一种早熟基因eam.z及其分子标记SNP595和应用

摘要

本发明公开了一种早熟基因eam.z及其分子标记SNP595和应用，由野生型大麦基因HORVU3Hr1G114970编码区595bp处的碱基由A变为T得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还提供了基于eam.z基因突变位点的分子标记SNP595，选自SEQ ID NO.5～7所示的引物对。利用该标记进行eam.z基因的早熟育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦早熟育种进度。

权利要求

1.一种早熟基因eam.z的分子标记SNP594，其特征在于，所述的早熟基因eam.z的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记SNP594在所述早熟基因eam.z的编码区594bp处的碱基为A或T。

2.一种早熟基因eam.z编码的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.用于鉴定权利要求1所述早熟基因eam.z的分子标记SNP594的引物组，其特征在于，所述的引物组由SEQ ID NO.5 6所示的正向引物和SEQ ID NO.7所示的反向引物组成。

~

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.5 6所示的正~

向引物前分别设置有荧光接头，分别对应ALLELE1和ALLELE2。

5.一种鉴定早熟基因eam.z的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测样品基因组 DNA；

2）利用权利要求3所述引物组对基因组DNA进行PCR扩增；

3）根据PCR产物荧光信号的差异，鉴别出每个待测样品的基因型。

6.权利要求1所述早熟基因eam.z的分子标记SNP594和权利要求3所述的引物组在大麦早熟品种辅助育种中的应用。

说明书

一种早熟基因eam.z及其分子标记SNP595和应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种早熟基因eam.z及其分子标记SNP595和应用。

背景技术

[0002] 我国人多地少，为了提高土地利用效率，增加作物产量，全国各地普遍推行了多熟制，而多熟制收种间隙短，茬口矛盾突出，如果品种晚熟更会加剧这一矛盾，造成复种作物
的恶性循环。因此选育早熟大麦品种，对于充分利用光热资源、提高复种指数具有重要意义
(孙东发等，2006)。另外，我国种植的主要是冬大麦，在大麦生长发育后期，时常受干热风的
影响，造成高温逼熟，导致大麦品质和产量明显下降；许多后期病害(如赤霉病)发生和流行
都需要高温、高湿条件，而大麦晚熟则会有利于这些病害的发生(陈秀兰等，2000)。因此，选
育早熟大麦品种也能够避免自然灾害或减轻受害程度。

[0003] 研究表明大麦由营养生长转向生殖生长主要受3个内在因素控制，即春化基因、光周期基因和早熟基因(Hay et al.,1998)。目前报道的已定位的大麦早熟基因有eam5、
eam6、eam7、eam8、eam9和eam10，它们分别位于大麦染色体5HL、2HS、6HS、1HL、4HL和3HL上
(Franckowiak,1997；Lundqvist,et al.,1997)。然而，只有eam5(Pankin et al.2012)，
eam8(Faure et al.2012)和eam10(Campoli et al.2012)被克隆，它们都是生物钟调节基
因，但是提早大麦开花期的时间各不相同，其中含有eam10的大麦品种Bowman开花期比其野
生型对照只提早了4‑5天。

发明内容

[0004] 本发明克隆到了一个大麦早熟基因，并针对该基因提供了一种与早熟性状关联的分子标记SNP595，可以鉴定大麦中是否含有eam.z早熟基因。利用该标记进行eam.z基因的
早熟育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦早熟育种进度。

[0005] 为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

[0006] 一种早熟基因eam.z，由野生型大麦基因HORVU3Hr1G114970编码区595bp处的碱基由A变为T得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该早熟基因eam.z可控制大麦早熟性状。

[0007] 本发明还提供了所述早熟基因eam.z编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0008] 在本发明的另一方面，还提供了基于eam.z基因突变位点的分子标记SNP595，所述的分子标记SNP595选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′：

[0009] 正向引物为：

[0010] GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAGTCGGCGGGGGAGA；

[0011] 和

[0012] GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAGTCGGCGGGGGAGT。

[0013] 反向引物为：

[0014] GCTGCACAAGCGGTTCGT。

[0015] 注：带下划线为街头引物。

[0016] 本发明2个正向引物前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色)，分别对应ALLELE1和ALLELE2。

[0017] 在本发明的另一方面，提供了一种鉴定早熟基因eam.z的方法，包括以下步骤：

[0018] 1)提取待测样品基因组DNA；

[0019] 2)利用分子标记SNP595对基因组DNA进行PCR扩增；

[0020] 3)根据PCR产物荧光信号的差异，鉴别出每个待测样品的基因型。

[0021] 其中，PCR反应体系为5μL：1μL基因组DNA，0.1μL引物(2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物浓度为30pmol/L)，1.4μL灭菌水和2.5μL KASP Buffer。

[0022] PCR反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。

[0023] 在本发明的另一方面，所述的早熟基因eam.z和分子标记SNP595在大麦早熟品种辅助育种中的应用也在本发明的保护范围之内。

[0024] 本发明的有益效果为：

[0025] 1)本发明所获得的基因标记是根据基因内部碱基突变设计的，因此不存在遗传交换，也不需要表型的进一步验证。

[0026] 2)本发明设计的分子标记直接利用采集的荧光信号进行基因分型，无需电泳、染胶、读带等过程，可以简单快速，高通量的鉴别大麦种质资源中是否含有eam.z基因。

[0027] 3)利用本发明方法进行分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品种的选择效率。

附图说明

[0028] 图1为eam.z基因结构及其与野生型的差异位点和突变位点附近氨基酸序列比对；A为突变位点；B为突变位点附近编码的氨基酸序列；

[0029] 图2突变体浙早麦1号和其野生型花30田间对比图；

[0030] 图3为利用本发明设计的KASPar标记SNP595鉴定浙早麦1号/浙皮8号F2分离群体中单株的eam.z基因型；左上角为突变型(在彩色图中显示为红色，a)，右下角的为野生型
(在彩色图中显示为蓝色，c)，中间的为杂合型(在彩色图中显示为绿色，b)，为阴性对照(在
彩色图中显示为黑色)。

具体实施方式

[0031] 下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实
施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属
于本发明保护的范围。

[0032] 实施例1分子标记SNP595

[0033] 1)本发明使用化学诱变剂EMS处理大麦品种花30，经过多代筛选鉴定获得了一个性状稳定的早熟突变体浙早麦1号，通过基因定位等方法克隆了早熟基因eam.z，研究发现
eam.z基因是由于其野生型大麦基因HORVU3Hr1G114970编码区595bp处的碱基由A变为T，形
成一个终止密码子TAG，从而导致编码的蛋白提前终止，产生早熟的表型，该突变位点不同
于以前报道的大麦早熟基因突变位点(图1)。利用该突变位点本发明设计了一个KASPar标
记能够快速准确的检测大麦材料中是否含由eam.z突变基因。

[0034] 早熟突变体浙早麦1号的表型为：开花期比野生型花30提早22‑25天，成熟期提早9‑14天；株高在53.1‑60.3cm，比野生型花30降低29.1‑34.9％。图2左侧为突变体浙早麦1
号，右侧为野生型花30，图中浙早麦1号和花30为同期播种材料，生长相同时间后，浙早麦1
号已进入生殖生长阶段(已抽穗)，而花30还处于营养生长阶段。

[0035] 突变体浙早麦1号采用EMS诱变方式获得：使用0.03mol/L EMS处理啤酒大麦品种花30，从1710个单株M2代中根据表型观察，获得了一个早熟突变体，经过多代观测，发现其
早熟性状稳定遗传，我们将其命名为浙早麦1号。和其野生型花30相比其外在表现为：开花
期和成熟期明显提早，株高降低。

[0036] 从该突变体浙早麦1号克隆到控制早熟性状的基因eam.z，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。该早熟基因eam.z编码的蛋白质具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列。

[0037] 野生型花30HORVU3Hr1G114970基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，其编码的蛋白质具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

[0038] 2)早熟基因eam.z分子标记的获得：根据序列比对结果，发现基因eam.z在突变体浙早麦1号和其野生型花30间存在一个碱基突变，使用Premier5软件结合这个单碱基突变
位点设计KASPar标记，命名为SNP595。

[0039] 正向引物为：

[0040] 花30allel‑1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAGTCGGCGGGGGAGA；

[0041] 浙早麦1号allel‑2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAGTCGGCGGGGGAGT；

[0042] 反向引物(共同反向引物)为：GCTGCACAAGCGGTTCGT。

[0043] 其中带下划线为街头引物。

[0044] 实施例2分子标记鉴定eam.z基因型

[0045] 使用分子标记鉴定eam.z基因型的方法：

[0046] 1)DNA提取：取大麦叶片100mg，使用CTAB法提取DNA，具体步骤如下：

[0047] ①剪叶片于液氮中研磨后装入1.5ml离心管中，每管加CTAB600μL于65℃温水浴50‑60min(每隔10min取出轻摇)；

[0048] ②加氯仿/异戊醇(24：1)600微升充分混匀15min，动作缓慢，两两称重，平衡后离心9600转，10min，4℃离心；

[0049] ③吸取上清液至另一1.5ml新离心管，加2倍体积的无水乙醇轻微混匀(置‑20℃冰箱30‑60min沉淀)；

[0050] ④用枪头挑出沉淀，置1.5ml离心管中，用70％乙醇洗2遍风干；

[0051] ⑤加100μL超纯水，4℃冰箱溶解(母液)母液：工作液＝1:20。

[0052] 2)KASParPCR反应及结果分析

[0053] KASPar PCR反应体系为：1μL基因组DNA(浓度为100ng/μL)，0.1μL引物(2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物(共同引物)浓度为30pmol/L)，1.4μL灭菌水和2.5μL KASP 
Buffer，反应总量为5μL。PCR反应在ABI ViiA7荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95℃
15min；94℃变性20s，61℃(‑0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火
60s，26个循环。

[0054] KASP Buffer为购自LGC公司的KASP Master mix试剂盒；‑0.6℃/循环代表每个循环减0.6℃。

[0055] 2个正向引物前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色)，分别对应ALLELE1和ALLELE2，如果检测的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例
如，花30野生型只能与“花30allele‑1”发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是
allel1/allel1还是allel2/allele2，如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个引物都会被
用到，产生的荧光不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合的基因型。

[0056] 荧光分析仪自动形成的图中，红色圆圈代表纯合基因型ALLEL1/ALLEL1，蓝色圆圈代表纯合基因型ALLEL2/ALLEL2，绿色圆圈代表杂合ALLEL1/ALLEL2。

[0057] 使用LGC Genomics SNPLine实验平台获得分析结果，所得结果如图3，即软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合野生型，纯合突变型和杂合型。

[0058] 荧光分析仪当出现同突变体eam.z同样颜色(a)的圆点时，表示圆点对应的材料基因型同eam.z，是纯合突变型；当出现同野生型花30同样颜色(c)的圆点时，表示圆点对应材
料的基因型同花30，是纯合野生型；当出现绿色圆点(b)时，表示圆点对应材料的基因型是
杂合型的。另外结果显示界面的左侧还会出现每种颜色的碱基类型，以区分不同基因型。

[0059] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和
变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。