但不限
于载体如病毒载体，胶原如去端肽胶原，聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)，多肽如聚(L‑赖氨酸)
和鱼精蛋白，和用于形成脂质体的脂质，例如Lipofectamine。基因递送载体可以是商购的，
例如来自美国Thermo Fisher的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂、Lipofectamine3000试
剂和 2000转染试剂；来自中国GenePharma的RNAi‑Mate；来自日本Koken
Co.,Ltd.的去端肽胶原；和来自中国siRNAomics的组氨酸‑赖氨酸肽共聚物。基因递送载体
可以是基于逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒和慢病毒的病毒载体。基因递送载体应具有低
毒性并且不能在受试者中诱导显著的免疫应答。在一个实施方案中，RNA分子以包含
Lipofectamine的药物组合物提供，例如 RNAiMAX转染试剂，用于将RNA分
子递送至细胞。在另外的实施方案中，将RNA分子插入质粒中并形成重组载体。
实施方案中，基因递送载体被认为是转染剂。在其中通过重组病毒载体递送RNA分子的实施
方案中，基因递送载体是携带本发明的双链RNA分子的病毒载体。基因递送载体包括但不限
于载体如病毒载体，胶原如去端肽胶原，聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)，多肽如聚(L‑赖氨酸)
和鱼精蛋白，和用于形成脂质体的脂质，例如Lipofectamine。基因递送载体可以是商购的，
例如来自美国Thermo Fisher的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂、Lipofectamine3000试
剂和 2000转染试剂；来自中国GenePharma的RNAi‑Mate；来自日本Koken
Co.,Ltd.的去端肽胶原；和来自中国siRNAomics的组氨酸‑赖氨酸肽共聚物。基因递送载体
可以是基于逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒和慢病毒的病毒载体。基因递送载体应具有低
毒性并且不能在受试者中诱导显著的免疫应答。在一个实施方案中，RNA分子以包含
Lipofectamine的药物组合物提供，例如 RNAiMAX转染试剂，用于将RNA分
子递送至细胞。在另外的实施方案中，将RNA分子插入质粒中并形成重组载体。
[0087] 在一个实施方案中，药物组合物还可以包含核酸稳定剂。核酸稳定剂是指能够维持组合物中RNA分子的稳定性以最小化或避免降解的任何化学品，特别是那些能够使核酸
酶等降解RNA分子的活性失活的化学品。
酶等降解RNA分子的活性失活的化学品。
[0088] 因此，本发明还涉及如上所述的药物组合物，特别是包含RNA分子和如上定义的药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，RNA分子或其功能变体或同源物包
含至少一条选自SEQ ID NO:101至147的序列。优选地，RNA分子分离自或源自如上所述的埃
希氏属细菌，特别是分离自或源自大肠杆菌。
含至少一条选自SEQ ID NO:101至147的序列。优选地，RNA分子分离自或源自如上所述的埃
希氏属细菌，特别是分离自或源自大肠杆菌。
[0089] 根据本发明的方法的RNA分子的施用步骤可以通过将包含RNA分子的药物组合物注射到受试者的靶位点，即癌细胞存在处或癌细胞附近的身体组织来进行。这是有利的，因
为RNA分子可以在任何细胞降解，例如首过代谢之前直接递送至癌细胞。
为RNA分子可以在任何细胞降解，例如首过代谢之前直接递送至癌细胞。
[0090] 本发明的RNA分子也适用于抑制癌细胞的生长、增殖或转移。在本发明的另一个方面，提供了抑制癌细胞生长、增殖或转移的方法，包括使所述细胞与有效量的如上定义的
RNA分子接触的步骤。优选地，RNA分子分离自或源自埃希氏属细菌，或者包含选自SEQ ID
NO:101至SEQ ID NO:147的序列或其功能变体或同源物。癌细胞如上所定义。优选地，癌细
胞是结直肠癌细胞。癌细胞可以对目前存在的癌症药物具有抗性，例如但不限于氟尿嘧啶。
RNA分子接触的步骤。优选地，RNA分子分离自或源自埃希氏属细菌，或者包含选自SEQ ID
NO:101至SEQ ID NO:147的序列或其功能变体或同源物。癌细胞如上所定义。优选地，癌细
胞是结直肠癌细胞。癌细胞可以对目前存在的癌症药物具有抗性，例如但不限于氟尿嘧啶。
[0091] 在一个实施方案中，RNA分子具有约50至200个核苷酸的序列长度，更优选具有约60至约150个核苷酸，特别是约70至约100个核苷酸的长度。RNA分子是非编码分子，优选为
转运RNA分子。优选地，RNA分子或其功能变体或同源物包含选自SEQ ID NO:201至SEQ ID
NO:294的序列；或RNA或其功能变体或同源物分子包含SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388；或
RNA或其功能变体或同源物分子由选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294和/或SEQ ID NO:
295至SEQ ID NO:388的序列组成。
转运RNA分子。优选地，RNA分子或其功能变体或同源物包含选自SEQ ID NO:201至SEQ ID
NO:294的序列；或RNA或其功能变体或同源物分子包含SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388；或
RNA或其功能变体或同源物分子由选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294和/或SEQ ID NO:
295至SEQ ID NO:388的序列组成。
[0092] 在供选择的实施方案中，RNA分子的序列长度为约10至约30个碱基对，约15至约25个碱基对，约19至约22个碱基对，19个碱基对或22个碱基对。优选地，RNA分子是双链RNA分
子，双链RNA分子包含互补反义序列。所述双链RNA分子或其功能变体或同源物以选自SEQ
ID NO:201至SEQ ID NO:294之一的序列为反义序列；优选地，双链RNA分子或其功能变体或
同源物由以下组成：选自SEQ ID NO:201至294所示的反义序列，选自SEQ ID NO:295至388
所示的互补正义序列。优选地，所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:241、
242、283、284、285或286所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:
335、336、377、378、379或380所示；优选地，所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ
ID NO:283所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:377所示。特别
地，在本发明的一个实施方案中，RNA分子或其功能变体或同源物是修饰的双链RNA分子，其
具有选自SEQ ID NO:389至SEQ ID NO:391之一的反义序列，以及选自SEQ ID NO:392至SEQ
ID NO:394的互补正义序列。RNA分子还可以包含2聚体的3’悬突。
子，双链RNA分子包含互补反义序列。所述双链RNA分子或其功能变体或同源物以选自SEQ
ID NO:201至SEQ ID NO:294之一的序列为反义序列；优选地，双链RNA分子或其功能变体或
同源物由以下组成：选自SEQ ID NO:201至294所示的反义序列，选自SEQ ID NO:295至388
所示的互补正义序列。优选地，所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:241、
242、283、284、285或286所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:
335、336、377、378、379或380所示；优选地，所述双链RNA分子的反义链的核苷酸序列如SEQ
ID NO:283所示，且所述双链RNA分子的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:377所示。特别
地，在本发明的一个实施方案中，RNA分子或其功能变体或同源物是修饰的双链RNA分子，其
具有选自SEQ ID NO:389至SEQ ID NO:391之一的反义序列，以及选自SEQ ID NO:392至SEQ
ID NO:394的互补正义序列。RNA分子还可以包含2聚体的3’悬突。
[0093] 使癌细胞与本发明的RNA分子接触的步骤可以通过将组合物，特别是包含RNA分子的孵育溶液施加到所述癌细胞来进行，所述孵育溶液还可以包含如上定义的合适的赋形
剂、缓冲液或合适的生长培养基。在本发明的这种实施方案中，癌细胞取自受试者，例如动
物或人，特别是人。RNA分子在组合物中以至少3nM、至少5nM、约5nM至约200nM、约10nM至约
100nM或约25nM至约50nM的浓度提供。此外，赋形剂可包括基因递送载体，例如但不限于基
于胶原的载体或脂质体形成剂。在一个实施方案中，基于胶原的载体是去端肽胶原，并且脂
质体形成剂是Lipofectamine。
剂、缓冲液或合适的生长培养基。在本发明的这种实施方案中，癌细胞取自受试者，例如动
物或人，特别是人。RNA分子在组合物中以至少3nM、至少5nM、约5nM至约200nM、约10nM至约
100nM或约25nM至约50nM的浓度提供。此外，赋形剂可包括基因递送载体，例如但不限于基
于胶原的载体或脂质体形成剂。在一个实施方案中，基于胶原的载体是去端肽胶原，并且脂
质体形成剂是Lipofectamine。
[0094] 本发明涉及如上所述的双链RNA分子或其功能变体或同源物，即包含选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的反义序列，和互补正义序列。特别地，双链RNA分子或其功能变体
或同源物由以下组成：选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的反义序列，选自SEQ ID NO:
295至SEQ ID NO:388的互补正义序列，和任选的3’悬突。双链RNA分子的示例性实施方案示
于表3中。双链RNA可以进行修饰，因此可以携带至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1‑甲
6 6 6
基腺苷、2‑甲基腺苷、N‑甲基腺苷、N‑异戊烯基腺苷、2'‑O‑甲基腺苷、N‑乙酰基腺苷、1‑甲
6
基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2‑甲硫基‑N‑甲基腺苷。
或同源物由以下组成：选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的反义序列，选自SEQ ID NO:
295至SEQ ID NO:388的互补正义序列，和任选的3’悬突。双链RNA分子的示例性实施方案示
于表3中。双链RNA可以进行修饰，因此可以携带至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1‑甲
6 6 6
基腺苷、2‑甲基腺苷、N‑甲基腺苷、N‑异戊烯基腺苷、2'‑O‑甲基腺苷、N‑乙酰基腺苷、1‑甲
6
基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2‑甲硫基‑N‑甲基腺苷。
[0095] 除上述之外，本发明涉及由表1中tRNA分子切割后形成的tRNA半分子(tRNA‑half)，即包含选自SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:147的tRNA通过特殊的方法，如S1核酸酶或
其他可能将tRNA切割形成半分子的RNA酶或试剂。tRNA半分子可以进行修饰，因此可以携带
6 6
至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1‑甲基腺苷、2‑甲基腺苷、N ‑甲基腺苷、N‑异戊烯基
6 6
腺苷、2'‑O‑甲基腺苷、N‑乙酰基腺苷、1‑甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2‑甲硫基‑N‑甲基
腺苷。
其他可能将tRNA切割形成半分子的RNA酶或试剂。tRNA半分子可以进行修饰，因此可以携带
6 6
至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1‑甲基腺苷、2‑甲基腺苷、N ‑甲基腺苷、N‑异戊烯基
6 6
腺苷、2'‑O‑甲基腺苷、N‑乙酰基腺苷、1‑甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2‑甲硫基‑N‑甲基
腺苷。
[0096] 在本发明的另一方面，提供了包含核酸分子的载体，其中所述核酸分子是如上所述的RNA分子。特别地，RNA分子或其功能变体或同源物具有选自SEQ ID NO:389至SEQ ID
NO:394的序列。在一个实施方案中，载体是包含如上所述的双链RNA分子的重组载体。载体
可以是源自逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的基于病毒的载体。本领域普通技术
人员将理解将本发明的RNA分子掺入载体的合适方法。
NO:394的序列。在一个实施方案中，载体是包含如上所述的双链RNA分子的重组载体。载体
可以是源自逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的基于病毒的载体。本领域普通技术
人员将理解将本发明的RNA分子掺入载体的合适方法。
[0097] 更进一步地，本发明涉及核酸分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。核酸是如上所述的RNA分子，包括其功能变体或同源物。还应理解，本发明的RNA分子可用作小干扰
RNA分子以干扰靶标癌细胞中特定基因的表达，从而引起基因沉默、细胞凋亡、细胞生长和
增殖的抑制等以达到期望的治疗效果。
RNA分子以干扰靶标癌细胞中特定基因的表达，从而引起基因沉默、细胞凋亡、细胞生长和
增殖的抑制等以达到期望的治疗效果。
[0098] 因此，本发明提供了一种通过施用分离自或源自埃希氏菌属细菌的RNA分子，特别是包含选自SEQ ID NO:389至394的序列的RNA分子，来治疗各种来源的癌症的新颖且有效
的方法。施用所述RNA分子也适用于抑制癌细胞的生长、增殖或转移。发现RNA分子在体外抑
制癌细胞的生长和增殖方面非常有效。所述RNA分子也有效对抗氟尿嘧啶抗性细胞系。
的方法。施用所述RNA分子也适用于抑制癌细胞的生长、增殖或转移。发现RNA分子在体外抑
制癌细胞的生长和增殖方面非常有效。所述RNA分子也有效对抗氟尿嘧啶抗性细胞系。
[0099] 现在以以下非限制性实施例描述本发明。
[0100] 具体实施方案
[0101] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0102] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0103] 化学品和材料：
[0104] 大肠杆菌MRE 600混合tRNA购自Roche(瑞士)。MicroRNA marker和low range ssRNA ladder购自New England Biolabs(美国)。焦炭酸二乙酯处理的无RNA酶水、RNA S1
酶与T1酶、40％丙烯酰胺/bis溶液(19:1)、tris/硼酸盐/EDTA(TBE)、过硫酸铵(APS)、四甲
TM
基乙二胺(TEMED)、mirVana miRNA分离试剂盒、SYBR金核酸凝胶染色剂和凝胶上样缓冲液
II购自Thermo Fisher Scientific(美国)。硫氰酸胍、三乙胺、六氟异丙醇和氟尿嘧啶购自
Sigma(美国)。乙醇购自Anaqua Chemicals Supply Inc.Ltd.(美国)。去离子水由
Millipore Milli‑Q Plus系统(美国)制备。人回盲结肠腺癌细胞系(HCT‑8)，氟尿嘧啶抗性
人回盲结肠腺癌细胞系(HCT‑8/5‑FU)，人结直肠癌细胞系(LoVo)，氟尿嘧啶抗性人结直肠
癌细胞系(LoVo/5‑FU)购自ATCC(美国)。Opti‑MEM低血清培养基、RPMI培养基1640、胎牛血
清(FBS)、青霉素‑链霉素购自Gibco(新西兰)。F‑12K培养基购自Thermo(美国)。3‑(4,5‑二
甲基噻唑‑2‑基)‑2,5‑二苯基四氮唑溴化物(MTT)购自Sigma(St.Louis，MO，美国)。
酶与T1酶、40％丙烯酰胺/bis溶液(19:1)、tris/硼酸盐/EDTA(TBE)、过硫酸铵(APS)、四甲
TM
基乙二胺(TEMED)、mirVana miRNA分离试剂盒、SYBR金核酸凝胶染色剂和凝胶上样缓冲液
II购自Thermo Fisher Scientific(美国)。硫氰酸胍、三乙胺、六氟异丙醇和氟尿嘧啶购自
Sigma(美国)。乙醇购自Anaqua Chemicals Supply Inc.Ltd.(美国)。去离子水由
Millipore Milli‑Q Plus系统(美国)制备。人回盲结肠腺癌细胞系(HCT‑8)，氟尿嘧啶抗性
人回盲结肠腺癌细胞系(HCT‑8/5‑FU)，人结直肠癌细胞系(LoVo)，氟尿嘧啶抗性人结直肠
癌细胞系(LoVo/5‑FU)购自ATCC(美国)。Opti‑MEM低血清培养基、RPMI培养基1640、胎牛血
清(FBS)、青霉素‑链霉素购自Gibco(新西兰)。F‑12K培养基购自Thermo(美国)。3‑(4,5‑二
甲基噻唑‑2‑基)‑2,5‑二苯基四氮唑溴化物(MTT)购自Sigma(St.Louis，MO，美国)。
[0105] 实施例1从大肠杆菌混合tRNA中分离RNA分子
[0106] 称取一定量的大肠杆菌MRE 600混合tRNA，溶于焦炭酸二乙酯处理的无RNA酶水中，于NanoDrop(Thermo，美国)下测得RNA浓度。利用高效液相阴离子交换色谱串联二极管
阵列检测器，使用以下色谱条件将100微克混合tRNA分离成为6个组分：色谱柱：TSKgel
DNA‑STAT色谱柱(4.6毫米内径，100毫米柱长，填料粒径为5微米，Tosoh，日本)，流动相A：
20mM的Tris溶液(pH值为8.5)，流动相B：20mM的Tris溶液与1M氯化钠溶液(pH值为8.5)，梯
度洗脱，0‑120分钟，流动相B从53％升到63％。分离的6个RNA组分经冷冻干燥离心机(Marin
Christ，德国)浓缩干燥至粉末，使用焦炭酸二乙酯处理的无RNA酶水溶解，经mirVanaTM
miRNA分离试剂盒进行脱盐处理。图1显示通过这种方法，混合tRNA成功被分离成6个不同的
RNA组分。
阵列检测器，使用以下色谱条件将100微克混合tRNA分离成为6个组分：色谱柱：TSKgel
DNA‑STAT色谱柱(4.6毫米内径，100毫米柱长，填料粒径为5微米，Tosoh，日本)，流动相A：
20mM的Tris溶液(pH值为8.5)，流动相B：20mM的Tris溶液与1M氯化钠溶液(pH值为8.5)，梯
度洗脱，0‑120分钟，流动相B从53％升到63％。分离的6个RNA组分经冷冻干燥离心机(Marin
Christ，德国)浓缩干燥至粉末，使用焦炭酸二乙酯处理的无RNA酶水溶解，经mirVanaTM
miRNA分离试剂盒进行脱盐处理。图1显示通过这种方法，混合tRNA成功被分离成6个不同的
RNA组分。
[0107] 然后，利用高效液相离子对色谱串联二极管阵列检测器分别将组分2与3在以下色谱条件下分离：色谱柱：DNAPac RP色谱柱(3毫米内径，100毫米柱长，填料粒径为4微米，
Thermo，美国)，流动相A：100mM三乙胺(pH＝7.0)，流动相B：流动相A中含25％乙腈，梯度洗
脱，其中0‑5分钟，流动相B从30％变化到37％；5‑25分钟，流动相B从37％变化到45％；25‑35
分钟，流动相B从45％变化到100％。图2显示通过这种方法，分别从组分2和3中得到两个纯
度较高的RNA。
Thermo，美国)，流动相A：100mM三乙胺(pH＝7.0)，流动相B：流动相A中含25％乙腈，梯度洗
脱，其中0‑5分钟，流动相B从30％变化到37％；5‑25分钟，流动相B从37％变化到45％；25‑35
分钟，流动相B从45％变化到100％。图2显示通过这种方法，分别从组分2和3中得到两个纯
度较高的RNA。
[0108] 实施例2化学表征纯化的RNA分子
[0109] 本发明人进一步采用超高效液相色谱‑四级杆‑飞行时间质谱(UHPLC‑QTOF‑MS)联用技术对纯化的tRNA酶解产物的序列及其修饰进行定性分析，从而实现对tRNA的质谱表
征。tRNA经过内切酶RNase T1处理后，会产生若干长度约为2‑15nt的末端带鸟嘌呤核苷3'‑
磷酸的寡核苷酸片段。在ESI源负离子模式下，寡核苷酸一般会产生带多电荷的准分子离子
峰，带电荷数根据寡核苷酸片段长短不同，片段越长带电荷数就越多。通过碰撞诱导解离
(CID)分析tRNA‑RNase T1酶解片段的质谱裂解规律及碎片信息，确定寡核苷酸序列和修饰
组成。在相同碰撞电压下，准分子离子峰强度越大，产生碎片响应强度越大。此外，带较多电
荷的分子离子峰更容易被裂解，产生的序列碎片信息就越多。由于长度大于8nt寡核苷酸片
段CID图谱较为复杂，序列解析过程中选择多个准分子离子，及相应最优的碰撞能量进行研
究。寡核苷酸CID裂解最容易在磷酸二酯键以及碱基与核糖的连接端裂解，产生一系列特征
碎片，主要为a‑B型、c型、y型和w型离子。图3显示，通过c、y和w型离子可分析出寡核苷酸的
序列，a‑B型离子可进一步判断核苷酸修饰种类。
征。tRNA经过内切酶RNase T1处理后，会产生若干长度约为2‑15nt的末端带鸟嘌呤核苷3'‑
磷酸的寡核苷酸片段。在ESI源负离子模式下，寡核苷酸一般会产生带多电荷的准分子离子
峰，带电荷数根据寡核苷酸片段长短不同，片段越长带电荷数就越多。通过碰撞诱导解离
(CID)分析tRNA‑RNase T1酶解片段的质谱裂解规律及碎片信息，确定寡核苷酸序列和修饰
组成。在相同碰撞电压下，准分子离子峰强度越大，产生碎片响应强度越大。此外，带较多电
荷的分子离子峰更容易被裂解，产生的序列碎片信息就越多。由于长度大于8nt寡核苷酸片
段CID图谱较为复杂，序列解析过程中选择多个准分子离子，及相应最优的碰撞能量进行研
究。寡核苷酸CID裂解最容易在磷酸二酯键以及碱基与核糖的连接端裂解，产生一系列特征
碎片，主要为a‑B型、c型、y型和w型离子。图3显示，通过c、y和w型离子可分析出寡核苷酸的
序列，a‑B型离子可进一步判断核苷酸修饰种类。
[0110] 将制备的纯品RNA冷冻干燥，使用焦炭酸二乙酯处理的无RNA酶水复溶，每1微克纯RNA分子与50个单位的RNase T1酶混合，加入醋酸铵至220mM，至于37℃水浴中孵育1.5小时
后，在70℃下孵育10分钟终止反应。10000×g离心1分钟，取上清液进行超高效液相色谱‑质
谱分析。
后，在70℃下孵育10分钟终止反应。10000×g离心1分钟，取上清液进行超高效液相色谱‑质
谱分析。
[0111] 超高效液相色谱‑质谱分析使用的是安捷伦UHPLC 1290系统(安捷伦，美国)，配备安捷伦ultrahigh definition 6545 Q‑TOF质谱仪。色谱分离基于ACQUITY UPLC OST C18
色谱柱(2.1毫米内径，100毫米柱长，填料粒径为1.7微米，Waters，美国)，流动相A为100mM
六氟异丙醇与15mM三乙胺，流动相B为50％甲醇溶于流动相A，梯度洗脱程序为0‑1.5分钟，
流动相B保持在2％；1.5‑8.3分钟，流动相B从2％变化到28％；8.3‑16.5分钟，流动相B从
28％变化到34％。离子源参数：气流温度保持在320℃，电压为3.5千伏，鞘气流速为12升/分
钟，鞘气温度为350℃。表5显示纯化的RNA分子经特异性RNA T1酶解片段的二级质谱结果，
其信号与数据库中已报到的大肠杆菌tRNA特异性片段一致。图4显示纯化的RNA分子经特异
性RNA T1酶解片段的指认，因此确认纯化的RNA分子为tRNA‑Val(UAC)(tRNA‑1)与tRNA‑Leu
(CAG)(tRNA‑2)。
色谱柱(2.1毫米内径，100毫米柱长，填料粒径为1.7微米，Waters，美国)，流动相A为100mM
六氟异丙醇与15mM三乙胺，流动相B为50％甲醇溶于流动相A，梯度洗脱程序为0‑1.5分钟，
流动相B保持在2％；1.5‑8.3分钟，流动相B从2％变化到28％；8.3‑16.5分钟，流动相B从
28％变化到34％。离子源参数：气流温度保持在320℃，电压为3.5千伏，鞘气流速为12升/分
钟，鞘气温度为350℃。表5显示纯化的RNA分子经特异性RNA T1酶解片段的二级质谱结果，
其信号与数据库中已报到的大肠杆菌tRNA特异性片段一致。图4显示纯化的RNA分子经特异
性RNA T1酶解片段的指认，因此确认纯化的RNA分子为tRNA‑Val(UAC)(tRNA‑1)与tRNA‑Leu
(CAG)(tRNA‑2)。
[0112] 表5.tRNA‑1和tRNA‑2的T1酶解特征片段及二级质谱数据。
[0113]
[0114]
[0115] 实施例3制备tRNA‑half分子
[0116] 本发明人为进一步利用特异性RNA…S1酶制备tRNA‑half分子。每500纳克纯化的tRNA分子溶于焦碳酸二乙酯处理的无RNA酶水中，与8个单位的S1酶混合，加入2微升5倍浓
度的反应盐溶液，用去离子水补足至20微升体积。将混合溶液至于25℃水浴中孵育40分钟
后，加入0.5微升0.5M浓度的EDTA溶液使反应停止。10000×g离心1分钟，取上清液，利用尿
素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，图5A显示与tRNA‑Leu(CAG)分子比较，酶解后的产物具
有2个明显的片段，大小约30个核苷酸，由此证明酶解是成功的，产物为tRNA‑Leu(CAG)
half。继续将酶解产物进样至超高效液相色谱仪中，使用实施例2中色谱条件对片段进行分
离，见图5B制备相应的tRNA‑half分子，制备溶液浓缩冻干，置于‑80℃下保存。tRNA‑Val
(UAC)half采用相似的方法制备得到。
度的反应盐溶液，用去离子水补足至20微升体积。将混合溶液至于25℃水浴中孵育40分钟
后，加入0.5微升0.5M浓度的EDTA溶液使反应停止。10000×g离心1分钟，取上清液，利用尿
素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，图5A显示与tRNA‑Leu(CAG)分子比较，酶解后的产物具
有2个明显的片段，大小约30个核苷酸，由此证明酶解是成功的，产物为tRNA‑Leu(CAG)
half。继续将酶解产物进样至超高效液相色谱仪中，使用实施例2中色谱条件对片段进行分
离，见图5B制备相应的tRNA‑half分子，制备溶液浓缩冻干，置于‑80℃下保存。tRNA‑Val
(UAC)half采用相似的方法制备得到。
[0117] 实施例4RNA分子的合成
[0118] 本发明人基于数据库中大肠杆菌tRNA的147个序列设计并合成了长度22bp的RNA分子。特别地，认为tRNA序列具有至少3个部分，即5’‑末端部分(5’‑t)、3’‑末端部分(3’‑t)
和反密码子部分。每种特别设计的RNA分子含有任何一个部分。例如，设计的含有相应全长
tRNA序列的5’末端部分的RNA分子称为5’‑t组RNA分子；设计的含有相应全长tRNA序列的3’
末端部分的RNA分子称为3’‑t组RNA分子；设计的含有相应全长tRNA序列的反密码子部分的
RNA分子称为反密码子组RNA分子。如表3所示，具有选自SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的
正义序列和选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的互补反义序列的RNA分子通过在表1中
的tRNA序列上的不同位点切割来设计和合成。如表4所示，具有选自SEQ ID NO:389至SEQ
ID NO:391的反义序列和选自SEQ ID NO:392至SEQ ID NO:394的互补正义序列的RNA分子
通过在表3中的EC83序列在不同核苷酸位点添加化学修饰来设计和合成。
和反密码子部分。每种特别设计的RNA分子含有任何一个部分。例如，设计的含有相应全长
tRNA序列的5’末端部分的RNA分子称为5’‑t组RNA分子；设计的含有相应全长tRNA序列的3’
末端部分的RNA分子称为3’‑t组RNA分子；设计的含有相应全长tRNA序列的反密码子部分的
RNA分子称为反密码子组RNA分子。如表3所示，具有选自SEQ ID NO:295至SEQ ID NO:388的
正义序列和选自SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:294的互补反义序列的RNA分子通过在表1中
的tRNA序列上的不同位点切割来设计和合成。如表4所示，具有选自SEQ ID NO:389至SEQ
ID NO:391的反义序列和选自SEQ ID NO:392至SEQ ID NO:394的互补正义序列的RNA分子
通过在表3中的EC83序列在不同核苷酸位点添加化学修饰来设计和合成。
[0119] 实施例5 tRNA、tRNA‑half和tRF mimic分子对结肠癌细胞的细胞毒性作用
[0120] HCT‑8、氟尿嘧啶抗性HCT‑8、氟尿嘧啶抗性LoVo细胞系在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基1640培养基中培养。将LoVo细胞系在含有10％FBS和1％青霉素/链
霉素的F‑12K培养基中培养。上述所有细胞系在含有5％CO2的潮湿气氛下在37℃下培养。
霉素的F‑12K培养基中培养。上述所有细胞系在含有5％CO2的潮湿气氛下在37℃下培养。
[0121] 在细胞毒性分析中，将每种癌细胞系的指数生长细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔微板中的100微升培养基中，并在处理前使之粘附24小时。然后在实施例1‑4中的
TM
含有核酸递送载体，即Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific，美
国)中获得的连续浓度的RNA分子添加至细胞中。处理48小时后，向各孔中添加MTT溶液(每
孔50微升，1mg/mL溶液)并在37℃下孵育4小时。随后，添加200微升二甲基亚砜(DMSO)，并使
用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，美国)在570nm下量热法测定所得溶液的光
密度。获得剂量‑反应曲线，并通过GraphPad Prism 5(GraphPad，美国)计算IC50值。每个实
验进行三次。IC50结果表示为平均值±标准偏差。
TM
含有核酸递送载体，即Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific，美
国)中获得的连续浓度的RNA分子添加至细胞中。处理48小时后，向各孔中添加MTT溶液(每
孔50微升，1mg/mL溶液)并在37℃下孵育4小时。随后，添加200微升二甲基亚砜(DMSO)，并使
用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，美国)在570nm下量热法测定所得溶液的光
密度。获得剂量‑反应曲线，并通过GraphPad Prism 5(GraphPad，美国)计算IC50值。每个实
验进行三次。IC50结果表示为平均值±标准偏差。
[0122] 在添加MTT溶液之前，用tRNA‑Val(UAC)、tRNA‑Leu(CAG)、5’‑tRNA‑Val(UAC)half、3’‑tRNA‑Val(UAC)half、5’‑tRNA‑Leu(CAG)half，3’‑tRNA‑Leu(CAG)half、EC41 mimic，
EC42 mimic，EC85 mimic和EC86 mimic的50nM RNA分子处理HCT‑8细胞48小时。将这些细胞
的细胞活力与对照组和RNAiMAX组进行比较。使用氟尿嘧啶作为比较例。图6A显示这些RNA
分子对结肠癌细胞也是有效的。
EC42 mimic，EC85 mimic和EC86 mimic的50nM RNA分子处理HCT‑8细胞48小时。将这些细胞
的细胞活力与对照组和RNAiMAX组进行比较。使用氟尿嘧啶作为比较例。图6A显示这些RNA
分子对结肠癌细胞也是有效的。
[0123] 图6B显示，显示实施例4中合成的RNA分子对HCT‑8细胞的细胞毒性作用。结果显示，在该实施例中，基于实施例4中确定的tRNA序列设计和合成的RNA分子在抑制癌细胞，特
别是结肠癌细胞的生长和增殖方面也是有效的。图6C显示，特别是EC83 mimic显示最强的
细胞毒性。
别是结肠癌细胞的生长和增殖方面也是有效的。图6C显示，特别是EC83 mimic显示最强的
细胞毒性。
[0124] 然后，本发明人特别确定了RNA分子EC83 mimic和不同化学修饰的EC83‑M1、EC83‑M2和EC83‑M3 mimic不同浓度下，即在6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM下对HCT‑
8、LoVo细胞的细胞毒性作用和IC50。如图7所示，将结果与对照组和含有转染剂的RNAiMAX组
进行比较。结果表明，RNA分子EC83 mimic和不同化学修饰的EC83‑M1、EC83‑M2和EC83‑M3
mimic对抑制结肠癌细胞和氟尿嘧啶抗性癌细胞的生长和增殖具有剂量依赖性作用。它们
的IC50见表6。使用氟尿嘧啶作为比较例。
8、LoVo细胞的细胞毒性作用和IC50。如图7所示，将结果与对照组和含有转染剂的RNAiMAX组
进行比较。结果表明，RNA分子EC83 mimic和不同化学修饰的EC83‑M1、EC83‑M2和EC83‑M3
mimic对抑制结肠癌细胞和氟尿嘧啶抗性癌细胞的生长和增殖具有剂量依赖性作用。它们
的IC50见表6。使用氟尿嘧啶作为比较例。
[0125] 表6.EC83 mimic和不同化学修饰的EC83‑M1、EC83‑M2和EC83‑M3 mimic对结肠癌细胞和氟尿嘧啶抗性癌细胞的半数有效抑制浓度IC50
[0126]
[0127] 在抑制细胞增殖实验中，将HCT‑8和LoVo细胞系的指数生长细胞以每孔1000个细胞的密度接种在6孔微板中的2毫升培养基中，并在处理前使之粘附24小时。然后在实施例
TM
1‑4中的含有核酸递送载体，即Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher
Scientific，美国)中获得的单一浓度的RNA分子添加至细胞中。处理48小时后，弃去药物溶
液，换上新的培养基2毫升，将6孔微板继续培养14天后，弃去培养基，使用4％多聚甲醛溶液
固定20分钟后，再使用结晶紫溶液染色10分钟，去离子水洗取多余的染色液，6孔微板拍照，
通过ImageJ(美国)计算细胞克隆数量。每个实验进行三次。结果表示为平均值±标准偏差。
TM
1‑4中的含有核酸递送载体，即Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher
Scientific，美国)中获得的单一浓度的RNA分子添加至细胞中。处理48小时后，弃去药物溶
液，换上新的培养基2毫升，将6孔微板继续培养14天后，弃去培养基，使用4％多聚甲醛溶液
固定20分钟后，再使用结晶紫溶液染色10分钟，去离子水洗取多余的染色液，6孔微板拍照，
通过ImageJ(美国)计算细胞克隆数量。每个实验进行三次。结果表示为平均值±标准偏差。
[0128] 图8显示，使用EC83 mimic和不同化学修饰的EC83‑M1、EC83‑M2和EC83‑M3 mimic的50nM或25nM分子，按上述方法处理HCT‑8或LoVo细胞后，将这些细胞的克隆数量与对照组
进行比较。使用氟尿嘧啶作为比较例。结果表明，这些RNA分子能够显著抑制结肠癌细胞的
增殖。其中，EC83‑M2显示出更好的抑制增殖活性。
进行比较。使用氟尿嘧啶作为比较例。结果表明，这些RNA分子能够显著抑制结肠癌细胞的
增殖。其中，EC83‑M2显示出更好的抑制增殖活性。
[0129] 在抑制细胞迁移实验中，将HCT‑8和LoVo细胞系的指数生长细胞以每孔50万个细胞的密度接种在6孔微板中的2毫升培养基中，并在处理前使之粘附24小时。然后使用1毫升
无菌枪头在6孔微板底部均匀地进行十字划痕，使用磷酸盐溶液洗去划痕中的细胞，置于显
TM
微镜下进行拍照。继而在实施例1‑4中的含有核酸递送载体，即Lipofectamine RNAiMAX转
染试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)中获得的单一浓度的RNA分子添加至细胞中，继
续培养。在第24小时和48小时将细胞置于显微镜下拍照，使用ImageJ(美国)计算划痕区域
的面积。每个实验进行三次。结果表示为平均值±标准偏差。
无菌枪头在6孔微板底部均匀地进行十字划痕，使用磷酸盐溶液洗去划痕中的细胞，置于显
TM
微镜下进行拍照。继而在实施例1‑4中的含有核酸递送载体，即Lipofectamine RNAiMAX转
染试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)中获得的单一浓度的RNA分子添加至细胞中，继
续培养。在第24小时和48小时将细胞置于显微镜下拍照，使用ImageJ(美国)计算划痕区域
的面积。每个实验进行三次。结果表示为平均值±标准偏差。
[0130] 图9显示，使用EC83 mimic和不同化学修饰的EC83‑M1、EC83‑M2和EC83‑M3 mimic的50nM或25nM分子，按上述方法处理HCT‑8或LoVo细胞后，将这些细胞上的划痕面积与对照
组的进行比较。使用氟尿嘧啶作为比较例。结果表明，这些RNA分子能够显著抑制结肠癌细
胞的迁移。其中，EC83‑M2显示出更好的抑制迁移活性。
组的进行比较。使用氟尿嘧啶作为比较例。结果表明，这些RNA分子能够显著抑制结肠癌细
胞的迁移。其中，EC83‑M2显示出更好的抑制迁移活性。