β-葡聚糖的制备工艺

摘要

本发明公开了一种β‑葡聚糖的制备工艺，先进行菌种筛选，准备若干株菌种，并利用刚果红琼脂染色法对其定性检测，检测各个菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，筛选较高酶活的菌种作为待培养菌种。再对菌种进行培养，先通过斜面种子培养7‑8d，再接种至平板培养基进行培养，其中平板培养基各组分包括葡萄糖28‑30g/L、磷酸二氢钾1‑2g/L、酵母浸膏6‑10g/L、琼脂18‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、氯化铵2‑3g/L。本申请公开了一种β‑葡聚糖的制备工艺，工艺设计合理，操作简单，本申请通过对裂褶菌发酵、分离提纯，并优化改进各个参数步骤，制备得到β‑葡聚糖，该产物水溶性好、生物活性高，且产品的粗糖得率、保留率和纯度较高，可应用于大规模生产，成本低，具有较高的实用性。

权利要求

1.一种β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：

1)菌种筛选：准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养的裂褶菌菌种，备用；

2)菌种培养；取待培养菌种，斜面种子培养7‑8d，培养温度为26‑28℃，再接种于平板培养基中，25‑30℃下培养7‑8d，得到种子液；

3)发酵：取种子液，置于发酵罐中发酵7‑8d，得到发酵液；

4)粗提脱色：发酵液进行γ射线辐照，辐照后静置，接着进行高压均质，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加水后置于‑15℃下冻结，25‑28℃水浴下解冻，重复冻融操作2‑3次，进行微波提取，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9‑10h，处理温度为20‑28℃，得到脱色液；

5)脱蛋白：取脱色液，加入聚酰胺粉末，25‑28℃下振荡2‑2.5h，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

2.根据权利要求1所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：

1)菌种筛选：准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养的裂褶菌菌种，备用；

2)菌种培养；取待培养菌种，斜面种子培养7‑8d，培养温度为26‑28℃，再接种于平板培养基中，25‑30℃、170‑180r/min条件下培养7‑8d，得到种子液；

3)发酵：取种子液，置于发酵罐中发酵7‑8d，搅拌转速100‑300r/min，得到发酵液；

4)粗提脱色：发酵液进行γ射线辐照，辐照后静置10‑15min，接着进行高压均质，高压均质压力为65‑70MPa，均质时间为25‑30min，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加1‑2倍量的水，置于‑15℃下冻结3‑4h，25‑28℃水浴下解冻0.5‑1h，重复冻融操作2‑3次，进行微波提取，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9‑10h，转速为120‑150r/min，处理温度为20‑28℃，得到脱色液；

5)脱蛋白：取脱色液，加入聚酰胺粉末，25‑28℃下振荡2‑2.5h，振荡频率为100‑150r/min，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

3.根据权利要求2所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：步骤4）中，单位体积的微波提取功率为3‑4W/ml，提取时间为8‑10min，料水比为1：20。

4.根据权利要求2所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：步骤4）中，辐照源为60Co，源强度为200‑210kCi，辐照剂量为700‑800KGy。

5.根据权利要求2所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：步骤3）中，发酵3‑4d后发酵罐中依次加入淀粉脱支酶和糖化酶，温度为28‑32℃的条件下进行酶解。

6.根据权利要求2所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：步骤3）中，发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉15‑25g/L、改性玉米粉3‑6g/L、葡萄糖15‑20g/L、柠檬酸2‑3g/L、维生素0.1‑0.3g/L、滑石粉1‑1.5g/L、透明质酸0.1‑0.3g/L、琼脂15‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、牛肉膏4‑5g/L。

7.根据权利要求6所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：所述改性玉米粉的制备步骤为：取非晶化玉米淀粉、水混合搅拌，制得淀粉乳，再将淀粉乳缓慢滴加至环己烷、三氯甲烷混合液中，接着加入乳化剂、交联剂和引发剂，在50‑55℃下反应1‑3h，得到改性玉米粉；

所述乳化剂为司盘‑60，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠混合物，所述交联剂为N，N‑亚甲基双丙烯酰胺。

8.根据权利要求2所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：步骤2）中，所述平板培养基各组分包括：葡萄糖28‑30g/L、磷酸二氢钾1‑2g/L、酵母浸膏6‑10g/L、琼脂18‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、氯化铵2‑3g/L。

9.根据权利要求2所述的β‑葡聚糖的制备工艺，其特征在于：步骤4）中，大孔树脂脱色前需要进行洗涤，具体步骤为：取大孔树脂，蒸馏水清洗3‑4次，每次3‑5min，再置于氢氧化钠溶液中浸泡3‑4h，蒸馏水洗涤至中性，接着置于盐酸溶液中浸泡3‑4h，蒸馏水洗涤至中性，再置于氢氧化钠溶液中浸泡4‑5h，蒸馏水洗涤至pH为8‑8.5。

说明书

β‑葡聚糖的制备工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及β‑葡聚糖制备技术领域，具体是一种β‑葡聚糖的制备工艺。

背景技术

[0002] 葡聚糖，指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，葡萄糖单元之间以糖苷键连接，其中根据糖苷键的类型又可分为alpha‑葡聚糖和beta‑葡聚糖。

[0003] beta‑葡聚糖(β‑葡聚糖)活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它们大多数通过β‑1,3结合，这是葡萄糖链连接的方式。它能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，因此能提
高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统；同时β‑葡聚糖还具
有清除游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症等作用，可广泛用于医药、食品、化妆品
等领域。

[0004] 现如今，β‑葡聚糖的生产已经步入规模化，但现有的生产工艺制备得到成品的纯度较低，生产过程中脱色、脱蛋白步骤损耗较大，使用效果差。

[0005] 针对该问题，我们提供一种β‑葡聚糖的制备工艺，以解决该问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种β‑葡聚糖的制备工艺，以解决现有技术中的问题。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0008] 一种β‑葡聚糖的制备工艺，包括以下步骤：

[0009] 1)菌种筛选；

[0010] 2)菌种培养；

[0011] 3)发酵；

[0012] 4)粗提脱色；

[0013] 5)脱蛋白；

[0014] 6)得到β‑葡聚糖成品。

[0015] 较优化的方案，包括以下步骤：

[0016] 1)菌种筛选，得到待培养菌种；

[0017] 2)菌种培养；取待培养菌种，斜面种子培养7‑8d，培养温度为26‑28℃，再接种于平板培养基中，25‑30℃下培养7‑8d，得到种子液；

[0018] 3)发酵：取种子液，置于发酵罐中发酵7‑8d，得到发酵液；

[0019] 4)粗提脱色：发酵液进行γ射线辐照，辐照后静置，接着进行高压均质，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加水后置于‑15℃下冻结3‑4h，25‑28℃水浴
下解冻0.5‑1h，重复冻融操作2‑3次，进行微波提取，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高
压均质粗提液合并，脱盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9‑10h，转速为120‑150r/min，
处理温度为20‑28℃，得到脱色液；

[0020] 5)脱蛋白：取脱色液，加入聚酰胺粉末，25‑28℃下振荡2‑2.5h，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

[0021] 较优化的方案，包括以下步骤：

[0022] 1)菌种筛选：准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养菌种，备用；

[0023] 2)菌种培养；取待培养菌种，斜面种子培养7‑8d，培养温度为26‑28℃，再接种于平板培养基中，25‑30℃、170‑180r/min条件下培养7‑8d，得到种子液；

[0024] 3)发酵：取种子液，置于发酵罐中发酵7‑8d，搅拌转速100‑300r/min，得到发酵液；

[0025] 4)粗提脱色：发酵液进行γ射线辐照，辐照后静置10‑15min，接着进行高压均质，高压均质压力为65‑70MPa，均质时间为25‑30min，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗
提液，沉淀部分加1‑2倍量的水，置于‑15℃下冻结3‑4h，25‑28℃水浴下解冻0.5‑1h，重复冻
融操作2‑3次，进行微波提取，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱
盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9‑10h，转速为120‑150r/min，处理温度为20‑28℃，得
到脱色液；

[0026] 5)脱蛋白：取脱色液，加入聚酰胺粉末，25‑28℃下振荡2‑2.5h，振荡频率为100‑150r/min，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

[0027] 较优化的方案，步骤4)中，单位体积的微波提取功率为3‑4W/ml，提取时间为8‑10min，料水比为1：20。

[0028] 较优化的方案，步骤4)中，辐照源为60Co，源强度为200‑210kCi，辐照剂量为700‑800KGy。

[0029] 较优化的方案，步骤3)中，发酵3‑4d后发酵罐中依次加入淀粉脱支酶和糖化酶，温度为28‑32℃的条件下进行酶解。

[0030] 较优化的方案，步骤3)中，发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉15‑25g/L、改性玉米粉3‑6g/L、葡萄糖15‑20g/L、柠檬酸2‑3g/L、维生素0.1‑0.3g/L、滑石粉1‑1.5g/L、透明质
酸0.1‑0.3g/L、琼脂15‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、牛肉膏4‑5g/L。

[0031] 较优化的方案，所述改性玉米粉的制备步骤为：取非晶化玉米淀粉、水混合搅拌，制得淀粉乳，再将淀粉乳缓慢滴加至环己烷、三氯甲烷混合液中，接着加入乳化剂、交联剂
和引发剂，在50‑55℃下反应1‑3h，得到改性玉米粉；

[0032] 所述乳化剂为司盘‑60，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠混合物，所述交联剂为N，N‑亚甲基双丙烯酰胺。

[0033] 较优化的方案，步骤2)中，所述平板培养基各组分包括：葡萄糖28‑30g/L、磷酸二氢钾1‑2g/L、酵母浸膏6‑10g/L、琼脂18‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、氯化铵2‑3g/L。

[0034] 较优化的方案，步骤4)中，大孔树脂脱色前需要进行洗涤，具体步骤为：取大孔树脂，蒸馏水清洗3‑4次，每次3‑5min，再置于氢氧化钠溶液中浸泡3‑4h，蒸馏水洗涤至中性，
接着置于盐酸溶液中浸泡3‑4h，蒸馏水洗涤至中性，再置于氢氧化钠溶液中浸泡4‑5h，蒸馏
水洗涤至pH为8‑8.5。

[0035] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0036] 本发明公开了一种β‑葡聚糖的制备工艺，步骤1)中先进行菌种筛选，准备若干株菌种，并利用刚果红琼脂染色法对其定性检测，检测各个菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，筛选较
高酶活的菌种作为待培养菌种。

[0037] 步骤2)中对菌种进行培养，先通过斜面种子培养7‑8d，再接种至平板培养基进行培养，其中平板培养基各组分包括葡萄糖28‑30g/L、磷酸二氢钾1‑2g/L、酵母浸膏6‑10g/L、
琼脂18‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、氯化铵2‑3g/L。

[0038] 在菌种培养过程中，氮源对于菌体的生长非常重要，而有机氮对菌体生长、分泌胞外多糖等作用远远优于无机氮源，但有机氮源会造成发酵液颜色深，引入色素，后续脱色步
骤比较繁杂，会对葡聚糖的纯度和得率造成影响；因此为了避免该问题，本方案以部分无机
氮源来替换有机氮源，在提高酶活的同时降低后续色素引入量和后续脱色压力，从而提高
β‑葡聚糖的得率。

[0039] 本申请实际操作时，可将酵母浸膏、葡萄糖、氯化铵等组分分批次加入，在提高各组分利用率的同时提高菌种的多糖分泌，从而提高葡聚糖的产量。

[0040] 本发明步骤2)进行菌种培养后，再置于发酵罐中发酵，发酵后进行γ射线辐照，此时发酵罐中含有普通玉米粉和改性玉米粉，γ射线辐照后可有效提高发酵液中多糖的降解
和增溶，在提高葡聚糖得率的基础上进一步降低分离难度，提高制备的葡聚糖纯度；本发明
发酵过程中还添加了改性玉米粉，改性玉米粉由非晶化玉米淀粉中的淀粉链在交联剂作用
下生长并析出，其不溶于油相，从而形成分散的颗粒状态，生成的改性玉米粉具有完整的颗
粒形态，其表面比较光滑且内部存在大量空腔，呈现多孔形态，该改性玉米粉可替代部分普
通玉米粉作为碳源，由于多孔结构的存在，可以在氧气供给时促进氧气流通，同时改性玉米
粉呈现微球状，可与滑石粉相互配合以调控菌体形态，使菌体呈现颗粒状，从而提高氧气的
传递率，增加菌丝体的成长及二次代谢产物的生成量，进一步提高β‑葡聚糖的生产量。

[0041] 本申请中利用改性玉米粉代替部分普通玉米粉，而非晶化玉米淀粉的溶解度、稳定性均优于普通玉米淀粉，可进一步提高发酵液的多糖生成量；同时在发酵3‑4d后，本申请
在发酵罐中添加了淀粉脱支酶和糖化酶，利用淀粉脱支酶脱去剩余的支链淀粉，并利用糖
化酶将发酵液中的支链淀粉、杂糖(如单糖、二糖、三糖、大分子糖等杂糖)转化为葡萄糖，不
仅可以降低杂质影响，而且能够提高产品得率。

[0042] 本发明步骤4)中进行粗提，先利用高压均质法对其进行高压均质，离心分离后上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加1‑2倍量的水，再利用冻融法对其进行冷冻解
冻，高压均质法和冻融法协同作用，其目的是为了破裂细胞壁，从而提高胞内多糖的释放
量，进一步提高β‑葡聚糖的得率；接着利用微波提取法进行粗提，微波提取功率为3‑4W/ml，
提取时间为8‑10min，料水比为1：20，随即利用大孔离子交换树脂进行脱色，脱色前对大孔
离子交换树脂进行预处理，保证树脂清洁度，避免将杂质引入发酵液中，利用大孔树脂脱色
后再加入聚酰胺粉末进行脱蛋白，脱蛋白效果较好，多糖保留率高。脱蛋白后再利用抽滤，
离心，干燥等操作，制备得到成品β‑葡聚糖。

[0043] 本申请公开了一种β‑葡聚糖的制备工艺，工艺设计合理，操作简单，本申请通过对裂褶菌发酵、分离提纯，并优化改进各个参数步骤，制备得到β‑葡聚糖，该产物水溶性好、生
物活性高，且产品的粗糖得率、保留率和纯度较高，可应用于大规模生产，成本低，具有较高
的实用性。

具体实施方式

[0044] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通
技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。

[0045] 一种β‑葡聚糖的制备工艺，包括以下步骤：

[0046] S1：菌种筛选：

[0047] 准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养菌种，备用；

[0048] S2：菌种培养；

[0049] 取待培养菌种，斜面种子培养7‑8d，培养温度为26‑28℃，再接种于平板培养基中，25‑30℃、170‑180r/min条件下培养7‑8d，得到种子液；

[0050] S3：发酵：

[0051] 取种子液，置于发酵罐中发酵7‑8d，搅拌转速100‑300r/min，得到发酵液；过程中发酵3‑4d后发酵罐中依次加入淀粉脱支酶和糖化酶，温度为28‑32℃的条件下进行酶解；

[0052] S4：粗提脱色：

[0053] 发酵液进行γ射线辐照，辐照源为60Co，源强度为200‑210kCi，辐照剂量为700‑800KGy，辐照后静置10‑15min，接着进行高压均质，高压均质压力为65‑70MPa，均质时间为
25‑30min，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加1‑2倍量的水，置于‑
15℃下冻结3‑4h，25‑28℃水浴下解冻0.5‑1h，重复冻融操作2‑3次，进行微波提取，单位体
积的微波提取功率为3‑4W/ml，提取时间为8‑10min，料水比为1：20，离心分离，收集上清液，
与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9‑10h，转速为
120‑150r/min，处理温度为20‑28℃，得到脱色液；

[0054] 大孔树脂脱色前需要进行洗涤，具体步骤为：取大孔树脂，蒸馏水清洗3‑4次，每次3‑5min，再置于氢氧化钠溶液中浸泡3‑4h，蒸馏水洗涤至中性，接着置于盐酸溶液中浸泡3‑
4h，蒸馏水洗涤至中性，再置于氢氧化钠溶液中浸泡4‑5h，蒸馏水洗涤至pH为8‑8.5。

[0055] S5：脱蛋白：

[0056] 取脱色液，加入聚酰胺粉末，25‑28℃下振荡2‑2.5h，振荡频率为100‑150r/min，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

[0057] 本实施例中，发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉15‑25g/L、改性玉米粉3‑6g/L、葡萄糖15‑20g/L、柠檬酸2‑3g/L、维生素0.1‑0.3g/L、滑石粉1‑1.5g/L、透明质酸0.1‑0.3g/
L、琼脂15‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、牛肉膏4‑5g/L；平板培养基各组分包括：葡萄糖28‑30g/L、
磷酸二氢钾1‑2g/L、酵母浸膏6‑10g/L、琼脂18‑20g/L、硫酸镁1‑2g/L、氯化铵2‑3g/L。

[0058] 改性玉米粉的制备步骤为：取非晶化玉米淀粉、水混合搅拌，制得淀粉乳，再将淀粉乳缓慢滴加至环己烷、三氯甲烷混合液中，接着加入乳化剂、交联剂和引发剂，在50‑55℃
下反应1‑3h，得到改性玉米粉；所述乳化剂为司盘‑60，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢
钠混合物，所述交联剂为N，N‑亚甲基双丙烯酰胺。

[0059] 实施例1：

[0060] S1：菌种筛选：

[0061] 准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养菌种，备用；

[0062] S2：菌种培养；

[0063] 取待培养菌种，斜面种子培养7d，培养温度为26℃，再接种于平板培养基中，25℃、170r/min条件下培养7d，得到种子液；

[0064] S3：发酵：

[0065] 取种子液，置于发酵罐中发酵7d，搅拌转速100r/min，得到发酵液；过程中发酵3d后发酵罐中依次加入淀粉脱支酶和糖化酶，温度为28℃的条件下进行酶解；

[0066] S4：粗提脱色：

[0067] 发酵液进行γ射线辐照，辐照源为60Co，源强度为200kCi，辐照剂量为700KGy，辐照后静置10min，接着进行高压均质，高压均质压力为65MPa，均质时间为25min，离心分离，上
清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加1倍量的水，置于‑15℃下冻结3h，25℃水浴下
解冻0.5h，重复冻融操作2次，进行微波提取，单位体积的微波提取功率为3W/ml，提取时间
为8min，料水比为1：20，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱盐浓
缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9h，转速为120r/min，处理温度为20℃，得到脱色液；

[0068] 大孔树脂脱色前需要进行洗涤，具体步骤为：取大孔树脂，蒸馏水清洗3次，每次3min，再置于氢氧化钠溶液中浸泡3h，蒸馏水洗涤至中性，接着置于盐酸溶液中浸泡3h，蒸
馏水洗涤至中性，再置于氢氧化钠溶液中浸泡4h，蒸馏水洗涤至pH为8。

[0069] S5：脱蛋白：

[0070] 取脱色液，加入聚酰胺粉末，25℃下振荡2h，振荡频率为100r/min，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

[0071] 本实施例中，发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉15g/L、改性玉米粉3g/L、葡萄糖15g/L、柠檬酸2g/L、维生素0.1g/L、滑石粉1g/L、透明质酸0.1g/L、琼脂15g/L、硫酸镁1g/L、
牛肉膏4g/L；平板培养基各组分包括：葡萄糖28g/L、磷酸二氢钾1g/L、酵母浸膏6g/L、琼脂
18g/L、硫酸镁1g/L、氯化铵2g/L。

[0072] 改性玉米粉的制备步骤为：取非晶化玉米淀粉、水混合搅拌，制得淀粉乳，再将淀粉乳缓慢滴加至环己烷、三氯甲烷混合液中，接着加入乳化剂、交联剂和引发剂，在50℃下
反应1h，得到改性玉米粉；所述乳化剂为司盘‑60，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠混
合物，所述交联剂为N，N‑亚甲基双丙烯酰胺。

[0073] 实施例2：

[0074] S1：菌种筛选：

[0075] 准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养菌种，备用；

[0076] S2：菌种培养；

[0077] 取待培养菌种，斜面种子培养7d，培养温度为27℃，再接种于平板培养基中，28℃、175r/min条件下培养7d，得到种子液；

[0078] S3：发酵：

[0079] 取种子液，置于发酵罐中发酵7d，搅拌转速200r/min，得到发酵液；过程中发酵4d后发酵罐中依次加入淀粉脱支酶和糖化酶，温度为30℃的条件下进行酶解；

[0080] S4：粗提脱色：

[0081] 发酵液进行γ射线辐照，辐照源为60Co，源强度为205kCi，辐照剂量为750KGy，辐照后静置12min，接着进行高压均质，高压均质压力为68MPa，均质时间为28min，离心分离，上
清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加1.5倍量的水，置于‑15℃下冻结3.5h，27℃水
浴下解冻0.8h，重复冻融操作2次，进行微波提取，单位体积的微波提取功率为3.5W/ml，提
取时间为9min，料水比为1：20，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱
盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9.5h，转速为145r/min，处理温度为26℃，得到脱色
液；

[0082] 大孔树脂脱色前需要进行洗涤，具体步骤为：取大孔树脂，蒸馏水清洗3次，每次4min，再置于氢氧化钠溶液中浸泡3.5h，蒸馏水洗涤至中性，接着置于盐酸溶液中浸泡
3.5h，蒸馏水洗涤至中性，再置于氢氧化钠溶液中浸泡4.5h，蒸馏水洗涤至pH为8.5。

[0083] S5：脱蛋白：

[0084] 取脱色液，加入聚酰胺粉末，27℃下振荡2.3h，振荡频率为125r/min，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，析出物干燥，得到β‑葡聚糖成品。

[0085] 本实施例中，发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉20g/L、改性玉米粉5g/L、葡萄糖18g/L、柠檬酸2.5g/L、维生素0.2g/L、滑石粉1.2g/L、透明质酸0.2g/L、琼脂18g/L、硫酸镁
1.5g/L、牛肉膏4.5g/L；平板培养基各组分包括：葡萄糖29g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、酵母浸
膏8g/L、琼脂19g/L、硫酸镁1.5g/L、氯化铵2.5g/L。

[0086] 改性玉米粉的制备步骤为：取非晶化玉米淀粉、水混合搅拌，制得淀粉乳，再将淀粉乳缓慢滴加至环己烷、三氯甲烷混合液中，接着加入乳化剂、交联剂和引发剂，在52℃下
反应2h，得到改性玉米粉；所述乳化剂为司盘‑60，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠混
合物，所述交联剂为N，N‑亚甲基双丙烯酰胺。

[0087] 实施例3：

[0088] S1：菌种筛选：

[0089] 准备菌种，分别进行刚果红琼脂染色法定性测试，检测菌种的β‑1,3‑葡聚糖酶活，进行筛选，得到待培养菌种，备用；

[0090] S2：菌种培养；

[0091] 取待培养菌种，斜面种子培养8d，培养温度为28℃，再接种于平板培养基中，30℃、180r/min条件下培养8d，得到种子液；

[0092] S3：发酵：

[0093] 取种子液，置于发酵罐中发酵8d，搅拌转速300r/min，得到发酵液；过程中发酵4d后发酵罐中依次加入淀粉脱支酶和糖化酶，温度为32℃的条件下进行酶解；

[0094] S4：粗提脱色：

[0095] 发酵液进行γ射线辐照，辐照源为60Co，源强度为210kCi，辐照剂量为800KGy，辐照后静置15min，接着进行高压均质，高压均质压力为70MPa，均质时间为30min，离心分离，上
清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加2倍量的水，置于‑15℃下冻4h，28℃水浴下解
冻1h，重复冻融操作3次，进行微波提取，单位体积的微波提取功率为4W/ml，提取时间为
10min，料水比为1：20，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗提液合并，脱盐浓缩，
再加入大孔树脂，摇床中处理10h，转速为150r/min，处理温度为28℃，得到脱色液；

[0096] 大孔树脂脱色前需要进行洗涤，具体步骤为：取大孔树脂，蒸馏水清洗4次，每次5min，再置于氢氧化钠溶液中浸泡4h，蒸馏水洗涤至中性，接着置于盐酸溶液中浸泡4h，蒸
馏水洗涤至中性，再置于氢氧化钠溶液中浸泡5h，蒸馏水洗涤至pH为8.5。

[0097] S5：脱蛋白：

[0098] 取脱色液，加入聚酰胺粉末，28℃下振荡2.5h，振荡频率为150r/min，抽滤，离心，取上清，加入乙醇醇析，干燥，得到β‑葡聚糖成品。

[0099] 本实施例中，发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉25g/L、改性玉米粉6g/L、葡萄糖20g/L、柠檬酸3g/L、维生素0.3g/L、滑石粉1.5g/L、透明质酸0.3g/L、琼脂20g/L、硫酸镁2g/
L、牛肉膏5g/L；平板培养基各组分包括：葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾2g/L、酵母浸膏10g/L、琼
脂20g/L、硫酸镁2g/L、氯化铵3g/L。

[0100] 改性玉米粉的制备步骤为：取非晶化玉米淀粉、水混合搅拌，制得淀粉乳，再将淀粉乳缓慢滴加至环己烷、三氯甲烷混合液中，接着加入乳化剂、交联剂和引发剂，在55℃下
反应3h，得到改性玉米粉；所述乳化剂为司盘‑60，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠混
合物，所述交联剂为N，N‑亚甲基双丙烯酰胺。

[0101] 对比例1：

[0102] S4：粗提脱色：

[0103] 发酵液静置12min，再进行高压均质，高压均质压力为68MPa，均质时间为28min，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，沉淀部分加1.5倍量的水，置于‑15℃下冻结
3.5h，27℃水浴下解冻0.8h，重复冻融操作2次，进行微波提取，单位体积的微波提取功率为
3.5W/ml，提取时间为9min，料水比为1：20，离心分离，收集上清液，与β‑葡聚糖高压均质粗
提液合并，脱盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9.5h，转速为145r/min，处理温度为26
℃，得到脱色液。

[0104] 其余步骤处理方式如实施例2。

[0105] 对比例1在实施例2的基础上进行改变，其并未进行γ射线辐照。

[0106] 对比例2：

[0107] S4：粗提脱色：

[0108] 发酵液静置12min，再进行高压均质，高压均质压力为68MPa，均质时间为28min，离心分离，上清液为β‑葡聚糖高压均质粗提液，脱盐浓缩，再加入大孔树脂，摇床中处理9.5h，
转速为145r/min，处理温度为26℃，得到脱色液。

[0109] 其余步骤处理方式如实施例2。

[0110] 对比例2在对比例1的基础上进行改变，其并未进行冻融操作。

[0111] 对比例3：

[0112] 发酵罐各组分原料包括：普通玉米粉20g/L、葡萄糖18g/L、柠檬酸2.5g/L、维生素0.2g/L、滑石粉1.2g/L、透明质酸0.2g/L、琼脂18g/L、硫酸镁1.5g/L、牛肉膏4.5g/L；

[0113] 其余步骤处理方式如对比例1。

[0114] 对比例3对比例2的基础上进行改变，其中发酵罐中并未添加改性玉米粉。

[0115] 对比例4：

[0116] 对比例4在对比例3的基础上进行改变，其发酵罐中并未添加滑石粉。

[0117] 对比例5：

[0118] 对比例5在对比例4的基础上进行改变，其中平板培养基中未添加氯化铵。

[0119] 对比例6：

[0120] 对比例6在对比例5的基础上进行改变，其发酵罐中并未添加柠檬酸和透明质酸。

[0121] 对比例7：

[0122] 对比例7在实施例2的基础上进行改变，其并未采用微波提取法进行粗品提取，而是采用水提法提取。

[0123] 对比例8：

[0124] 对比例8在实施例2的基础上进行改变，其并未采用微波提取法进行粗品提取，而是采用醇提法提取。

[0125] 对比例9：

[0126] 对比例9在实施例2的基础上进行改变，其并未采用微波提取法进行粗品提取，而是采用超声提取法提取。

[0127] 对比例10：

[0128] 对比例10在实施例2的基础上进行改变，采用活性炭脱色。

[0129] 对比例11：

[0130] 对比例11在实施例2的基础上进行改变，采用蛋白酶+Sevage法洗脱蛋白。

[0131] 对比例12：

[0132] 对比例12在实施例2的基础上进行改变，采用大孔树脂洗脱蛋白。

[0133] 试验：

[0134] 1、实施例1‑3为依据本发明公开的技术方案进行β‑葡聚糖的制备；实施例2与对比例1‑12形成对照试验。

[0135] 2、分别取实施例1‑3、对比例1‑12制备的产物样品，并对其进行检测，检测数据如下所示：

[0136] ①分别采用红外吸收光谱测定产物样品的特征吸收峰、采用高效凝胶过滤色谱法(HPSEC)测定产物样品的分子量及其分布。

[0137] 检测结果表明，实施例1‑3、对比例1‑12中制备得到的产品均为β‑葡聚糖。

[0138] ②检测并计算产物样品的纯度和保留率，其中保留率为最终产品与粗品多糖的质量百分比，多糖含量测定采用苯酚‑硫酸法；粗糖得率(％)＝粗品多糖的质量/发酵原料的
质量×100％；

[0139] 检测结果如下表所示：

[0140]

[0141]

[0142] 结论：本申请通过对裂褶菌发酵、分离提纯，并优化改进各个参数步骤，制备得到β‑葡聚糖，该产物水溶性好、生物活性高，且产品的粗糖得率、保留率和纯度较高，可应用于
大规模生产，成本低，具有较高的实用性。

[0143] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论
从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权
利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有
变化囊括在本发明内。