高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。该菌株为菌株BA‑1和BA‑2中的至少一种；所述菌株BA‑1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2‑1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、AtLUP、GDH2、GDH、CYP716A155和RoCPR1基因；将AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到菌株BA‑1染色体GAL80位点可获得菌株BA‑2。本发明构建的菌株通过发酵培养，其桦木酸的产量可以达到1.5g/L。

权利要求

1.一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于：为菌株BA‑1和BA‑2中的至少一种；

所述菌株BA‑1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2‑1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、AtLUP、GDH2、GDH 、CYP716A155和RoCPR1基因；其中，tHMG1和UPC2‑1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；

IDI1和SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；

GDH2和GDH基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons1位点；

AtSQS1和AtSQE2基因整合到酿酒酵母染色体HIS3位点；

ERG8、ERG10、ERG12、ERG13和ERG19基因整合到酿酒酵母染色体Gal7位点；

AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；

所述菌株BA‑2以菌株BA‑1为出发菌株，将AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到菌株BA‑1染色体GAL80位点；

所述的UPC2‑1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp；

所述的CYP716A155基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的UPC2‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的tHMG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示；

所述的SmFPPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示；

所述的RoCPR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

所述的GDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。

2.根据权利要求1所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因为运用CRISPR‑Cas9基因敲除系统进行基因敲除，具体步骤如下：

（A）将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4、通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑1；将PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑2；

（B）将重组质粒pCRCT‑1转化酿酒酵母，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；然后将重组质粒pCRCT‑2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株。

3.根据权利要求2所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于：步骤（B）中所述的筛选为通过SD‑URA缺陷培养基进行筛选；其中，所述SD‑URA缺陷培养基的配方如下：YNB培养基6.7 g/L，尿嘧啶缺陷氨基酸100 X 10 mL/L，葡萄糖20 g/L；其中，

所述的尿嘧啶缺陷氨基酸100 X的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25 g，精氨酸0.12 g，天冬氨酸 0.6 g，谷氨酸0.6 g，组氨酸0.12 g，亮氨酸0.36 g，赖氨酸0.18 g，甲硫氨酸0.12 g，苯丙氨酸0.3 g，丝氨酸2.25 g，苏氨酸1.2 g，色氨酸0.24 g，酪氨酸0.18 g，缬氨酸0.9 g，用ddH2O定容到57 mL。

4.权利要求1～3任一项所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）基因敲除：将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑1；将PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑2；然后将重组质粒pCRCT‑1转化酿酒酵母BY4741，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；再将重组质粒pCRCT‑2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株BY4741‑1；

（2）构建以下13个模块：

（a）将PTDH2、ERG8和TPYX212顺序连接，得到模块PTDH2‑ERG8‑TPYX212，命名为模块1；

（b）将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1‑ERG10‑TADH1，命名为模块2；

（c）将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，得到模块PTDH3‑ERG12‑TTDH2，命名为模块3；

（d）将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1‑ERG13‑TCYC1，命名为模块4；

（e）将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1‑ERG19‑TFBA1，命名为模块5；

（f）将PTPI1、AtSQS1和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1‑AtSQS1‑TFBA1，命名为模块6；

（g）将PPGK1、AtSQE2和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1‑AtSQE2‑TADH1，命名为模块7；

（h）将PTEF1、AtLUP和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1‑AtLUP‑TCYC1，命名为模块8；

（i）将PPGK1、CYP716A155和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1‑CYP716A155‑TADH1，命名为模块

9；

（j）将PTEF1、RoCPR1和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1‑RoCPR1‑TCYC1，命名为模块10；

（k）将tHMG1、PPGK1、PTEF1和UPC2‑1顺序连接，得到模块tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1，命名为模块11；

（l）将IDI1、PPGK1、PTEF1和SmFPPS顺序连接，得到模块IDI1‑PPGK1‑PTEF1‑SmFPPS，命名为模块12；

（m）将GDH2、PTDH3、PTDH2和GDH顺序连接，得到模块GDH2‑PTDH3‑PTDH2‑GDH，命名为模块13；

（3）构建菌株BY4741‑7

（I）将步骤（k）中得到的模块11插入到载体pCfB2875的sfa Ι酶切位点，得到整合载体pCfB2875‑1；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合载体pCfB2875‑1，得到DNA整合片段A1；再将DNA整合片段A1整合到步骤（1）中得到的菌株BY4741‑1的染色体TY3位点，得到菌株BY4741‑2；

（II）将步骤（l）中得到的模块12插入到载体pCfB2798的sfa Ι酶切位点，得到整合载体pCfB2798‑1；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合载体pCfB2798‑1，得到DNA整合片段A2；再将DNA整合片段A2整合到步骤（I）中得到的菌株BY4741‑2的染色体TY4位点，得到菌株BY4741‑3；

（III）将步骤（m）中得到的模块13插入到载体pCfB2989met15的sfa Ι酶切位点，得到整合载体pCfB2989met15‑1；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合载体pCfB2989met15‑1，得到DNA整合片段A3；再将DNA整合片段A3整合到步骤（II）中得到的菌株BY4741‑3的染色体TY1Cons1位点，得到菌株BY4741‑4；

（IV）将pSH65载体转化菌株BY4741‑4，然后用含有zeocin的YPD培养基进行筛选，得到菌株BY4741‑5；

（V）将模块1、模块2、模块3、模块4、模块5和筛选标记MET15共同转化菌株BY4741‑5，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑MET筛选培养，得到菌株BY4741‑6；

（VI）将模块6、模块7和筛选标记KILEU2共同转化菌株BY4741‑6，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑LEU筛选培养，得到菌株BY4741‑7；

（4）构建菌株BA‑1

将模块8、模块9、模块10和筛选标记HIS3共同转化菌株BY4741‑7，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑HIS筛选培养，得到菌株BA‑1，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌；

（5）构建菌株BA‑2

将模块8、模块9、模块10和筛选标记KIURA3共同转化菌株BA‑1，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑URA筛选培养，得到菌株BA‑2，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌；

步骤（2）中所述的UPC2‑1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp；

步骤（2）中所述的CYP716A155的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤（2）中所述的UPC2‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤（2）中所述的tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤（2）中所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示；

步骤（2）中所述的SmFPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

步骤（2）中所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示；

步骤（2）中所述的RoCPR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

步骤（2）中所述的GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

步骤（2）中所述的PPGK1、PTEF1、PTDH3、PTDH2、PTPI1为启动子序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19～23所示；

步骤（2）中所述的TADH1、TCYC1、TTDH2、TPYX212、TFBA1为终止子序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～28所示；

步骤（V）中所述的筛选标记MET15的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；

步骤（VI）所述的筛选标记KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

步骤（4）所述的筛选标记HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；

步骤（5）所述的筛选标记KIURA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

5.根据权利要求4所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的13个模块的构建通过重叠PCR的方法进行构建；

步骤（3）中所述的整合为采用酵母转化试剂盒进行整合；

步骤（IV）中所述的YPD培养基中zeocin的浓度为100 μg/mL；其中，YPD平板的配方如下：蛋白胨20 g/L，酵母提取物 10 g/L，葡萄糖20 g/L；

步骤（V）中所述的酵母缺陷型培养基SD‑MET的配方如下：YNB培养基 6.7 g/L，甲硫氨酸缺陷氨基酸100 X 10 mL/L，葡萄糖20 g/L；

步骤（VI）中所述的酵母缺陷型培养基SD‑LEU的配方如下：YNB培养基 6.7 g/L，亮氨酸缺陷氨基酸 100 X 10 mL/L，葡萄糖20 g/L；

步骤（4）中所述的酵母缺陷型培养基SD‑HIS的配方如下：YNB 培养基6.7 g/L，组氨酸缺陷氨基酸100 X 10 mL/L，葡萄糖20 g/L；

步骤（5）中所述的酵母缺陷型培养基SD‑URA的配方如下：YNB 培养基6.7 g/L，尿嘧啶缺陷氨基酸100 X 10 mL/L，葡萄糖20 g/L。

6.权利要求1～3任一项所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌在制备羽扇豆醇、桦木醇和/或桦木酸中的应用。

7.一种桦木酸的制备方法，其特征在于：为将权利要求1～3任一项所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到桦木酸。

8.根据权利要求7所述的桦木酸的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，待溶氧值达到60%时补加补料培养基，使培养基内葡萄糖的含量维持在5 g/L，得到桦木酸；

所述的发酵培养基的组成如下：发酵培养基组成包括：(NH4)2SO4 15 g/L，KH2PO4 8 g/L，MgSO4 3 g/L，ZnSO4•7H2O 0.72 g/L，维他命溶液12 mL/L，微量金属盐溶液10 mL/L，25 g/L葡萄糖；其中：

维他命溶液的组成包括：维生素H 0.05 g/L，泛酸钙1 g/L，烟酸1 g/L，肌醇25 g/L，盐酸硫胺素1 g/L，盐酸吡哆醇1 g/L和对氨基苯甲酸0.2 g/L；

微量金属盐溶液组成如下：EDTA 15 g/L，ZnSO4•7H2O 10.2 g/L，MnCl2•4H2O 0.5 g/L，CuSO4 0.5 g/L，CoCl2•6H2O 0.86 g/L，Na2MoO4•2H2O 0.56 g/L，CaCl2•2H2O 3.84 g/L和FeSO4•7H2O 5.12 g/L；

所述的补料培养基组成如下：微量金属盐溶液10 mL/L，维他命溶液12 mL/L，KH2PO4 9 g/L，MgSO4 2.5 g/L，K2SO4 3.5 g/L，Na2SO4 0.28 g/L，葡萄糖585 g/L；其中：微量金属盐溶液组成如下：EDTA 15 g/L，ZnSO4•7H2O 10.2 g/L，MnCl2•4H2O 0.5 g/L，CuSO4 0.5 g/L，CoCl2•6H2O 0.86 g/L，Na2MoO4•2H2O 0.56 g/L，CaCl2•2H2O 3.84 g/L和FeSO4•7H2O 5.12 g/L；

维他命溶液的组成如下：维生素H 0.05 g/L，泛酸钙1 g/L，烟酸1 g/L，肌醇25 g/L，盐酸硫胺素1 g/L，盐酸吡哆醇1 g/L和对氨基苯甲酸0.2 g/L；

所述的发酵培养的条件为：发酵温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值30%，搅拌速度300～

1000 rpm，通气量3～20 L/min，发酵时间24～168 h。

说明书

高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程和代谢工程领域，特别涉及一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 桦木酸(Betulinic acid)，又称白桦脂酸，是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，最早发现于白桦树树皮中，桦木酸及其衍生化合物具有多种药理活性，如抗肿瘤活性、抗
HIV活性、抗菌、抗炎和免疫调节等，特别是在抗黑色素瘤和艾滋病方面有显著的活性。早在
20世纪90年代，研究表明桦木酸对黑色素瘤细胞具有极强的选择性细胞毒性(Pisha E,et 
al.Nature Medicine,1995,1(10):1046‑1051)，近年来，随着对桦木酸药理活性更加深入
的研究，发现桦木酸对尤文氏肉瘤、神经母细胞瘤和髓母细胞瘤等儿童常见细胞瘤均有抑
制作用(Fulda S,et al.International Journal of Cancer,2015,82(3):435‑441)。

[0003] 桦木酸不仅可以选择性抑制肿瘤细胞的生长，而且对正常细胞无毒性或者毒性很小，相比于其它化疗药物，其副作用也更少，同时桦木酸在与其它抗肿瘤药物联合使用，会
出现协同作用，增强抗肿瘤活性，如将桦木酸与长春新碱在小鼠黑色素瘤细胞B16F10模型
中联合使用，可以产生协同的细胞毒性效应，使肿瘤细胞分裂停滞在不同周期，从而导致
B16F10黑色素瘤细胞的凋亡(Sawada N,et al.Br J Cancer,2004,90(8):1672‑1678)。

[0004] 此外，研究表明，桦木酸可以通过抑制包膜介导的HIV‑1病毒与正常细胞膜的融合，阻碍病毒对细胞膜的吸附与融合，阻止其形成成熟的HIV蛋白，从而降低HIV的感染性
(Holzsmith S L,et al.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(1):60‑66)。近年来，通
过对桦木酸C‑3和C‑28结构的修饰，发现在桦木酸C‑3位羟基引入二甲基丁二酰基团，得到
衍生物PA‑457(Bevirimat)，该化合物通过阻断Gag蛋白，阻止外壳释放，抑制病毒的转移与
扩散，从而抑制HIV病毒的复制(Li F,et al.PNAS,2003,100(23):13555‑60)，相比于桦木
酸具有更好的抗HIV活性，目前该化合物已经在I和II期临床阶段取得成功。对桦木酸C‑28
位进行结构修饰，通过五步反应合成桦木酸酰胺类衍生物RPR103611，该化合物作用机制与
PA‑457不同，其主要是通过抑制HIV‑1跨膜蛋白gp41，干扰病毒与细胞膜的融合，从而阻止
HIV病毒的入侵与感染，其抗HIV‑1型病毒的IC50值为0.04～0.1μmol/L，是一种非常具有成
药前景的HIV细胞膜融合抑制剂(Mayaux J F,et al.PNAS,1994,91(9):3564‑3568)。

[0005] 目前桦木酸的制备方法主要有两种，一种是通过天然植物直接提取分离，虽然随着提取方法的不断改进，提取效率不断提高，但由于天然植物中桦木酸的含量较低，因此产
量仍然不高，且会消耗大量植物资源和有机试剂。而在白桦树树皮中，桦木醇的含量远远高
于桦木酸的含量，因此另一种方法就是通过化学合成方法将桦木醇合成桦木酸，但其合成
路线较长，反应条件苛刻，杂质较多，纯化困难，因此不适合于大规模工业化生产。

[0006] 近年来，随着合成生物学的飞速发展，越来越多的药用活性成分通过这种绿色、高效的方法生产，如青蒿素、紫杉醇、丹参酮、灯盏乙素等都在合成生物学研究中取得了重大
突破。目前桦木酸的生物合成途径已经明了，通过MVA途径产生的萜类前体化合物IPP和
DMAPP可以在法呢烯焦磷酸合成酶催化下生成FPP(法呢烯焦磷酸)，FPP在角鲨烯合成酶催
化下生成角鲨烯，继而在鲨烯环氧化酶催化下生成2,3‑氧化鲨烯，进一步通过羽扇豆醇合
成酶催化生成羽扇豆醇，最后通过细胞色素P450酶氧化生成桦木酸(图1表示桦木酸在酿酒
酵母工程菌内的生物合成途径)。在之前的研究中已有生产桦木酸的酿酒酵母工程菌株的
报道(Chen Z,Li J,Li C,et al.Bmc Biotechnology,2016,16(1):59)，但由于所选的细胞
色素P450具有底物宽泛性，当以羽扇豆醇为底物时其氧化效率较低，同时由于对酿酒酵母
MVA途径的优化还不够完善，因此桦木酸的产量仍然较低。

发明内容

[0007] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌。

[0008] 本发明的另一目的在于提供所述高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法。

[0009] 本发明的又一目的在于提供所述高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的应用。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，为菌株BA‑1和BA‑2中的至少一种；

[0011] 所述菌株BA‑1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2‑1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、
AtLUP、GDH2、GDH、CYP716A155和RoCPR1基因；其中，

[0012] tHMG1和UPC2‑1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；

[0013] IDI1和SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；

[0014] GDH2和GDH基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons1位点；

[0015] AtSQS1和AtSQE2基因整合到酿酒酵母染色体HIS3位点；

[0016] ERG8、ERG10、ERG12、ERG13和ERG19基因整合到酿酒酵母染色体Gal7位点；

[0017] AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；

[0018] 所述菌株BA‑2以菌株BA‑1为出发菌株，将AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到菌株BA‑1染色体GAL80位点。

[0019] 所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。

[0020] 所述的敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因为运用CRISPR‑Cas9基因敲除系统进行基因敲除，具体步骤如下：

[0021] (A)将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑1；将PEP4和PAH1基因的crRNA spacer
核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑2；

[0022] (B)将重组质粒pCRCT‑1转化酿酒酵母，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；然后将重组质粒pCRCT‑2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛
选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株。

[0023] 步骤(B)中所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。

[0024] 步骤(B)中所述的培养的温度优选为30℃。

[0025] 步骤(B)中所述的筛选为通过SD‑URA缺陷培养基进行筛选；其中，所述SD‑URA缺陷培养基的配方如下：YNB(YNB培养基)6.7g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄
糖20g/L(固体SD‑URA缺陷培养基在制备时多添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，

[0026] 所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸
0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，
用ddH2O定容到57mL。

[0027] 所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2基因可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示。

[0028] 所述的tHMG1基因优选为从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0029] 所述的UPC2‑1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp得到UPC2‑1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0030] 所述的CYP716A155基因针对酵母菌经过密码子优化人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0031] 所述的SmFPPS基因为通过如下方法制备得到：提取丹参总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到SmFPPS基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

[0032] 所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因为通过如下方法制备得到：提取拟南芥总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，分别克隆得到AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因；其核
苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示。

[0033] 所述的RoCPR1基因为通过如下方法制备得到：提取迷迭香总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到RoCPR1基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

[0034] 所述的GDH基因优选为从枯草芽孢杆菌基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

[0035] 所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

[0036] (1)基因敲除：将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT‑1；将PEP4和PAH1基因的
crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组
质粒pCRCT‑2；然后将重组质粒pCRCT‑1转化酿酒酵母BY4741，经过培养筛选，得到敲除
LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；再将重组质粒pCRCT‑2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌
株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株BY4741‑1；

[0037] (2)构建以下13个模块：

[0038] (a)将PTDH2、ERG8和TPYX212顺序连接，得到模块PTDH2‑ERG8‑TPYX212，命名为模块1；

[0039] (b)将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1‑ERG10‑TADH1，命名为模块2；

[0040] (c)将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，得到模块PTDH3‑ERG12‑TTDH2，命名为模块3；

[0041] (d)将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1‑ERG13‑TCYC1，命名为模块4；

[0042] (e)将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1‑ERG19‑TFBA1，命名为模块5；

[0043] (f)将PTPI1、AtSQS1和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1‑AtSQS1‑TFBA1，命名为模块6；

[0044] (g)将PPGK1、AtSQE2和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1‑AtSQE2‑TADH1，命名为模块7；

[0045] (h)将PTEF1、AtLUP和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1‑AtLUP‑TCYC1，命名为模块8；

[0046] (i)将PPGK1、CYP716A155和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1‑CYP716A155‑TADH1，命名为模块9；

[0047] (j)将PTEF1、RoCPR1和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1‑RoCPR1‑TCYC1，命名为模块10；

[0048] (k)将tHMG1、PPGK1、PTEF1和UPC2‑1顺序连接，得到模块tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1，命名为模块11；

[0049] (l)将IDI1、PPGK1、PTEF1和SmFPPS顺序连接，得到模块IDI1‑PPGK1‑PTEF1‑SmFPPS，命名为模块12；

[0050] (m)将GDH2、PTDH3、PTDH2和GDH顺序连接，得到模块GDH2‑PTDH3‑PTDH2‑GDH，命名为模块13；

[0051] (3)构建菌株BY4741‑7

[0052] (I)将步骤(k)中得到的模块11插入到载体pCfB2875的sfaΙ酶切位点，得到整合载体pCfB2875‑1；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pCfB2875‑1，得到DNA整合片段
A1；再将DNA整合片段A1整合到步骤(1)中得到的菌株BY4741‑1的染色体TY3位点，得到菌株
BY4741‑2；

[0053] (II)将步骤(l)中得到的模块12插入到载体pCfB2798的sfaΙ酶切位点，得到整合载体pCfB2798‑1；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pCfB2798‑1，得到DNA整合片
段A2；再将DNA整合片段A2整合到步骤(I)中得到的菌株BY4741‑2的染色体TY4位点，得到菌
株BY4741‑3；

[0054] (III)将步骤(m)中得到的模块13插入到载体pCfB2989met15的sfaΙ酶切位点，得到整合载体pCfB2989met15‑1；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体
pCfB2989met15‑1，得到DNA整合片段A3；再将DNA整合片段A3整合到步骤(II)中得到的菌株
BY4741‑3的染色体TY1Cons1位点，得到菌株BY4741‑4；

[0055] (IV)将pSH65载体转化菌株BY4741‑4，然后用含有zeocin(博来霉素)的YPD培养基进行筛选，得到菌株BY4741‑5；

[0056] (V)将模块1、模块2、模块3、模块4、模块5和筛选标记MET15共同转化菌株BY4741‑5，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑MET筛选培养，得到菌株BY4741‑6；

[0057] (VI)将模块6、模块7和筛选标记KILEU2共同转化菌株BY4741‑6，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑LEU筛选培养，得到菌株BY4741‑7；

[0058] (4)构建菌株BA‑1

[0059] 将模块8、模块9、模块10和筛选标记HIS3共同转化菌株BY4741‑7，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑HIS筛选培养，得到菌株BA‑1，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌；

[0060] (5)构建菌株BA‑2

[0061] 将模块8、模块9、模块10和筛选标记KIURA3共同转化菌株BA‑1，然后通过酵母缺陷型培养基SD‑URA筛选培养，得到菌株BA‑2，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌。

[0062] 步骤(1)中所述的筛选为通过SD‑URA缺陷培养基进行筛选；其中，所述SD‑URA缺陷培养基的配方如下：YNB(YNB培养基)6.7g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄
糖20g/L(固体SD‑URA缺陷培养基在制备时多添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，

[0063] 所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸
0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，
用ddH2O定容到57mL。

[0064] 步骤(2)中所述的13个模块的构建通过重叠PCR的方法进行构建。

[0065] 步骤(2)中所述的CYP716A155针对酵母菌经过密码子优化人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0066] 步骤(2)中所述的UPC2‑1为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0067] 步骤(2)中所述的tHMG1优选为从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0068] 步骤(2)中所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示。

[0069] 步骤(2)中所述的SmFPPS为通过如下方法制备得到：提取丹参总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到SmFPPS基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

[0070] 步骤(2)中所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2为通过如下方法制备得到：提取拟南芥总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，分别克隆得到AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基
因；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示。

[0071] 步骤(2)中所述的RoCPR1为通过如下方法制备得到：提取迷迭香总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到RoCPR1基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所
示。

[0072] 步骤(2)中所述的GDH优选为从枯草芽孢杆菌基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

[0073] 步骤(2)中所述的PPGK1、PTEF1、PTDH3、PTDH2、PTPI1为启动子序列，可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19～23所示。

[0074] 步骤(2)中所述的TADH1、TCYC1、TTDH2、TPYX212、TFBA1为终止子序列，可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～28所示。

[0075] 步骤(3)中所述的整合为采用酵母转化试剂盒进行整合；优选为用Frozen‑EZ TM
Yeast Transformation II Kit 试剂盒进行整合。

[0076] 步骤(IV)中所述的YPD培养基中zeocin(博来霉素)的浓度为100μg/mL；其中，YPD平板的配方如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L(固体YPD培养基在配制时
添加20g/L的琼脂粉即可)。

[0077] 步骤(V)中所述的筛选标记MET15的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。

[0078] 步骤(V)中所述的酵母缺陷型培养基SD‑MET的配方如下：YNB培养基6.7g/L，甲硫氨酸(MET)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD‑MET在配制
时添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，

[0079] 所述的甲硫氨酸(MET)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸
0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用
ddH2O定容到57mL。

[0080] 步骤(VI)所述的筛选标记KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。

[0081] 步骤(VI)中所述的酵母缺陷型培养基SD‑LEU的配方如下：YNB培养基6.7g/L，亮氨酸(LEU)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD‑URA在配制时
添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，

[0082] 所述的亮氨酸(LEU)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸
0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用
ddH2O定容到57mL。

[0083] 步骤(4)所述的筛选标记HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。

[0084] 步骤(4)中所述的酵母缺陷型培养基SD‑HIS的配方如下：YNB培养基6.7g/L，组氨酸(HIS)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD‑HIS在配制时
添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，

[0085] 所述的组氨酸(HIS)缺陷氨基酸(100X)配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸
0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用
ddH2O定容到57mL。

[0086] 步骤(5)所述的筛选标记KIURA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

[0087] 步骤(5)中所述的酵母缺陷型培养基SD‑URA的配方如下：YNB培养基6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD‑URA在配制时
添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，

[0088] 所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸
0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，
用ddH2O定容到57mL。

[0089] 步骤(IV)、(V)、(VI)、(4)和(5)中所述的培养的条件优选为：30℃培养3～6天。

[0090] 步骤(V)中所述的模块1、模块2、模块3、模块4、模块5和筛选标记MET15共同转化菌株BY4741‑5后，5个模块和筛选标记通过酵母体内同源重组连接成完整的一条DNA片段，并
且由于两端(模块1和MET15)带有50bp特异性的同源臂，使得这个DNA片段可以整合到酵母
染色体的HIS3位点；同理，步骤(VI)中所述的块6和模块7通过同源重组原理整合到菌株
BY4741‑5的染色体Gal7位点；步骤(4)中所述的模块8、模块9和模块10通过同源重组原理整
合到菌株BY4741‑7的染色体NDT80位点；步骤(5)中所述的模块8、模块9和模块10通过酵母
体内同源重组整合到菌株BA‑1的染色体Gal80位点。

[0091] 所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌在制备羽扇豆醇、桦木醇和/或桦木酸中的应用。

[0092] 一种桦木酸的制备方法，为将所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到桦木酸；具体包括如下步骤：将所述的高产桦木酸的酿
酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，待溶氧值达到60％时补加补料
培养基，使培养基内葡萄糖的含量维持在5g/L，得到桦木酸。

[0093] 所述的活化为多级活化；其通过如下步骤实现：将所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的单菌落接种到100mL摇瓶中，220～250rpm、30℃条件下培养10～24h；然后将培养
得到的菌液接种到1L摇瓶中220～250rpm、30℃条件下培养36～48h。

[0094] 所述的发酵培养基的组成如下：发酵培养基组成包括：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O 0.72g/L，维他命溶液12mL/L，微量金属盐溶液10mL/L，25g/
L葡萄糖；其中：

[0095] 维他命溶液的组成包括：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L；

[0096] 微量金属盐溶液组成如下：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，
CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。

[0097] 所述的补料培养基组成如下：微量金属盐溶液10mL/L，维他命溶液12mL/L，KH2PO4 9g/L，MgSO4 2.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖585g/L；其中：

[0098] 微量金属盐溶液组成如下：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，
CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L；

[0099] 维他命溶液的组成如下：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。

[0100] 所述的接种高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的接种量为0.01％～20％(v/v)。

[0101] 所述的发酵培养的条件为：发酵温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值30％，搅拌速度300～1000rpm，通气量3～20L/min，发酵时间24～168h；优选为：发酵温度30℃，pH值5，溶氧
值30％，搅拌速度300～1000rpm，通气量3～20L/min，发酵时间120～144h。

[0102] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过优化MVA途径各步骤基因，调节NADPH代谢，敲除旁路基因，同时选择对羽扇豆醇具有高度特异性氧化功能的
P450酶CYP716A155，成功构建了高产桦木酸的酿酒酵母工程菌株BA‑1、BA‑2，具体为通过过
表达ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、tHMG1、IDI1、UPC2‑1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、GDH2、
GDH、AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因构建得到，利
用酿酒酵母工程菌株BA‑2通过五天发酵培养，其桦木酸的产量可以达到1.5g/L，远高于原
植物中桦木酸的含量，因此可以有效的解决药源问题，从而节省植物资源，保护环境。

附图说明

[0103] 图1是桦木酸在酵母内的生物合成途径图。

[0104] 图2是BA‑2菌株发酵产物和桦木酸标准品GC‑MS总离子流图。

[0105] 图3是桦木酸质谱图。

[0106] 图4是BA‑1菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体羽扇豆醇、桦木醇产量图。

[0107] 图5是BA‑2菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体羽扇豆醇、桦木醇产量图。

具体实施方式

[0108] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列
实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的
实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

[0109] 1、实施例中涉及的YPD培养基组成如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。

[0110] 2、实施例中涉及的酵母缺陷型培养基：SD‑URA、SD‑LEU、SD‑HIS、SD‑URA培养基的配方：YNB(YNB培养基)6.7g/L，缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L；其中，缺陷氨基酸
(100X)配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸
(HIS)0.12g，亮氨酸(LEU)0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸(MET)0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨
酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶(URA)0.12g，用
ddH2O定容到57mL，根据需要不加对应氨基酸配置成缺陷氨基酸母液(100X)，即如SD‑URA培
养基，则对应不添加尿嘧啶(URA)即可。固体培养基在配制时添加20g/L的琼脂粉即可。上述
原料均购买自Sigma‑Aldrich。

[0111] 实施例1酵母内源性基因、表达元件和枯草芽孢杆菌内GDH基因的克隆

[0112] 1、酵母基因组的提取

[0113] (1)取酿酒酵母BY4741(ATCC)单菌落于5mL YPD培养基中培养16～24h，菌液在离心机中4000rpm离心5min收集菌体放入研钵中。

[0114] (2)加入液氮研磨2～3次，待液氮挥干，加入1mL DNAiso Reagent(宝日医生物技术有限公司)覆盖菌体。

[0115] (3)静置待融化后，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状，将裂解液转移至离心管中。

[0116] (4)将装有裂解液的离心管在4℃或室温离心10min，将上清转移到新的离心管内，加入1/2体积的无水乙醇，反复颠倒2min，室温4000rpm离心沉淀DNA，去上清。

[0117] (5)缓慢加入1mL 75％(v/v)的乙醇，混匀，12000rpm离心5min，去上清，挥干残留乙醇。加入50μL ddH2O溶解，作为PCR克隆模板。

[0118] 2、PCR克隆酵母内源性基因和表达元件

[0119] PCR反应体系：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，上下游特异性引物各1μL(引物见表1)，ddH2O 6.1μl，模板1μL，总反应体系20
μL。

[0120] PCR扩增反应条件为：第一阶段95℃3min；第二阶段，95℃30s，50‑60℃30s，72℃1‑2min，30循环；第三阶段，72℃5min。

[0121] 以上述获得的酵母基因组为模板，按上述体系和条件，分别克隆如下9个基因、5个启动子和5个终止子：

[0122] ERG8(引物ERG8‑F、ERG8‑R)、ERG10(引物ERG10‑F、ERG10‑R)、tHMG1(引物tHMG1‑F、tHMG1‑R)、ERG12(引物ERG12‑F、ERG12‑R)、ERG13(引物ERG13‑F、ERG13‑R)、ERG19(引物
ERG19‑F、ERG19‑R)、IDI1(引物IDI1‑F、IDI1‑R)、UPC2(引物UPC2‑F、UPC2‑R)和GDH2(引物
GDH2‑F、GDH2‑R)基因；其中，ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、GDH2基因序列分别如
SEQ ID NO.6～12所示；

[0123] PPGK1(引物PPGK1‑F、PPGK1‑R)、PTEF1(引物PTEF1‑F、PTEF1‑R)、PTDH3(引物PTDH3‑F、PTDH3‑R)、PTDH2(引物PTDH2‑F、PTDH2‑R)和PTPI1(引物PTPI1‑F、PTPI1‑R)启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID 
NO.19～23所示；

[0124] TADH1(引物TADH1‑F、TADH1‑R)、TCYC1(引物TCYC1‑F、TCYC1‑R)、TTDH2(引物TTDH2‑F、TTDH2‑R)、TPYX212(引物TPYX212‑F、TPYX212‑R)和TFBA1(引物TFBA1‑F、TFBA1‑R)终止子，其核苷酸序列分别如
SEQ ID NO.24～28所示。

[0125] CYP716A155基因通过赛默飞世尔科技有限公司的GeneArtTM GeneOptimizerTM软件以酿酒酵母为宿主进行密码子优化，优化后的基因由苏州泓迅生物科技有限公司合成，
其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0126] 3、DNA片段胶回收

[0127] PCR反应结束后，向反应体系加入Loading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪紫外照射下将DNA片段切下来，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科
技有限公司)胶回收，具体操作过程见产品说明书。

[0128] 4、DNA片段连接pEASY‑Blunt载体并测序

[0129] DNA片段连接平末端pEASY‑Blunt载体(全式金生物技术有限公司)，转化DH5α菌株，具体操作见产品说明书。37℃培养14～16h后，挑选单菌落做菌落PCR。

[0130] PCR体系：M13通用引物‑F(引物见表1；10μM)0.3μL，M13通用引物‑R(引物见表1；10μM)0.3μL，Easy Taq聚合酶0.2μL，dNTPs(2.5mM)0.8μL，10x Easy Taq Buffer 1μL，DMSO
(二甲基亚砜)1μL，ddH2O 6.4μL。用枪头沾取部分菌落于PCR体系中混匀。

[0131] PCR扩增，扩增条件为：第一阶段95℃5min；第二阶段，95℃30s，55℃30s，72℃1‑3min，30循环；第三阶段，72℃7min。

[0132] 反应结束后，向反应体系加入Loading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪确定阳性转化子，将该菌落送样测序。

[0133] 5、UPC2定点突变得到UPC2‑1

[0134] UPC2是酵母合成萜类化合物的一个关键的转录因子基因，将UPC2基因的第888位的甘氨酸(Glycine)突变为天门冬氨酸(Aspartate)能进一步提高萜类化合物的含量。UPC2
定点突变得到的UPC2‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其具体步骤如下：

[0135] (1)以pEASY‑Blunt‑UPC2质粒(pEASY‑Blunt‑UPC2质粒由UPC2基因构建到pEASY‑Blunt载体上制备得到，参考实施例1中步骤4)为模板，稀释到1～10ng/μL为模板，扩增体系
为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP 0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，正向、反向引物
各1μL(引物见表1：上游引物UPC2‑1‑F和下游引物UPC2‑1‑R)，ddH2O 6.1μL，模板1μL，总反
应体系20μL。放入PCR仪中反应，反应条件为：第一阶段95℃3min；第二阶段，95℃30s，62℃
30s，72℃2min，30循环；第三阶段，72℃5min。

[0136] (2)将反应产物用DpnΙ酶在37℃下反应1h。然后取1μL加入50μL大肠杆菌DH5α内，用手指轻轻弹匀，冰浴20～30min。再将感受态细胞放入42℃水浴锅中热击60s，立即将其置
于冰浴中冷却2min。向感受态细胞中加入250μL NZY培养基(配方：Casein酪蛋白10g/L，氯
化钠10g/L，酵母提取物5g/L，无水硫酸镁1g/L，加去离子水定容至1L，pH值调至7.0，在121
℃条件下灭菌20min。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，在37℃，220rpm的恒温
振荡培养箱中抚育60min。将孵育好的感受态细胞在3000rpm条件下离心1min，去掉200μL上
清液，重悬菌体，取全部菌液进行涂板，在超净台内将菌液吹干，放入37℃恒温生化培养箱
中，倒置培养14～18h。

[0137] (3)通过菌落PCR挑选阳性转化子测序。

[0138] 6、枯草芽孢杆菌中GDH基因的克隆

[0139] 提取枯草芽孢杆菌基因组为模板克隆GDH基因(引物见表1：上游引物GDH‑F和下游引物GDH‑R)，方法参考实施例1中1、2、3和4，GDH基因的核苷酸序列SEQ ID NO.18所示。

[0140] 实施例2植物源基因的克隆

[0141] 1、RNA的提取

[0142] (1)用药勺取100mg样品(样品为拟南芥、迷迭香以及丹参，均可通过常规市售购买得到)加入到含有950μL Trizol和50μLβ‑巯基乙醇的EP管中，涡旋15s，在12000rpm，4℃条
件下离心10min。

[0143] (2)用移液枪吸取上清至含有200μL氯仿的EP管中，涡旋15s，在12000rpm，4℃条件下离心15min。

[0144] (3)用移液枪吸取上层清夜，转移至含有500μL异丙醇的EP管中，在室温条件下静置10min，在12000rpm，4℃条件下离心10min。

[0145] (4)离心完毕后，去掉上清液，在EP管中加入1mL现配的75％(v/v)乙醇溶液，用移液枪进行吹打，在7500rpm，4℃条件下离心5min，去掉上清，将EP管放在超净台中晾干3～
5min。

[0146] (5)取30μL的RNase‑Free H2O，加入到EP管中，用枪头吹打混匀，直至沉淀完全溶解。RNA样品用于下一步实验或保存于‑80℃备用。

[0147] 2、RNA反转录成cDNA，克隆目的基因

[0148] 采用Hiscript II Reverse Transcriptase试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)将RNA反转录成cDNA，具体操作见试剂盒说明书。

[0149] 以丹参cDNA为模板克隆SmFPPS基因(引物见表1：SmFPPS‑F和SmFPPS‑R)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示。

[0150] 以拟南芥cDNA为模板克隆AtLUP(引物见表1：AtLUP‑F和AtLUP‑R)、AtSQS1(引物见表1：AtSQS1‑F和AtSQS1‑R)和AtSQE2基因(引物见表1：AtSQE2‑F和AtSQE2‑R)基因，核苷酸
序列分别如SEQ ID NO.14～16所示。

[0151] 以迷迭香cDNA为模板克隆RoCPR1基因(引物见表1：RoCPR1‑F和RoCPR1‑R)基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17所示。

[0152] 具体克隆方法可参考实施例1中2、3和4。

[0153] 表1.本发明克隆基因和表达元件引物

[0154]

[0155]

[0156] 实施例3、CRISPR‑Cas9系统敲除酿酒酵母BY4741的LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因

[0157] 1、crRNA spacer核酸序列的设计和载体的构建

[0158] (1)通过对基因序列分析，根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，设计出靶位点序列，在PAM序列两端各取50bp碱基序列作为同源臂，左右两段同源臂之间相隔8bp碱基，且这8bp碱
基需包括PAM序列。同源臂用于修复双链DNA断裂，并造成目标基因的移码突变，具体的
crRNA spacer设计参考文献(Huimin Zhao et al,ACS Synth.Biol.2015,4,585‑594)。其
中，

[0159] LPP1、DPP1、GDH1基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.4所述；

[0160] PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.5所述；

[0161] crRNA spacer序列由苏州泓迅生物科技有限公司合成。

[0162] (2)将上述2个crRNA spacer序列分别通过BsaΙ(New England Biolabs)限制性内切酶酶切连接到pCRCT载体(武汉淼灵生物科技有限公司)上，得到pCRCT‑1载体和pCRCT‑2
载体。

[0163] 2、pCRCT载体转化酿酒酵母敲除目的基因

[0164] (1)将上述连接了crRNA spacer核酸序列的pCRCT‑1载体和pCRCT‑2载体依次利用TM
Zymo Research Frozen‑EZ Yeast Transformation II Kit 酵母转化试剂盒(上海懋康生
物科技有限公司)转化酿酒酵母BY4741，具体转化方法参照产品说明书。

[0165] (2)利用SD‑URA缺陷平板(配方：YNB6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)进行筛选，平板在30℃条件下
培养五天。

[0166] (3)挑选大的菌落通过菌落PCR挑选阳性转化子，取阳性转化子接于4mL SD‑URA培养基中，在30℃、220rpm条件下摇床培养。

[0167] (4)培养两天后取100μL菌液接于新鲜SD‑URA培养基中继续表达两天。

[0168] (5)将菌液稀释后涂于SD‑URA缺陷平板上，挑选单菌落摇菌两天，离心收集菌沉淀后DNAiso Reagent基因组提取试剂盒提取基因组。

[0169] (6)通过PCR克隆出目的基因，胶回收纯化之后进行测序，验证目的基因已经产生移码突变。

[0170] (7)将已经敲除目的基因的菌株用YPD培养基传代培养十天丢失pCRCT载体，构建菌株BY4741‑1。

[0171] 实施例4、模块的构建

[0172] 1、重叠PCR构建模块

[0173] 所有片段的连接均采用重叠PCR，通过三轮PCR将目的DNA片段连接成模块。具体步骤如下：

[0174] (1)所有需要连接的片段经过第一轮PCR克隆互相之间加上40～50bp的重叠区域，重叠区域碱基退火温度在60～70℃之间，模板为连接有目的DNA片段的pEASY‑Blunt载体。
PCR体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，
上下游引物各1μL(见表2)，ddH2O6.9μL，模板0.2μL，总反应体系20μL。PCR反应条件为：第一
阶段95℃3min，第二阶段，95℃30s，50‑60℃30s，72℃1‑4min，30循环，第三阶段，72℃5min。

[0175] (2)将需要重叠的DNA片段根据片段大小按照每100ng/1000bp加入第二轮PCR体系中，反应体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10
μL，DNA片段1～9.1μL，加ddH2O补齐到20μL。其中，第二轮PCR反应条件为：第一阶段95℃
3min；第二阶段，95℃30s，60‑70℃30s，72℃1‑4min，10循环；第三阶段，72℃5min。

[0176] (3)取第二轮PCR反应液作为第三轮PCR模板，第三轮PCR体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，上下游引物各1μL(引物为连
接成完整DNA片段上下游引物，见表2)，ddH2O 6.1μL，模板1μL，总反应体系20μL。其中，第三
轮PCR反应条件为：第一阶段95℃3min，第二阶段，95℃30s，50‑60℃30s，72℃1‑4min，30循
环，第三阶段，72℃5min。

[0177] (4)胶回收模块DNA片段,连接pEASY‑Blunt载体(全式金生物技术有限公司)测序。

[0178] 按上述步骤构建以下13个模块：

[0179] (a)将ERG8、PTDH2和TPYX212基因连接，构建模块PTDH2‑ERG8‑TPYX212，命名为模块1；其中，第一轮PCR克隆ERG8引物为1‑ERG8‑F、1‑ERG8‑R，克隆PTDH2引物为PTDH2‑F、1‑PTDH2‑R，克隆
TPYX212引物为1‑TPYX212‑F、TPYX212‑R；第三轮PCR引物为PTDH2‑F、TPYX212‑R。

[0180] (b)将ERG10、PPGK1和TADH1基因连接，构建成模块PPGK1‑ERG10‑TADH1，命名为模块2；其中，第一轮PCR克隆ERG10的引物为2‑ERG10‑F、2‑ERG10‑R，克隆PPGK1的引物为PPGK1‑F、2‑
PPGK1‑R，克隆TADH1的引物为2‑TADH1‑F、TADH1‑R；第三轮PCR引物为PPGK1‑F、TADH1‑R。

[0181] (c)将ERG12、PTDH3和TTDH2基因连接，构建模块PTDH3‑ERG12‑TTDH2，命名为模块3；其中，第一轮PCR克隆ERG12引物为3‑ERG12‑F、3‑ERG12‑R，克隆PTDH3引物为PTDH3‑F、3‑PTDH3‑R，
克隆TTDH2引物为3‑TTDH2‑F、TTDH2‑R；第三轮PCR引物为PTDH3‑F、TTDH2‑R。

[0182] (d)将ERG13、PTEF1和TCYC1基因连接，构建模块PTEF1‑ERG13‑TCYC1，命名为模块4；其中，第一轮PCR克隆ERG13引物为4‑ERG13‑F、4‑ERG13‑R，克隆PTEF1引物为PTEF1‑F、4‑PTEF1‑R，
克隆TCYC1引物为4‑TCYC1‑F、TCYC1‑R；第三轮PCR引物为PTEF1‑F、TCYC1‑R。

[0183] (e)将ERG19、PTPI1和TFBA1基因连接，构建模块PTPI1‑ERG19‑TFBA1，命名为模块5；其中，第一轮PCR克隆ERG19的引物为5‑ERG19‑F、5‑ERG19‑R，克隆PTPI1引物为PTPI1‑F、5‑PTPI1‑
R，克隆TFBA1的引物为5‑TFBA1‑F、TFBA1‑R；第三轮PCR引物为PTPI1‑F、TFBA1‑R。

[0184] (f)将AtSQS1、PTPI1和TFBA1基因连接，构建模块PTPI1‑AtSQS1‑TFBA1，命名为模块6；其中，第一轮PCR克隆AtSQS1的引物为6‑SQS1‑F、6‑SQS1‑R，克隆PTPI1的引物为PTPI1‑F、6‑PTPI1‑
R，克隆TFBA1的引物为6‑T‑FBA1‑F、TFBA1‑R；第三轮PCR引物为PTPI1‑F、TFBA1‑R。

[0185] (g)将AtSQE2、PPGK1和TADH1基因连接，构建模块PPGK1‑AtSQE2‑TADH1，命名为模块7；其中，第一轮PCR克隆AtSQE2的引物为7‑AtSQE2‑F、7‑AtSQE2‑R，克隆PPGK1的引物为PPGK1‑F、7‑
PPGK1‑R，克隆TADH1的引物为7‑TADH1‑F、TADH1‑R；第三轮PCR引物为PPGK1‑F、TADH1‑R。

[0186] (h)将AtLUP、PTEF1和TCYC1基因连接，构建模块PTEF1‑AtLUP‑TCYC1，命名为模块8；其中，第一轮PCR克隆AtLUP的引物为8‑AtLUP‑F、8‑AtLUP‑R，克隆PTEF1的引物为PTEF1‑F、8‑
PTEF1‑R，克隆TCYC1的引物为8‑TCYC1‑F、TCYC1‑R；第三轮PCR引物为PTEF1、TCYC1‑R。

[0187] (i)将CYP716A155、PPGK1和TADH1连接，构建模块PPGK1‑CYP716A155‑TADH1，命名为模块9；其中，第一轮PCR克隆CYP716A155的引物为9‑CYP716A155‑F、9‑CYP716A155‑R，克隆PPGK1
的引物为PPGK1‑F、9‑PPGK1‑R，克隆TADH1的引物为9‑TADH1‑F、TADH1‑R；第三轮PCR引物为PPGK1‑F、
TADH1‑R。

[0188] (j)将RoCPR1、PTEF1和TCYC1基因连接，构建模块PTEF1‑RoCPR1‑TCYC1，命名为模块10；其中，第一轮PCR克隆RoCPR1的引物为10‑RoCPR1‑F、10‑RoCPR1‑R，克隆PTEF1的引物为PTEF1‑
F、10‑PTEF1‑R，克隆TCYC1的引物为10‑TCYC1‑F、TCYC1‑R；第三轮PCR引物为PTEF1、TCYC1‑R。

[0189] (k)将tHMG1、PPGK1、PTEF1和UPC2‑1基因连接，构建模块tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1，命名为模块11；其中，第一轮PCR克隆tHMG1的引物为11‑tHMG1‑F、11‑tHMG1‑R，克隆PPGK1的引
物为11‑PPGK1‑F、11‑PPGK1‑F，克隆PTEF1的引物为11‑PTEF1‑F、11‑PTEF1‑R，克隆UPC2‑1的引物为
11‑UPC2‑1‑F、11‑UPC2‑1‑R。第三轮的PCR引物为11‑tHMG1‑F、11‑UPC2‑1‑R。

[0190] (l)将IDI1、SmFPPS、PPGK1和PTEF1基因连接，构建模块IDI1‑PPGK1‑PTEF1‑SmFPPS，命名为模块12；其中，第一轮PCR克隆IDI1的引物为12‑IDI1‑F、12‑IDI1‑R，克隆SmFPPS的引物为
12‑SmFPPS‑F，12‑SmFPPS‑R，克隆PPGK1的引物为12‑PPGK1‑F，11‑PPGK1‑R，克隆PTEF1的引物为
11‑PTEF1‑F、12‑PTEF1‑R；第三轮PCR引物为12‑IDI1‑F，12‑SmFPPS‑R。

[0191] (m)将GDH2、GDH、PTDH3和PTDH2基因连接，构建模块GDH2‑PTDH3‑PTDH2‑GDH，命名为模块13；其中，第一轮PCR克隆GDH2的引物为13‑GDH2‑F，13‑GDH2‑R，克隆GDH引物为13‑GDH‑F，
13‑GDH‑R，克隆PTDH3引物为13‑PTDH3‑F，13‑PTDH3‑R，克隆PTDH2的引物为13‑PTDH2‑F，13‑PTDH2‑R；
第三轮PCR的引物为13‑GDH2‑F，13‑GDH‑R。

[0192] 2、整合载体pCfB2875‑1、pCfB2798‑1和pCfB2989met15‑1的构建

[0193] (1)将pCfB2875载体(Addgene)用sfaΙ限制性内切酶线性化，酶切体系为：pCfB2875载体1μg，sfaΙ0.5μL，10x Fast Digest Green Buffer 2μL，加水补齐到20μL体
系。37℃酶切1h，胶回收线性化载体。

[0194] (2)将上述tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1模块从pEASY‑Blunt‑tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1(即上述tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1模块连接pEASY‑Blunt载体获得)上用sfaΙ内切酶切下
来，酶切体系如载体pCfB2875线性化酶切体系。

[0195] (3)将tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1模块通过T4连接酶插入载体pCfB2875的sfaΙ酶切位点，连接体系为：线性化的pCfB2875 20～100ng，tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1模块50～
500ng，T4DNA Ligase 0.5μL，10x T4DNA Ligase Buffer 1μL，加水补齐到10μL体系。

[0196] (4)16℃连接1h，将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得连接好的载体pCfB2875‑1。

[0197] (5)载体pCfB2798‑1(含有模块IDI1‑PPGK1‑PTEF1‑SmFPPS)和pCfB2989met15‑1(含有GDH2‑PTDH3‑PTDH2‑GDH)的构建方法如pCfB2875‑1。

[0198] 表2.构建模块引物

[0199]

[0200]

[0201]

[0202] 实施例5、模块整合酵母染色体构建工程酵母菌

[0203] 1、BY4741‑4菌株的构建

[0204] (1)用限制性内切酶NotΙ将包含TCYC1‑tHMG1‑PPGK1‑PTEF1‑UPC2‑1‑TADH1表达模块和筛选标记KIURA3的DNA整合片段从载体pCfB2875‑1(实施例4步骤2构建)切下来，其酶切体
系为：载体pCfB2875‑1 5～10μg，NotΙ限制性内切酶1～2μL，10x Fast Digest Green 
Buffer 5μL，加水补齐到50μL体系；37℃酶切2h，胶回收。

[0205] (2)取5μL(4～10μg)上述酶切下来的DNA整合片段用Frozen‑EZ  Yeast TM
Transformation II Kit 试剂盒转化酿酒酵母BY4741‑1(即将该模块整合到酵母BY4741‑1
染色体TY3位点)，用SD‑URA(配方：YNB6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄
糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)平板进行筛选，构建菌株BY4741‑2。

[0206] (3)在菌株BY4741‑2的基础上，通过NotΙ限制性核酸内切酶酶切载体pCfB2798‑1可获得包含TCYC1‑IDI1‑PPGK1‑PTEF1‑SmFPPS‑TADH1表达模块和筛选标记KILEU2的DNA整合片
段。

[0207] (4)将TCYC1‑IDI1‑PPGK1‑PTEF1‑SmFPPS‑TADH1表达模块整合到酵母(菌株BY4741‑2)染色体TY4位点，整合方法如上所述，筛选平板为SD‑LEU(配方：YNB 6.7g/L，LEU(亮氨酸)缺陷
氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，构建菌
株BY4741‑3。

[0208] (5)在菌株BY4741‑3的基础上，通过NotΙ限制性核酸内切酶酶切载体pCfB2989met15‑1获得包含TCYC1‑GDH2‑PTDH3‑PTDH2‑GDH‑TADH1表达模块和筛选标记MET15的
DNA整合片段。

[0209] (6)将TCYC1‑GDH2‑PTDH3‑PTDH2‑GDH‑TADH1表达模块整合到酵母(菌株BY4741‑3)染色体TY1Cons1位点，筛选平板为SD‑MET(配方：YNB 6.7g/L，MET(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100X)
10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)。构建菌株BY4741‑4。

[0210] 2、筛选标记的敲除

[0211] (1)将pSH65载体(武汉淼灵生物科技有限公司)用Frozen‑EZ  Yeast TM
Transformation II Kit 试剂盒转化BY4741‑4菌株，筛选平板为YPD+zeocin(100μg/mL)。

[0212] (2)挑选单菌落用YPG(配方：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖2g/L，半乳糖18g/L)+zeocin(博来霉素；100μg/mL)表达四天，通过划板稀释挑选单菌落，提取基因组，通
过PCR克隆出整合的DNA片段，通过测序找出三个筛选标记(KILEU2、KIURA3和MET15)均被敲
除的菌株。用YPD传代培养十天丢失pSH65质粒，得到菌株BY4741‑5。

[0213] 3、酵母菌株BY4741‑7的构建

[0214] (1)酵母体内多片段同源重组将模块1、模块2、模块3、模块4和模块5整合到BY4741‑5菌株染色体HIS3位点，按照“模块1‑模块2‑模块3‑模块4‑模块5‑MET15(MET15的核
苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)”的顺序，通过PCR给相
邻模块和筛选标记MET15加上50bp重叠区域用于酵母体内同源重组连接，同时在模块1的5'
端和MET15的3'端加上50bp同源臂用于整合HIS3位点(将这5个模块和筛选标记MET15一起
转化到酿酒酵母内会发生体内同源重组连接成完整的一条DNA片段，并且由于两端的模块1
和MET15带有50bp特异性的同源臂，使得这个DNA片段可以整合到酵母染色体的HIS3位点)。
其中，克隆模块1的引物为HIS3‑1‑F、HIS3‑1‑R，克隆模块2的引物为PPGK1‑F、HIS3‑2‑R，克隆
模块3引物为PTDH3‑F、HIS3‑3‑R，克隆模块4的引物为PTEF1‑F、HIS3‑4‑R，克隆模块5的引物为
PTPI1‑F、HIS3‑5‑R，克隆MET15的引物为HIS3‑MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)‑F、HIS3‑MET15‑
R。

[0215] (2)将6个片段用Frozen‑EZ Yeast Transformation II KitTM试剂盒转化菌株BY4741‑5，用SD‑MET平板筛选，30℃培养3～6天。

[0216] (3)挑选单菌落用YPD培养基摇菌，提取基因组PCR克隆出整合片段(方法参考实施例2)，对整合片段进行测序，挑选阳性菌株，得到菌株BY4741‑6。

[0217] (4)将模块6、模块7整合到BY4741‑5菌株染色体Gal7位点上，所用筛选标记为KILEU2(KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)，
所用的筛选平板是SD‑LEU，其中克隆模块6的引物为Gal7‑6‑F、Gal7‑6‑R，克隆模块7的引物
为PPGK1‑F、Gal7‑7‑R，克隆KILEU2的引物为HIS3‑MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)‑F、Gal7‑
KILEU2‑R。方法参考实施例5步骤3，构建菌株BY4741‑7。

[0218] 4、可合成桦木酸酿酒酵母工程菌株BA‑1的构建

[0219] 将模块8、模块9、模块10整合到BY4741‑7菌株染色体NDT80位点上，所用筛选标记HIS3(HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)，所用
的筛选平板是SD‑HIS(配方如下：YNB 6.7g/L，HIS(组氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄
糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，其中克隆模块8的引物为NDT80‑8‑
F、NDT80(GAL80)‑8‑R，克隆模块9的引物为PPGK1‑F、NDT80(GAL80)‑9‑R，克隆模块10的引物
为PTEF1‑F、NDT80(GAL80)‑10‑R，克隆HIS3的引物为HIS3‑MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)‑F、
NDT80‑HIS3‑R。克隆方法参考实施例5步骤3，构建菌株BA‑1。

[0220] 5、桦木酸高产酿酒酵母工程菌株BA‑2的构建

[0221] 利用KIURA3(KIURA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)筛选标记第二次将模块8、模块9、模块10整合到BA‑1菌株染色体Gal80位点上，
所用的筛选平板是SD‑URA，其中克隆模块8的引物为GAL80‑8‑F、NDT80(GAL80)‑8‑R，克隆模
块9的引物为PPGK1‑F、NDT80(GAL80)‑9‑R，克隆模块10的引物为PTEF1‑F、NDT80(GAL80)‑10‑R，
克隆KIURA3的引物为HIS3‑MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)‑F、GAL80‑KIURA3‑R。方法参考实
施例5步骤3(酵母菌株BY4741‑7的构建)，构建菌株BA‑2。

[0222] 表3.模块整合酵母染色体引物

[0223]

[0224]

[0225] 实施例6、发酵酵母菌株BA‑1、BA‑2生成桦木酸

[0226] 1、BA‑1、BA‑2菌株发酵培养

[0227] (1)分别挑选BA‑1、BA‑2菌株的单菌落于装有15mL YPD培养基的100mL摇瓶中，在摇床中培养10～24h至OD值2～3，温度设置为30℃转速220～250rpm。

[0228] (2)将菌液分别接到三个分别含有100mL发酵培养基的1L摇瓶中。在220～250rpm，30℃条件下培养36～48h至OD600 8～10。

[0229] (3)将上述300mL菌液都接到包含3L的发酵培养基的5L的发酵罐中。温度控制在30℃，用氨水控制PH维持在5.0，溶氧值控制30％，转速在300～1000rpm，通气量3～20L/min。

[0230] (4)待溶氧值达到60％时启动补料系统进行补料(即加入补料培养基)，使培养基内葡萄糖的含量维持在5g/L。发酵培养168h，得到发酵液。

[0231] 上述涉及的培养基的配方如下：

[0232] 发酵培养基组成包括：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O 0.72g/L，维他命溶液12mL/L，微量金属盐溶液10mL/L，25g/L葡萄糖；

[0233] 补料培养基组成包括：微量金属盐溶液10mL/L，维他命溶液12mL/L，KH2PO4 9g/L，MgSO4 2.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖585g/L；

[0234] 其中：

[0235] 维他命溶液的组成包括：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。

[0236] 微量金属盐溶液组成包括：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，
CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。

[0237] 2、产物的萃取与检测

[0238] 取上述发酵培养24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h获得的发酵液分别加等体积的乙酸乙酯超声1h，静置24h，取有机层于干净的液相小瓶中，用氮吹仪吹干，加入100μL硅
烷化试剂MSTFA，在80℃条件下进行衍生化，反应30min，进行GC‑MS检测；其中，所用的仪器
为安捷伦气质联用仪7890B‑5977B。检测方法：进样体积1uL，溶剂延时18min，载气为氦气，
流速为1mL/min。色谱柱：HP‑5MS。色谱条件：80℃，1min，以20℃/min程序升温到300℃，保持
15min。

[0239] 通过产物分析可知，BA‑1、BA‑2菌株发酵培养后均可以获得桦木酸，其中，桦木酸在酵母内的生物合成途径如图1所示；BA‑2菌株发酵产物和桦木酸标准品GC‑MS总离子流图
如图2所示；桦木酸质谱图如图3所示；BA‑1菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体化合物羽
扇豆醇(lupeol)、桦木醇(betulin)产量如图4所示，酿酒酵母工程菌株BA‑1通过六天发酵
培养，其桦木酸(BA)的产量可以达到0.36g/L。BA‑2菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体羽
扇豆醇(lupeol)、桦木醇(betulin)产量如图5所示，从图中可以看出，酿酒酵母工程菌株
BA‑2通过五天发酵培养，其桦木酸(BA)的产量可以达到1.5g/L。

[0240] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。