一种藤黄细球菌HMC01及其在不对称还原制备手性醇中的应用转让专利
申请号 : CN202010834125.X
文献号 : CN111778198B
文献日 : 2021-12-10
发明人 : 李军 , 杜文婷 , 施菁 , 樊淼樑
申请人 : 杭州医学院
摘要 :
本发明公开了一种藤黄细球菌(Micrococcus luteus)HMC01及其在不对称还原制备手性醇中的应用。所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017653。本发明还公开了该菌种在用于制备手性药物中间体(S)‑1‑氯‑2‑庚醇方面的应用，采用该菌种催化制备得到的光学纯(S)‑1‑氯‑2‑庚醇，具有立体选择性高、产物产率高等优点。本发明提供的方法反应步骤简单、反应条件温和、环境友好，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的ee值达99.9％，产率达90.0％以上。
权利要求 :
1.一种藤黄细球菌（Micrococcus luteus）HMC01，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC NO：M2017653；保藏时间为：2017年11月03日。
2.权利要求1所述的藤黄细球菌HMC01在不对称还原制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用以1‑氯‑2‑庚酮为底物，加入藤黄细球菌HMC01细胞在缓冲液中进行生物催化反应，反应结束后反应液经分离纯化得到(S)‑
1‑氯‑2‑庚醇；
所述底物的初始浓度为20～1000 mM。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述底物的初始浓度为
30～80 mM。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述底物的初始浓度为50～70 mM。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，生物反应催化后用等体积乙酸乙酯萃取，萃取后，取乙酸乙酯层液体，经旋转蒸发器蒸馏浓缩4.5‑5.5倍体积，然后加入硅胶混匀后，转移至层析柱中，以石油醚︰乙酸乙酯体积比7︰3为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，收集含产物的洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩蒸干，即得(S)‑1‑氯‑2‑庚醇纯品。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述藤黄细球菌HMC01细胞为经发酵的湿菌体细胞，所述湿菌体细胞的用量以干重计为15～70 g/L缓冲液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述湿菌体细胞的用量以干重计为40～70 g/L缓冲液。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述湿菌体细胞的制备方法如下：斜面培养：
斜面于30℃培养2 3 d，挑取平板培养基中的单菌落至斜面，4℃冰箱保存；斜面培养基~
配方：葡萄糖 20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨8 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，(NH4)2SO4 4.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0；
种子培养：
从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有100 mL种子培养基的200 mL摇瓶中，30℃，200 rpm培养24 h；种子培养基配方如下：葡萄糖 20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨8 g/L，K2HPO4
2.0 g/L，(NH4)2SO4 4.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，pH 7.0；
发酵培养：
以5 10%的接种量将种子液转接到装有100 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，30℃，200 ~
rpm培养48 h；发酵培养基配方同种子培养基。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物催化反应于25～40℃下，在pH为
6.0～8.0缓冲液中进行24～60 h。
11.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物催化反应在磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或Tris‑HCl缓冲液中进行。
12.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物催化反应在Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液中进行。
13.根据权利要求3‑12任一项所述的应用，其特征在于，在所述生物催化反应中，还包括辅助底物。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述辅助底物为糖类和/或醇类。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述辅助底物选自以下物质中的一种或多种：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甲醇、乙醇、异丙醇或甘油。
16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述辅助底物为异丙醇。
17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，当所述辅助底物为糖类时，辅助底物的添加量按质量计为10～200 g/L缓冲液；当所述辅助底物为醇类时，所述辅助底物的添加量按体积计为生物催化反应缓冲液体积的5～30%。
18.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，当所述辅助底物为糖类时，辅助底物的添加量按质量计为50～100 g/L缓冲液；当所述辅助底物为醇类时，所述辅助底物的添加量按体积计为生物催化反应缓冲液体积的10～20%。
说明书 :
一种藤黄细球菌HMC01及其在不对称还原制备手性醇中的
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种藤黄细球菌(Micrococcus luteus)HMC01及其在不对称还原制备手性醇中的应用。
背景技术
[0002] 肺动脉高压是一种肺动脉压力升高并超过一定临界值的血流动力学和病理生理状态，是一种恶性程度极高、预后极差的疾病，堪称“心血管疾病中的癌症”。瑞莫杜林(曲前
列尼尔)是美国UNITED Therapeutics公司研发的一款人工合成前列环素药品，可以促进血
管舒张，同时可抑制血小板的聚集，是罕见病肺动脉高压的有效治疗药。(S)‑1‑氯‑2‑庚醇
是合成瑞莫杜林的重要手性中间体，其化学结构式为：
列尼尔)是美国UNITED Therapeutics公司研发的一款人工合成前列环素药品，可以促进血
管舒张，同时可抑制血小板的聚集，是罕见病肺动脉高压的有效治疗药。(S)‑1‑氯‑2‑庚醇
是合成瑞莫杜林的重要手性中间体，其化学结构式为：
[0003]
[0004] 目前合成手性药物中间体主要有化学法和生物法。化学法合成手性药物时，反应步骤多，产物产率低，立体选择性低，需添加重金属催化剂，污染环境且分离难度大。生物催
化法则是利用酶或微生物全细胞来催化反应。酶催化不对称还原羰基化合物制备手性醇，
需添加辅酶，如NAD(P)H等，辅酶价格昂贵且化学性质不稳定，酶分离纯化步骤复杂。微生物
全细胞中不仅含有氧化还原酶，同时还含有辅酶，通过添加氢供体实现辅酶原位再生。因
此，采用微生物全细胞催化是不对称还原制备手性化合物的常用技术。
化法则是利用酶或微生物全细胞来催化反应。酶催化不对称还原羰基化合物制备手性醇，
需添加辅酶，如NAD(P)H等，辅酶价格昂贵且化学性质不稳定，酶分离纯化步骤复杂。微生物
全细胞中不仅含有氧化还原酶，同时还含有辅酶，通过添加氢供体实现辅酶原位再生。因
此，采用微生物全细胞催化是不对称还原制备手性化合物的常用技术。
[0005] 目前，尚未有通过微生物催化制备瑞莫杜林的手性中间体(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的相关报道。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种藤黄细球菌(Micrococcus luteus)HMC01及其在不对称催化还原制备手性醇中的应用。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 一种藤黄细球菌(Micrococcus luteus)HMC01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO：M2017653；保藏时间为：2017年11月03
日。
日。
[0010] 本发明还提供了所述藤黄细球菌HMC01在用于不对称还原1‑氯‑2‑庚酮制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇中的应用。
[0011] 在本发明的实施方案中，利用所述藤黄细球菌HMC01生物催化1‑氯‑2‑庚酮制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇反应式如下所示：
[0012]
[0013] 所述藤黄细球菌HMC01在用于不对称还原1‑氯‑2‑庚酮制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇中的应用包括以1‑氯‑2‑庚酮为底物，加入藤黄细球菌HMC01细胞在缓冲液中进行生物催化反
应，反应结束后反应液经分离纯化得到(S)‑1‑氯‑2‑庚醇；
应，反应结束后反应液经分离纯化得到(S)‑1‑氯‑2‑庚醇；
[0014] 所述底物的初始浓度为20～1000mM，优选30～80mM，优选50～70mM。
[0015] 在本发明的一个优选的实施方案中，在生物催化反应中，所述底物1‑氯‑2‑庚酮的初始浓度为30～80mM，包括但不限于：30mM、40mM、50mM、60mM、70mM或80mM。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，在生物催化反应中，所述藤黄细球菌HMC01细胞为经发酵的湿菌体细胞，所述湿菌体细胞的用量以干重计为15～70g/L缓冲液，优选40～70g/L
缓冲液，包括但不限于：40g/L、50g/L、60g/L或70g/L缓冲液。
缓冲液，包括但不限于：40g/L、50g/L、60g/L或70g/L缓冲液。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，所述生物催化反应在25～40℃的温度下进行，优选25～35℃，更优选在30℃的温度下进行。
[0018] 在本发明的一个具体实施方案中，所述生物催化反应在pH为6.0～8.0的缓冲液中进行，优选地，所述反应在Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液中进行，更优选地，所述反应在pH为7的
Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液中进行。
Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液中进行。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，所述生物催化反应的反应时间为24～60h，优选24～40h，更优选24h。
[0020] 在本发明的另一个实施方案中，在生物催化反应中，还包括辅助底物。辅酶再生效率是生物催化氧化还原反应的限速步骤，添加辅助底物是提高全细胞催化效率的有效办
法。在本发明的实施方案中，所述辅助底物可以糖类和/或醇类。优选地，所述辅助底物选自
以下的一种或多种：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甲醇、乙醇、异丙醇或甘油；更优选地，所述
辅助底物为以下三种中的任一种：异丙醇、甘油和乙醇。当所述辅助底物选自糖类时，优选
果糖；当所述底物选自糖类和醇类时，优选果糖和异丙醇。
法。在本发明的实施方案中，所述辅助底物可以糖类和/或醇类。优选地，所述辅助底物选自
以下的一种或多种：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甲醇、乙醇、异丙醇或甘油；更优选地，所述
辅助底物为以下三种中的任一种：异丙醇、甘油和乙醇。当所述辅助底物选自糖类时，优选
果糖；当所述底物选自糖类和醇类时，优选果糖和异丙醇。
[0021] 当所述辅助底物为糖类时，辅助底物的添加量按质量计为10～200g/L缓冲液，优选50～100g/L缓冲液，包括但不限于：50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L或100g/L缓冲液，
最优选50g/L缓冲液。当所述辅助底物为醇类时，辅助底物的添加量按体积计为生物催化反
应缓冲液体积的5～30％，优选10～20％，最优选10％。
最优选50g/L缓冲液。当所述辅助底物为醇类时，辅助底物的添加量按体积计为生物催化反
应缓冲液体积的5～30％，优选10～20％，最优选10％。
[0022] 所述生物催化反应在以异丙醇10％(v/v)为辅助底物时，所得产物的光学纯度和产率最高。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，所述Micrococcus luteus HMC01湿菌体细胞的制备方法为：将所述菌种接入发酵培养基，发酵培养后收集湿菌体细胞。
[0024] 在本发明的一个具体实施方案中，所述Micrococcus luteus HMC01湿菌体细胞的制备方法为：将Micrococcus luteus HMC01接种至发酵培养基，30℃、200rpm培养48h，发酵
液经离心、洗涤，得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度如下：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/
L，蛋白胨8g/L，K2HPO42.0g/L，(NH4)2SO4 4.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH 7.0。
液经离心、洗涤，得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度如下：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/
L，蛋白胨8g/L，K2HPO42.0g/L，(NH4)2SO4 4.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH 7.0。
[0025] 在本发明的一个具体实施方案中，在pH 7.0的磷酸缓冲液中加入上述湿菌体细胞制备方法所得的湿菌体细胞，所述湿菌体细胞浓度以干重计为60g/L，加入50mM底物1‑氯‑
2‑庚酮，10％(v/v)异丙醇作为辅助底物用以辅酶再生，pH 7.0，30℃，200rpm，24h。反应结
束后将反应液离心，取上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取三次，气相检测(S)‑1‑氯‑2‑庚醇
含量。
2‑庚酮，10％(v/v)异丙醇作为辅助底物用以辅酶再生，pH 7.0，30℃，200rpm，24h。反应结
束后将反应液离心，取上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取三次，气相检测(S)‑1‑氯‑2‑庚醇
含量。
[0026] 在本发明的一个实施方案中，所述藤黄细球菌HMC01的筛选方法为：从浙江省杭州市滨江区采集土样，将采集土样加到装有70mL富集培养基的250mL锥形瓶中，30℃，220rpm，
振荡培养6～7d，待培养液变混浊后，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养6
～7d，如此重复富集培养3～4次。富集培养基中以1‑氯‑2‑庚酮为唯一碳源。富集培养液经
梯度稀释，涂布到分离平板上，经多次分离培养后获得单菌落。挑取单菌落接种到种子培养
基，培养24h，再转接至产酶培养基中培养48h。以1‑氯‑2‑庚酮为底物，筛选得到的微生物全
细胞为催化剂，在磷酸缓冲液中生物转化24h后，采用手性气相色谱法检测转化液中目标产
物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的对映体过量值(ee值)，从中筛选得到所述的微生物新菌株—藤黄细
球菌HMC01(Micrococcus luteus HMC01)。
振荡培养6～7d，待培养液变混浊后，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养6
～7d，如此重复富集培养3～4次。富集培养基中以1‑氯‑2‑庚酮为唯一碳源。富集培养液经
梯度稀释，涂布到分离平板上，经多次分离培养后获得单菌落。挑取单菌落接种到种子培养
基，培养24h，再转接至产酶培养基中培养48h。以1‑氯‑2‑庚酮为底物，筛选得到的微生物全
细胞为催化剂，在磷酸缓冲液中生物转化24h后，采用手性气相色谱法检测转化液中目标产
物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的对映体过量值(ee值)，从中筛选得到所述的微生物新菌株—藤黄细
球菌HMC01(Micrococcus luteus HMC01)。
[0027] 本发明提供的微生物新菌种Micrococcus luteus HMC01，能够用于生物不对称还原1‑氯‑2‑庚酮制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇，采用该新菌种催化制备得到的光学纯(S)‑1‑氯‑2‑
庚醇，具有立体选择性高、产物产率高等优点。
庚醇，具有立体选择性高、产物产率高等优点。
[0028] 本发明提供的利用所述藤黄细球菌HMC01制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的方法，通过合理设计并优化生物催化反应的反应体系，当底物浓度、反应条件(包括反应温度、pH值以及反
应时间)以及湿菌体细胞的用量在合适的范围时，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的ee值达99.9％，
产率达90.0％以上。本发明提供的方法反应步骤简单、反应条件温和、环境友好。为研究生
物法制备治疗肺动脉高压药物关键手性中间体(S)‑1‑氯‑2‑庚醇提供参考，具有重要的应
用价值。
应时间)以及湿菌体细胞的用量在合适的范围时，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的ee值达99.9％，
产率达90.0％以上。本发明提供的方法反应步骤简单、反应条件温和、环境友好。为研究生
物法制备治疗肺动脉高压药物关键手性中间体(S)‑1‑氯‑2‑庚醇提供参考，具有重要的应
用价值。
[0029] 本发明的菌株是从浙江省杭州市滨江区采集的土样中分离筛选获得。
[0030] 该菌株的生物学特征为：菌落形态：30℃培养48h，菌落直径约为2mm，边缘整齐，圆形，隆起，菌落呈黄色。生理生化特征：革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，无荚膜。糖类(葡萄
糖、甘露糖、乳糖)发酵不产酸。
糖、甘露糖、乳糖)发酵不产酸。
[0031] 菌种的16S rDNA序列特性：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物P1和P2扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述
Micrococcus luteus HMC01的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
Micrococcus luteus HMC01的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0032] 该序列已提交GenBank(GenBank登录号为No.MH656700)，将HMC01菌株的16S rDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：
HMC01菌株与藤黄细球菌SSA‑1(Micrococcus luteus SSA‑1)(GenBank登录号为
No.KY486008.1)的序列同源性达100％。根据菌落的形态及生理生化特性并结合分子生物
学鉴定，该菌株被鉴定为藤黄细球菌(Micrococcus luteus)。
HMC01菌株与藤黄细球菌SSA‑1(Micrococcus luteus SSA‑1)(GenBank登录号为
No.KY486008.1)的序列同源性达100％。根据菌落的形态及生理生化特性并结合分子生物
学鉴定，该菌株被鉴定为藤黄细球菌(Micrococcus luteus)。
[0033] 本发明的菌株藤黄细球菌(Micrococcus luteus)HMC01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为：CCTCC M2017653。经保藏中心于2017年
11月20日检测为存活菌株并保藏。
11月20日检测为存活菌株并保藏。
附图说明
[0034] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0035] 图1为本发明实施例提供的底物1‑氯‑2‑庚酮和产物1‑氯‑2‑庚醇的标准品气相检测图谱；
[0036] 图2为Micrococcus luteus HMC01生物还原反应萃取液气相色谱图。
具体实施方式
[0037] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
[0038] 实施例1
[0039] Micrococcus luteus HMC01菌株的培养基和培养条件：
[0040] 通过响应面实验设计，得到Micrococcus luteus HMC01菌株的优化培养基组成为：葡萄糖5～20g/L，酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～20g/L，K2HPO41.0～5.0g/L，(NH4)2SO4 1.5
～5.0g/L，NaCl 1.5～5.0g/L。Micrococcus luteus HMC01的培养条件为：初始pH 6.0～
8.0，锥形瓶装液量90～110mL/250mL，培养温度30℃，摇床转速180～240rpm，接种量1～
10％，培养时间24～48h。
～5.0g/L，NaCl 1.5～5.0g/L。Micrococcus luteus HMC01的培养条件为：初始pH 6.0～
8.0，锥形瓶装液量90～110mL/250mL，培养温度30℃，摇床转速180～240rpm，接种量1～
10％，培养时间24～48h。
[0041] Micrococcus luteus HMC01菌种的筛选：
[0042] (1)富集培养：将从浙江省杭州市滨江区各采样地采集的土样接种到富集培养基中，置30℃，200rpm的摇床培养7d，待培养液变混浊后，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养
基中，继续培养7d，如此循环培养3次。富集培养基配方如下：1‑氯‑2‑庚酮30mM，(NH4)2SO4
5g/L，K2HPO4 4g/L，NaCl 2.5g/L，pH 7.0。
基中，继续培养7d，如此循环培养3次。富集培养基配方如下：1‑氯‑2‑庚酮30mM，(NH4)2SO4
5g/L，K2HPO4 4g/L，NaCl 2.5g/L，pH 7.0。
[0043] (2)平板培养：将最后一次富集培养液稀释后涂布于平板培养基上，平板培养基组成为富集培养基中加入20g/L琼脂。
[0044] (3)斜面培养：斜面培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨8g/L，K2HPO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 4.0g/L，NaCl 2.0g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。斜面于30℃培养2～3d，挑取
平板培养基中的单菌落至斜面，4℃冰箱保存。
平板培养基中的单菌落至斜面，4℃冰箱保存。
[0045] (4)种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有100mL种子培养基的200mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24h。种子培养基配方如下：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨
8g/L，K2HPO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 4.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH 7.0。
8g/L，K2HPO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 4.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH 7.0。
[0046] (5)发酵培养：发酵培养基配方同种子培养基。以5～10％的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养48h。
[0047] Micrococcus luteus HMC01菌种的鉴定：
[0048] 菌种的16S rDNA序列特性：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物P1和P2扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述
Micrococcus luteus HMC01的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
Micrococcus luteus HMC01的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0049] 该序列已提交GenBank(GenBank登录号为No.MH656700)，将HMC01菌株的16S rDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：
HMC01菌株与藤黄细球菌SSA‑1(Micrococcus luteus SSA‑1)(GenBank登录号为
No.KY486008.1)的序列同源性达100％。根据菌落的形态及生理生化特性并结合分子生物
学鉴定，该菌株被鉴定为藤黄细球菌(Micrococcus luteus)。
HMC01菌株与藤黄细球菌SSA‑1(Micrococcus luteus SSA‑1)(GenBank登录号为
No.KY486008.1)的序列同源性达100％。根据菌落的形态及生理生化特性并结合分子生物
学鉴定，该菌株被鉴定为藤黄细球菌(Micrococcus luteus)。
[0050] 湿菌体细胞的制备：
[0051] 种子液和发酵液培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨8g/L，K2HPO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 4.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH 7.0。
[0052] 从培养成熟的斜面挑一环单菌落接入装有100mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，200rpm振荡培养24h后得到种子液，以10％(v/v)的接种量将种子液转接到装有100mL发
酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，200rpm，48h。培养结束后发酵液经离心、磷酸缓冲液洗涤
收集得到湿菌体，备用。
酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，200rpm，48h。培养结束后发酵液经离心、磷酸缓冲液洗涤
收集得到湿菌体，备用。
[0053] 实施例2
[0054] 利用所述藤黄细球菌HMC01制备(S)‑1‑氯‑2‑庚醇(生物催化反应)：
[0055] 将实施例1所得的湿菌体细胞悬浮于20mL磷酸盐缓冲液Na2HPO4‑KH2PO4(pH 7.0)中，所述湿菌体细胞浓度以干重计为60g/L；加入50mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入10％
(v/v)异丙醇作为辅助底物用以辅酶再生，30℃，200rpm，反应24h。反应结束后将反应液离
心，取上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取，气相检测(S)‑1‑氯‑2‑庚醇含量。
(v/v)异丙醇作为辅助底物用以辅酶再生，30℃，200rpm，反应24h。反应结束后将反应液离
心，取上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取，气相检测(S)‑1‑氯‑2‑庚醇含量。
[0056] 产物浓度检测及其分离纯化方法：
[0057] 浓度检测：生物催化反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取。未反应的底物及萃取液中的产物可采用气相色谱分析(如图2)，图1示出的是底物1‑氯‑2‑庚酮和产物1‑氯‑
2‑庚醇的标准品气相检测图谱。未反应的底物及萃取液中的产物用内标法定量。内标物为
正十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷混合均匀后气相分析。气相色谱条件：美国安捷伦气
相色谱仪(Agilent GC‑7890A)；美国瓦里安CP‑Chirasil‑Dex CB手性毛细管气相色谱柱
(25m×0.25mm×0.25μm,df＝0.25)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比
为20:1；检测器和进样口温度均为250℃；柱温80℃保留1min，以8℃/min升温至150℃，维持
2min；检测器为FID。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓
度和ee值。
2‑庚醇的标准品气相检测图谱。未反应的底物及萃取液中的产物用内标法定量。内标物为
正十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷混合均匀后气相分析。气相色谱条件：美国安捷伦气
相色谱仪(Agilent GC‑7890A)；美国瓦里安CP‑Chirasil‑Dex CB手性毛细管气相色谱柱
(25m×0.25mm×0.25μm,df＝0.25)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比
为20:1；检测器和进样口温度均为250℃；柱温80℃保留1min，以8℃/min升温至150℃，维持
2min；检测器为FID。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓
度和ee值。
[0058] 产率计算方法为：
[0059] 内标法：以正十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。产率计算公式如下：
[0060]
[0061] 公式(1)中Cp为(S)‑1‑氯‑2‑庚醇浓度，C0为1‑氯‑2‑庚酮初始浓度。
[0062] 产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：
[0063]
[0064] 公式(2)中CS和CR分别为S型和R型1‑氯‑2‑庚醇的摩尔浓度。
[0065] 分离纯化：萃取后，取乙酸乙酯层液体，经旋转蒸发器蒸馏浓缩5倍体积，然后加入硅胶混匀后，转移至层析柱中，以石油醚︰乙酸乙酯＝7︰3(v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析分
离，收集含产物的洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩蒸干，即得(S)‑1‑氯‑2‑庚醇纯品。
离，收集含产物的洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩蒸干，即得(S)‑1‑氯‑2‑庚醇纯品。
[0066] 实施例2产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度为46.1mM；ee值为：99.9％。产率为：92.2％。
[0067] 实施例3～5：
[0068] 将实施例1所得的细胞悬浮于20mL不同pH值的磷酸盐缓冲液Na2HPO4‑KH2PO4中，细胞以干重计浓度为60g/L；加入50mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入10％(v/v)异丙醇作为
辅助底物，30℃，200rpm，反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚
醇的浓度和ee值见下表。实施例3～5的产率分别为：78.8％；92.2％；71.8％。
辅助底物，30℃，200rpm，反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚
醇的浓度和ee值见下表。实施例3～5的产率分别为：78.8％；92.2％；71.8％。
[0069]
[0070] 实施例6～8：
[0071] 将实施例1所得的细胞悬浮于20mL缓冲液(pH 7.0)中，细胞以干重计浓度为60g/L；加入50mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入10％(v/v)异丙醇作为辅助底物，30℃，200rpm，
反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值见下表。
实施例6～8的产率分别为61.2％；73.4％；92.2％。
反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值见下表。
实施例6～8的产率分别为61.2％；73.4％；92.2％。
[0072]
[0073] 实施例9～11：
[0074] 将实施例1所得的细胞悬浮于20mL Na2HPO4‑KH2PO4(pH 7.0)中，细胞以干重计浓度为60g/L；加入50mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入10％(v/v)异丙醇作为辅助底物，在不
同温度下，200rpm，24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和
ee值见下表。实施例9～11的产率分别为70.8％；92.2％；81.6％。
同温度下，200rpm，24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和
ee值见下表。实施例9～11的产率分别为70.8％；92.2％；81.6％。
[0075]
[0076] 实施例12～14：
[0077] 将实施例1所得的不同重量(以干重计)细胞悬浮于20mL Na2HPO4‑KH2PO4(pH 7.0)中，加入50mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入10％(v/v)异丙醇作为辅助底物，30℃，200rpm
的摇床中反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值
见下表。实施例12～14的产率分别为68.8％；92.2％；74.4％。
的摇床中反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值
见下表。实施例12～14的产率分别为68.8％；92.2％；74.4％。
[0078]
[0079] 实施例15～23：
[0080] 将实施例1所得的细胞悬浮于20mL Na2HPO4‑KH2PO4(pH 7.0)中，细胞以干重计浓度为60g/L；加入50mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入质量浓度不同的糖类或者不同体积比
的醇类作为辅助底物，30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，
产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值见下表。实施例15～23的产率分别为22.4％；16.6％；
29.4％；13％；39％；13.8％；44.6％；92.2％；16.8％。
的醇类作为辅助底物，30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，
产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值见下表。实施例15～23的产率分别为22.4％；16.6％；
29.4％；13％；39％；13.8％；44.6％；92.2％；16.8％。
[0081]
[0082] 实施例24～26：
[0083] 将实施例1所得的细胞悬浮于20mL Na2HPO4‑KH2PO4(pH 7.0)中，细胞以干重计浓度为60g/L；加入不同浓度的1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入10％(v/v)异丙醇作为辅助底
物，30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚
醇的浓度和ee值见下表。
物，30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例2的产物浓度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚
醇的浓度和ee值见下表。
[0084] 实施例24～26的产率分别为57.8％；92.2％；74.8％。
[0085]
[0086] 实施例27
[0087] 将实施例1所得的湿菌体细胞悬浮于20mL磷酸盐缓冲液Na2HPO4‑KH2PO4(pH 7.0)中，所述湿菌体细胞浓度以干重计为60g/L；加入1000mM 1‑氯‑2‑庚酮作为底物，再加入
10％(v/v)异丙醇作为辅助底物用以辅酶再生，30℃，200rpm，反应60h。用实施例2的产物浓
度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值见下表。实施例27的产率为54.5％。
10％(v/v)异丙醇作为辅助底物用以辅酶再生，30℃，200rpm，反应60h。用实施例2的产物浓
度检测方法，产物(S)‑1‑氯‑2‑庚醇的浓度和ee值见下表。实施例27的产率为54.5％。
[0088]
[0089] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。