用于鉴定哺乳动物细胞病毒感染机会的方法

摘要

本发明发现了MARCH8通过抑制I类融合蛋白的N‑糖基化、阻断I类融合蛋白的脱落和分泌，从而阻碍其成熟，导致I类融合蛋白在宿主细胞表达量的下降，从而为识别宿主细胞融合病毒的状态以及筛选抗病毒活性药物的方法提供了依据。

权利要求

1.MARCH8在制备检测I类融合蛋白的N‑糖基化的试剂中的用途，所述I类融合蛋白来源

于流感病毒、埃博拉病毒或艾滋病病毒。

说明书

用于鉴定哺乳动物细胞病毒感染机会的方法

【技术领域】

[0001] 本申请涉及病毒感染领域，具体涉及包膜病毒对宿主细胞的感染机制与途径。【背景技术】

[0002] 随着人类对细胞膜分子、病毒蛋白质微粒结构的了解及它们与受体分子间相互作用的 认识,我们对病毒人侵的机制有了深人的了解,这为研制有效的拮抗剂、疫苗及特异
性的载 体提供了新的方法。

[0003] 病毒侵染细胞的生命周期需要吸附、侵入、脱壳、病毒成分合成、病毒粒子的装配和 释放等一系列步骤,这是一个连续的过程,而且这主要针对有包膜的病毒而言.按病毒
外 壳是否包裹着富含脂质的膜,将病毒分为无包膜病毒和有包膜病毒.无包膜病毒主要通
过 吞饮作用在网格蛋白的介导下进入被感染的细胞内,包膜病毒的入侵过程主要是病毒
包膜 和宿主细胞膜的融合过程,两个膜融合成为一个膜,从而使病毒侵入,完成生命周期
的第一 个关键步骤.在分子水平上研究这一过程,找出阻止病毒侵入细胞的方法,能够达
到预防 和治疗病毒疾病的目的

[0004] 包膜病毒是一类具有包裹在蛋白质衣壳外的一层包膜的病毒，这层包膜主要来源于宿 主细胞膜(磷脂层和膜蛋白)，同时也包含病毒自身表达的糖蛋白。病毒包膜具有抗原
性， 主要功能是帮助病毒进入宿主细胞，并维护病毒体结构的完整性。包膜病毒能够表达
三类融 合蛋白，它们介导病毒和宿主细胞膜融合从而使病毒进入宿主细胞。I类融合蛋白
由流感病 毒、逆转录病毒、埃博拉病毒和冠状病毒产生。它们首先合成为I型跨膜多肽前
体，随后糖 基化和寡聚化。细胞生理学中的基本过程是在ER中合成跨膜蛋白和可溶性蛋白
之后，将它 们外在化到质膜或细胞外空间。这些蛋白质中的绝大多数通过ER到高尔基体转
运的常规蛋 白质分泌(CPS)途径输出，而其它的通过不依赖高尔基体的非常规蛋白质分泌
途径输出。指 定通过CPS途径分泌的蛋白质首先通过信号序列靶向ER内部，从N‑糖基化起
始，N‑糖基 化整体将寡糖前体转移至Asn‑X‑Ser/Thr(XPro)序列中的Asn残基，该序列包括
两个N‑乙酰 葡糖胺(GlcNAc)、九个甘露糖和三个葡萄糖残基。在折叠和初始加工后，具有
高甘露糖N‑ 聚糖(NH‑聚糖)的糖蛋白从ER离开并进入顺式高尔基网络(CGN)，在CGN中发生
广泛的甘 露糖修剪。在高尔基体的网络和高尔基体的反式网络(TGN)中，在低甘露糖前体
中加入其它 单糖以完成N‑糖基化过程后，形成了复合N‑聚糖(Nc‑聚糖)和杂合N‑聚糖
(Nhc‑聚糖)。此外， O‑糖基化在脊椎动物中通过将N‑乙酰半乳糖胺(GalNAc)连接到Ser或
Thr残基上作为高尔 基体中的晚期事件而发生。成熟糖蛋白从TGN被分选到膜性囊泡中并
被外化，在通向质膜 的途中被细胞蛋白酶如弗林蛋白酶(furin)切割，产生三聚体N‑末端
受体‑结合和C‑末端融 合亚单位。这些成熟的三聚体被输出到质膜并作为刺突蛋白介导病
毒入侵宿主细胞。

[0005] 埃博拉病毒(EBOV)、甲型流感病毒(IAV)和1型人免疫缺陷病毒(HIV‑1)是有包膜病毒， 其引起致命性出血热、呼吸道疾病或免疫缺陷。这些细胞内感染机制不相同，但它们
都通过 CPS表达结构上相似的I类融合蛋白，这些融合蛋白由三聚体受体结合和融合亚基
组成，介 导病毒囊膜与细胞膜的融合。EBOV、HIV‑1和IAV融合蛋白首先合成为I型跨膜(TM)
多肽 前体GP0、GP160或HA0。所有这些病毒蛋白都进行重N‑糖基化。从IAV HA中没有检测 
到O‑糖基化。HIV‑1存在一个潜在的O‑糖基化位点，但尚未从其Env发现O‑聚糖。除了27 个
N‑糖基化位点，EBOV‑GP在粘蛋白样结构域(MLD)中具有～80个O‑糖基化位点。来自 高致病
性禽流感病毒如H5N1的三聚体EBOV GP0、HIV‑1GP160和HA0被TGN中的前蛋 白转化酶furin
切割成GP1/GP2、GP120/GP41或HA1/HA2异二聚体。这些成熟的三聚体/ 异二聚体被输出到
质膜并作为刺突物掺入病毒粒子中以引发感染。

[0006] 膜相关RING–CH(membrane–associated RING‑CH,MARCH)家族是近年发现的一类 属于E3泛素连接酶的环指结构域家族，迄今已发现的MARCH家族成员有11种，分别是 
MARCH1‑11。MARCH家族的成员分布广泛，参与多种细胞功能，如免疫调节，蛋白质量 控制和
膜转运，内质网相关降解，内体蛋白质运输，线粒体动力学平衡和精子发生调控等。 MARCH
家族蛋白相关领域的研究正日益受到重视。

[0007] MARCH8，也称C‑MIR，含约291个氨基酸，相对分子质量约为3.3X104kDa，广泛表达 于各种组织，高表达于肺和胰腺，存在于未成熟树突状细胞，定位于细胞质泡膜、溶酶体膜 
和早期内涵体膜，能介导CD86、TFRC、FAS、和MHC‑II类蛋白质，如HLA‑DP、‑DQ和 ‑DR的泛素
化，并促进其随后的内吞作用和通过MVB分选到溶酶体。对乳腺癌细胞的研究 发现，MARCH8
能调控肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)受体的稳态细胞表面 表达，是一种肿瘤
细胞对TRAIL受体的潜在治疗靶点。MARCH 8泛素化降解IL‑1受体辅 助蛋白、抑制IL‑1β对
NF－κB和MAPK的激活，即MARCH 8为IL－1β诱导的N F－κB激活途径的特异性抑制剂，为解
析天然免疫信号转导的调控机制提供了更多的研究 证据，同时也为将来的药物设计提供
可能的靶标。

[0008] 最近，发现MARCH8通过下调来自细胞表面的Env而抑制HIV‑1进入和复制。我们 的研究发现MARCH8具有非常广泛的抗病毒活性，其抑制EBOV GP、HIV‑1Env和H5N1 HA的成熟。
【发明内容】

[0009] I类融合蛋白作为高度糖基化的异源三聚刺突从病毒体表面突出，并通过结合靶细胞 表面上的受体而引发感染。尽管糖基化和蛋白水解切割是非常重要的，但是仍然不能
完全理 解这两个生物学过程是如何配合帮助病毒完成其囊膜蛋白的的加工成熟，成为有
生物学活性 的刺突蛋白。

[0010] 我们的研究结果明确了I类融合蛋白N‑糖基化在病毒刺突形成中的重要作用。 MARCH8特异性地抑制病毒囊膜蛋白这一重要的生物学修饰，这一发现对于囊膜病毒如何 
侵入宿主细胞的机制有了全新的理解和认识。

[0011] 我们发现MARCH8通过抑制I类融合蛋白的N‑糖基化、阻断I类融合蛋白的脱落 和分泌，从而阻碍其成熟，导致I类融合蛋白在宿主细胞表达量的下降，从而对I类融合蛋 白
的成熟产生抑制作用。。我们的研究结果证明I类融合蛋白、弗林蛋白酶和MARCH8在细 胞中
彼此相互作用，这三种分子在活细胞中形成复合物。MARCH8阻断了由Nc‑和O‑聚糖 对I类融
合蛋白的修饰。Nc‑和O‑聚糖对I类融合蛋白的修饰是弗林蛋白酶对其进行蛋白水 解切割
并包装到病毒颗粒是必需的。

[0012] 在上述研究成果的基础上。我们一方面提供一种能够识别宿主细胞融合病毒状态的 方法，该方法通过检测细胞膜上MARCH8的表达量，来识别细胞融合病毒的状态，当细胞 
膜上MARCH8的表达量较低时，细胞容易被病毒感染；当细胞膜上MARCH8的表达量较 高时，
则细胞不容易被病毒感染。

[0013] 另一方面，我们提供一种抗病毒的药物，该药物能够显著提高细胞内MARCH8的表达 量。细胞内MARCH8通过抑制病毒I类融合蛋白的成熟，进而抑制病毒的活性。其中I类 融
合蛋白是指EBOV的GP蛋白，HIV‑1的ENV蛋白以及H5N1的HA蛋白。

[0014] 进一步，我们提供一种筛选抗病毒活性药物的方法，通过判断药物是否影响宿主细胞MARCH8的表达来判断其抗病毒活性。如果所述药物能够促进宿主细胞MARCH8的表达量
增 加，则所述药物具有抗病毒活性，如果所述药物不能够促进宿主细胞MARCH8的表达量增
加， 则所述药物不具有抗病毒活性。进一步，所述病毒优选包膜病毒，更进一步，所述病毒
优选 EMBOV病毒、HIV病毒或H5N1病毒。

[0015] 更进一步，我们提供一种筛选抗病毒活性药物的装置，该装置能够检测所述药物对 MARCH8表达量的影响。该装置可以优选为试剂盒。

[0016] 本发明首次发现了MARCH8对包膜病毒侵入宿主细胞的机制，MARCH8通过影响I 类融合蛋白的糖基化、加工、分泌等成熟过程，抑制了包膜病毒侵入宿主细胞的活性。这一 机
制的发现，对于判断宿主细胞的病毒感染状态有重要意义，同时通过对宿主细胞MARCH8 的
表达量的影响来筛选抗病毒药物的意义更为重大。

[0017] 【说明书附图】

[0018] 图1：MARCH8下调细胞表面的EBOV GP

[0019] A)使用特异性抗人MARCH8，通过Western印迹(WB)分析在293T、THP‑1、Vero和HeLa 细胞中，或在用人MARCH8表达载体转染的293T细胞中的MARCH8表达。

[0020] B)HIV‑1萤火虫荧光素酶报告基因假病毒用EBOV GPΔMLD囊膜来包装。在来自不同物 种的MARCH8或APOBEC3G的情况下，从293T细胞产生假病毒粒子。通过感染Vero 细胞
测定病毒感染性。感染性以相对值显示，其中存在对照(Ctrl)载体时的感染性设 定为100。
结果来自三个不同的实验。H，人；B，牛；M，小鼠。

[0021] C)EBOV病毒样颗粒(VLP)在表达EBOV GPΔMLD、EBOV VP40和MARCH8或其W114A 突变体之后从293T细胞产生。

[0022] D)如HIV‑1假病毒。如B)中所制备，如D)中经超离心纯化、并通过WB分析。

[0023] E)具有GFP标记的EBOV GPΔMLD在HeLa细胞中表达。用DAPI染色后，通过共聚焦 显微镜检测GP定位。

[0024] F)293T细胞中，EBOVGPΔMLD(内含Flag标签)剂量不变，MARCH8的剂量不断增加。 使用抗‑FLAG标签抗体，然后使用Alexa Fluor‑488标记的山羊抗小鼠IgG，通过流式细 胞
术检测细胞表面上的GP表达。

[0025] 图2：MARCH8将EBOV GP保留在高尔基体中

[0026] A)FLAG标记的GPΔMLD与HA标记的MARCH8一起表达。在293T细胞中FLAG标记 的弗林蛋白酶与HA标记的MARCH8和GPΔMLD一起表达。用抗‑FLAG磁珠免疫沉 淀蛋白，并用WB分
析。MARCH8、弗林蛋白酶和GP分别通过抗HA、抗FLAG或抗 EBOV‑GP检测。

[0027] B)MARCH8‑VN‑HA/GP‑VC和弗林蛋白酶‑VN‑HA/GP‑VC的BiFC对在HeLa细胞中表达。 用荧光抗HA染色细胞以检测MARCH8或弗林蛋白酶，用DAPI染色以检测细胞核。 通过共焦显
微镜观察到的荧光信号。

[0028] C)在HeLa细胞中，不表达HA‑Tag的弗林蛋白酶‑VN与GP‑VC和HA‑标记的MARCH8 一起表达。用荧光抗HA染色细胞以检测MARCH8，用DAPI染色细胞以检测细胞核。 通过共焦显
微镜观察到的荧光信号。

[0029] D)在HeLa细胞中，在MARCH8存在或不存在时，用CNX‑mCherry或TGN‑mCherry表达 弗林蛋白酶‑VN/GP‑VC BiFC对。用DAPI染色后，通过共聚焦显微镜观察到的荧光信 号。

[0030] 图3：MARCH8阻断EBOV GP蛋白水解切割

[0031] A)GP在293T细胞中用野生型(WT)人MARCH8或其W114A突变体表达。GP和 MARCH8的表达通过WB使用抗FLAG或抗HA检测。比较了来自人(h)、牛(b)和小鼠 (m)的MARCH8蛋白的
活性。

[0032] B)确定MARCH8蛋白在A)中的EBOV VP40或HIV‑1Gag蛋白的存在下,如何影响EBOV GPΔMLD切割。

[0033] C)EBOV GPΔMLD在293T细胞中与人MARCH8一起表达，并且用NH4Cl、bafiloymycin A1(BafA1)、MG132或DBeQ处理。通过WB测定蛋白质表达。

[0034] D)VSV‑G在293T细胞中用人MARCH8或其W114A突变体表达，并用NH4Cl或MG132 处理。通过WB测定蛋白质表达。

[0035] E)具有RING结构域和两个TM结构域的MARCH8蛋白的示意图。三种人类MARCH8 C‑端CT缺失突变体1‑213、1‑247和1‑272被创建并且表达为具有全长GP或GPΔ MLD。使用抗HA
或抗FLAG通过WB检测MARCH8和GP的表达。

[0036] F)在HeLa细胞中表达人MARCH8及其三个具有C‑末端GFP标记的缺失突变体。用DAPI 染色后，通过共聚焦显微镜检测它们在亚细胞的定位。

[0037] 图4：MARCH8阻断了由Nc‑和O‑聚糖进行的EBOV GP修饰。

[0038] A)弗林蛋白酶功能结构域的示意图。FLAG标记的CD、P结构域和CD亚结构域缺失突 变体被创建，并与EBOV GPΔMLD一起表达。蛋白质通过抗‑FLAG磁珠免疫沉淀并 通过WB检
测。分别用抗FLAG或抗EBOV‑GP检测弗林蛋白酶和EBOV‑GP。

[0039] B)EBOV GP、GPΔFR、GPΔMLD或GPΔMLDΔFR与MARCH8一起在293T细胞中表达。 细胞裂解后，用Endo H或PNGase F处理细胞裂解物，或不处理，并用WB分析。

[0040] C)EBOV GP△FR和GP△MLD△FR与EBOVVP40和MARCH8或弗林蛋白酶一起在293T 细胞中表达。通过超速离心从上清液中纯化EBOV VLP。通过WB测定细胞和/或VLP 中EBOVGP、
MARCH8或弗林蛋白酶的表达。

[0041] D)随着293T细胞中弗林蛋白酶的量的增加，全长EBOV GP的表达。GP和弗林蛋白酶 的表达由WB测定。

[0042] 图5：MARCH8阻断EBOV GP脱落和分泌

[0043] A)具有N‑末端FLAG标签的EBOV全长GP和GPΔMLD与MARCH8或弗林蛋白酶一起 表达。用抗‑FLAG免疫沉淀释放到上清液中的GP蛋白。通过WB检测细胞或上清液 中GP和
MARCH8的表达。

[0044] B)提供了EBOV GP、分泌型GP(sGP)和分泌型小GP(ssGP)表达的示意图。显示了它们 EBOV基因组未编辑过的(7A)和编辑过的(8A，9A)GP mRNA的相对表达水平，以及 GP1中
新的弗林蛋白酶切割位点。

[0045] C)具有N‑末端FLAG标签的GP1、GP1ΔMLD和sGP在293T细胞中与所示的MARCH8 蛋白一起表达。将释放到上清液中的GP蛋白如(A)中那样免疫沉淀。通过WB检测 细胞和上清
液中GP和MARCH8蛋白的表达。

[0046] 图6：MARCH8阻断HIV‑1ENV和H5N1HA成熟

[0047] A)在293T细胞中用MARCH8和HIV‑1ENV或H5N1HA表达FLAG标记的弗林蛋白酶。 用抗‑FLAG磁珠免疫沉淀蛋白，并用WB分析。

[0048] B)HIV‑1ENV和H5N1HA与MARCH8一起在293T细胞中表达，它们的加工由WB确定。

[0049] C)HIV‑1ENV和H5N1HA与MARCH8一起在293T细胞中表达,细胞裂解后，用Endo H 或PNGase F处理细胞裂解物，或不处理，并用WB分析。
【具体实施方式】

[0050] 下面，详细地说明本发明，但本发明并不限定于本说明书中所描述的实施方式。

[0051] 在本发明的一种实施方式中，我们提供一种能够识别宿主细胞融合病毒状态的方法， 所述病毒是指包膜病毒，优选EBOV、HIV、和H5N1病毒。

[0052] 包膜病毒是指在病毒蛋白质衣壳外还有一层病毒包膜，这层包膜主要来源于宿主细胞 膜(磷脂层和膜蛋白)，同时也包含一些病毒自身分泌的糖蛋白。病毒包膜的主要功能
是帮 助病毒进入宿主细胞，首先包膜表面上的糖蛋白识别并结合宿主细胞表面受体，接着
病毒包 膜与宿主细胞膜结合，最后病毒衣壳和病毒基因组进入宿主，完成感染过程。包膜
病毒通常 表达三类融合蛋白，它们是介导病毒和细胞膜融合进入宿主细胞所必需的。流感
病毒、逆转 录病毒、埃博拉病毒和冠状病毒等通常产生I类融合蛋白，它们首先合成为I型
跨膜多肽前 体，随后糖基化和寡聚化。这些前体中的大多数在晚期分泌途径中在通向质膜
的途中被细胞 蛋白酶如弗林蛋白酶切割，产生三聚体N‑末端受体‑结合和C‑末端融合亚单
位。

[0053] 埃博拉病毒(EBOV)是引起人类和非人灵长类动物发生埃博拉出血热(EBHF) 的烈性病毒，EBHF是当今世界上最致命的病毒性出血热，病死率高达90％。EBOV 糖蛋白与病毒
传播方式、宿主范围高度相关，但其在病毒入侵过程中的作用机制尚不清楚, GP作为病毒
重要的结构蛋白是否在病毒增殖过程起辅助作用尚不清楚。

[0054] 人类免疫缺陷病毒(HIV‑1)ENV是HIV外壳蛋白,其在病毒抗原性方面发挥重要作用。

[0055] 流感病毒(AIV)属于正粘病毒科流感病毒属，是单股负链RNA病毒，基因组由 8个RNA片段组成，编码至少11种蛋白。依据NP蛋白的不同，流感病毒分为甲型、 乙型和丙型，即
A、B、C型。根据病毒表面糖蛋白HA和NA的抗原性差异可以分为18 个HA亚型和11个NA亚型。
目前，导致人类感染死亡的禽流感病毒仍以H5N1亚型为 主。H5N1流感病毒的流行危害严
重，病毒的HA作为流感病毒最主要的免疫组份在疫苗 中发挥重要作用。

[0056] 我们的研究证明了宿主细胞蛋白MARCH8特异性地抑制弗林蛋白酶介导的EBOV GP、HIV‑1ENV和H5N1HA蛋白的切割。同时我们还发现MARCH8阻断了高尔基体中 EBOV GP糖
基化并抑制其从高尔基体向细胞膜表面的转运。因此，MARCH8是一种重要的 宿主抗病毒因
子，其特异性地灭活I类融合蛋白。通过检测细胞蛋白MARCH8的表达，通常 能够预测病毒与
细胞膜融合的状态，当细胞蛋白有足够的MARCH8蛋白表达时，包膜病毒产 生的帮助其完成
病毒与细胞膜融合的I类融合蛋白在高尔基体内的糖基化以及从高尔基体 向细胞膜表面
的转运和成熟所需的酶的切割均受到抑制，从而抑制了病毒侵入宿主细胞发生 感染的过
程。

[0057] 【实施例】

[0058] 本发明所用实验材料和方法

[0059] 细胞系:将人胚肾293T细胞、宫颈癌HeLa细胞和非洲绿猴肾Vero E6细胞培养在 Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM)中。THP‑1细胞在Roswell Park Memory Institute 
(RPMI)1640培养基中培养。培养基中添加10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素(Gibco)，细胞 
在37℃和5％CO2培养箱中的潮湿环境中培养。所有这些细胞系均获自美国典型培养物保 
藏中心(ATCC)。

[0060] 质粒：人MARCH8表达质粒pCAGGS‑3xHA‑hMARCH8及其W114突变体 pCAGGS‑3xHA‑hMARCH8‑W114A由日本Tokunaga K教授惠赠。通过RT‑PCR从牛外周血 单核细胞或小鼠
RAW264.7细胞中扩增牛和鼠MARCH8cDNA，通过EcoRI/XhoI多克隆位 点连接到到具有C‑末
端HA标记的pCAGGS中。通过PCR在pCAGGS‑3xHA‑hMARCH8 载体中产生人MARCH8C端缺失突变
体1‑272、1‑247和1‑213表达载体。EBOV‑GP和 EBOV‑VP40表达载体由本实验构建保存。N‑末
端FLAG标记的EBOV‑GPΔMLD表达载体 由美国Shan‑Lv Liu教授提供。pcDNA3.1‑FLAG‑sGP、
pcDNA3.1‑FLAG‑GP1和 pcDNA3.1‑FLAG‑GP1ΔMLD由EBVOV‑GP和EBOV‑GPΔMLD载体通过PCR
产生，并通过 BamHI/EcoRI多克隆位点连接到到pcDNA3.1(+)载体中。pCMV6‑弗林蛋白酶‑
FLAG/MYC 购自OriGene(目录号RC204279)。所述弗林蛋白酶ΔSD、ΔSD1、ΔSD3和ΔP突变
体通 过重叠PCR在相同的弗林蛋白酶表达载体中产生。通过EcoRI/AgeI多克隆位点将
furin、 MARCH8和EBOV‑GPΔMLD cDNA插入pEGFP‑N1载体(GenBank登录号U55762)中，构建 
pcDNA3.1‑furin‑GFP、pcDNA3.1‑hMARCH8‑GFP和pcDNA3.1‑GPΔMLD‑GFP。

[0061] 为了构建BiFC表达载体，通过EcoRI/AgeI多克隆位点将furin、MARCH8和GP‑ΔMLD cDNA分别插入pcDNA3.1‑VN、pcDNA3.1‑VN‑HA或pcDNA3.1‑FLAG‑VC(C‑ 末端VN/VC)载体中，
其产生pcDNA3.1‑furin‑VN、pcDNA3.1‑furin‑VN‑HA、 pcDNA3.1‑furin‑FLAG‑VC、
pcDNA3.1‑MARCH8‑VN‑HA、pcDNA3.1‑MARCH8‑FLAG‑VC、 pcDNA3.1‑GPΔMLD‑VN‑HA或
pcDNA3.1‑GPΔMLD‑FLAG‑VC。mCherry‑TGNP‑N‑10和 mCherry‑Calnexin‑N‑14表达载体是
通过Addgene由Michael Davidson教授提供。H5N1HA 表达载体7705从Gary Nabel获得。

[0062] 共聚焦显微分析。转染前10小时，将总共2×105个HeLa细胞接种在载玻片上。用 Lipofectamine3000试剂(Thermo Fisher)转染细胞。36小时后，洗涤细胞，用4％多聚甲醛
固 定，用0.1％Triton X‑100透化。洗涤后，用5％牛血清白蛋白封闭细胞。对于免疫荧光测
定， 将细胞与抗HA一抗在RT下孵育1h。用PBS洗涤3次后，用Alexa Fluor‑647偶联的二抗 
在室温下染色1小时。用PBS洗涤3次后，用DAPI染色细胞1分钟，在RT洗涤2小时， 并在共焦
显微镜分析(ZEISS LSM880)下观察。分析每张载玻片至少100个随机细胞，并选 择来自每
张载玻片的最具代表性的图像用于展示。

[0063] 流式细胞术分析。转染前12小时，在6孔板的每孔中接种总共2×105 293T细胞。 用pcDNA3.1‑FLAG‑GPΔMLD和增加量的pCAGGS‑3xHA‑hMARCH8表达载体转染细胞。 48小时
后，将细胞以2000rpm离心5分钟，并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。短暂 离心后，用
5％牛血清白蛋白封闭细胞，并与抗FLAG一抗在室温下孵育1小时。离心并用 PBS洗涤三次
后，在室温下加入Alexa Fluor‑488结合的二抗1小时。洗涤3次后，收集细 胞并通过流式细
胞术分析。

[0064] Western免疫印迹。转染后四十八小时，用RIPA缓冲液(Sigma)裂解细胞，收集胞质 级分。与上样缓冲液温育后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)分离样 
品。在将一些样品应用于SDS‑PAGE之前，对它们进行Endo H或PNGase F处理。对于Endo H
(cat#P0702L，NEB)处理，首先通过在变性缓冲液中100℃加热10分钟使总共20μg的细 胞裂
解物变性。将变性蛋白加入到含有2μl GlycoBuffer和1000单位Endo H的20μl反应体 系
中，并在37℃温育1小时。对于PNGase F(目录号P0708L，NEB)处理，将相同量的细胞 裂解物
加入4μL PNGase F缓冲液(5X)中，以制备20μL总反应体积，并在80℃温育2分钟。 冷却后，
加入1μl快速PNGase F，样品在50℃温育10分钟。转移到PVDF膜上后，在室温 下用4％脱脂
乳封闭该膜1小时。将膜与第一抗体和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体 温育。或者，
将膜与HRP缀合的一抗一起温育。在与增强化学发光(ECL)底物(Thermo Fisher) 一起温育
后，将膜进行曝光检测。小鼠抗‑MARCH8抗体购自Proteintech；小鼠抗‑肌动蛋白， ‑HA，和‑
FLAG单克隆抗体购自Sigma；兔抗EBOV‑GP和兔抗IAV‑HA多克隆抗体购自Sino Biology(中
国)。小鼠抗HIV gp160、抗HIV gp120、抗HIV gp41和抗HIV p24/p55单克隆抗 体获自美国
NIH AIDS试剂程序。HRP偶联的抗人、抗兔或抗小鼠免疫球蛋白G二抗购自 Pierce。

[0065] 免疫沉淀。转染前12小时，在6孔板的每孔中接种总共5×105 293T细胞。转染后 48小时，用RIPA缓冲液裂解细胞。收集胞质级分并与抗FLAG抗体偶联的磁珠(Sigma)在4℃ 
温育过夜。通过磁架分离珠子，洗涤几次，并用于WB分析。

[0066] 病毒感染力测定。转染前12小时，在6孔板的每孔中接种总共5×105 293个T细胞。 用pNL4‑Luc‑ΔEnv、pcDNA3.1‑FLAG‑GPΔMLD和MARCH8表达载体转染细胞。转染后四 十八
小时，收集含有病毒体的上清液，并在40000g下进行超离心1小时。收集颗粒并用 WB分析。
Gag Gag
此外，收集100μl上清液用于通过p24  ELISA定量。使用含等量p24 的上清 液感染接种
于96孔板中的Vero细胞。再过48小时后，用PBS洗涤感染的细胞3次，并用 100μl RIPA缓冲
液裂解。收集25μl，与等量的Bright‑Glo荧光素酶分析系统(Promega)的底 物混合，用发光
计测定发光活性。

[0067] 实施例1：MARCH8下调来自细胞表面的EBOV GP

[0068] 我们使用EBOV GP来测试MARCH8是如何影响I类融合蛋白成熟和分 泌的。EBOV GP具有明确的N‑和O‑糖基化位点，并且重要的是，在缺失GP1 时病毒进入不需要的MLD区域
后，GP加工和O‑糖基化容易被检测到。EBOV 还表达几种不同的成熟和可溶的GP形式，其被
分泌或脱落到细胞外，这可通过 Western印迹(WB)容易地检测。因此，我们使用EBOV GP及
其具有MLD缺失 (ΔMLD)的突变体来研究MARCH8活性。

[0069] MARCH8在终末分化的骨髓细胞中表达，我们证实MARCH8在293T、 Vero、THP1和HeLa细胞中不表达(图1A)，这使得我们能够简单地通过异位表 达研究MARCH8的抗病毒活
性。首先，我们使用假型逆转录病毒测试了来自人 (h)、Bos taurus(b)和小鼠(m)的MARCH8
蛋白如何影响EBOV进入宿主细胞， 我们在J Biol Chem已经发表过的关于EBOV的研究表
明，本专利中所述假型逆 转录病毒系统用于研究EBOV GP功能是可靠的。所有这些MARCH8
蛋白与逆 转录病毒限制因子APOBEC3G(图1B)一样有效地限制假型病毒复制，为了研究 
MARCH8抗病毒机制，在GP△MLD和MARCH8的存在下产生EBOV病毒样 颗粒(VLP)和逆转录病
毒颗粒。MARCH8显著地减少GP组装到这些病毒粒子中 (图1C，图1D)。相反，它的RING结构域
失活的W114A突变体没有这种活性(图 1C)。通过共聚焦显微镜检查主要在细胞上上检测到
GP(图1E)，但是当通过流 式细胞术检测时，MARCH8以剂量依赖性方式从细胞表面显著下调
GP的表达 (图1F)。

[0070] 实施例2：MARCH8将EBOV GP滞留在高尔基体中

[0071] 为了证明GP是MARCH8的靶向位点，我们研究了GP和MARCH8在亚细 胞上的定位。首先，我们通过免疫沉淀法测试了它们的相互作用。GPΔMLD可 以特异性地与MARCH8共沉淀
(图2A，泳道1至3)，并且弗林蛋白酶furin可 以同时共沉淀GPΔMLD和MARCH8(图2A，泳道4
至6)。这些结果证明GP、 弗林蛋白酶和MARCH8在细胞中彼此相互作用。

[0072] 其次，我们建立双分子荧光互补法(BiFC)测定以跟踪它们在活细胞中的 相互作用。GP、MARCH8和弗林蛋白酶的C‑末端与绿色荧光蛋白Venus N‑末端 的2‑173个氨基酸
(VN)或其C‑末端的154‑238个氨基酸(VC)融合。当GP‑VC 与MARCH8‑VN或弗林蛋白酶‑VN一
起表达时，产生与MARCH8或弗林蛋白 酶重叠的绿色荧光信号(图2B)，证实GP与MARCH8或GP
与弗林蛋白酶之间 的相互作用。与在质膜上发现的单独GP不同(图1E)，GP‑MARCH8BiFC复
合 物在细胞内区室中被发现，证实MARCH8下调来自细胞表面的GP。此外，当 弗林蛋白酶‑
VN/GP‑VC对与MARCH8一起表达时，也检测到它们的共定位(图 2C)，证实这三种分子在活细
胞中形成复合物。

[0073] 接着，我们确定了MARCH8是如何影响GP和弗林蛋白酶在亚细胞定位 的。通过BiFC检测到弗林蛋白酶‑VN/GP‑VC对用ER标记钙联接蛋白(CNX)或 TGN标记表达。不管MARCH8是
否表达，GP‑弗林蛋白酶复合物都不与CNX 共定位(图2D)，相反，该复合物与TGN标记共定
位，TGN中的GP/Furin在BiFC 荧光信号被MARCH8强烈地增强(图2D)，这表明MARCH8在高尔
基体中保留 了EBOV GP。

[0074] 实施例3：MARCH8阻断EBOV GP蛋白的水解加工

[0075] 将全长GP和GPΔMLD与来自不同物种的MARCH8或其W114A突变体一 起表达，并且将GP通过WB处理来比较GP0和GP1表达水平从而进行分析。 由于高尔基体中MLD的高水平O‑
和N‑糖基化，GP1表现出比GP0更高的分子 量，而GP1ΔMLD表现出比GP0ΔMLD更低的分子量
(图3A，图3B)。另外， 与来自全长GP的GP0和GP1的相似水平不同，GP1水平比来自GPΔMLD的 
GP0高得多，从而证实GPΔMLD比全长GP更有效地处理。当MARCH8蛋白 被表达时，GP1蛋白从
全长GP和GPΔMLD中几乎都检测不到，表明MARCH8 阻断了GP的加工。W114A突变体也是无活
性的，表明RING结构域是该活性 所需的。

[0076] 为了测试MARCH8是否使GP1不稳定，用靶向不同降解途径的抑制剂处 理细胞，包括针对蛋白酶体的MG132、针对溶酶体的NH4Cl和bafilomycin A1 (BafA1)和针对ER相关蛋
白降解的DBeQ(ERAD)。这些抑制剂中没有一个拯救 GP1表达或增加GP0表达，表明GP1不经
过这几种途径降解(图3C)。人 MARCH8具有291个氨基酸(aa)，其在N‑末端胞质尾(CT)中产
生RING‑CH 指、两个TM结构域和C‑末端CT(图3E)。关键的W114残基在RING区，为了 揭示其
它重要的结构域，我们通过表达其1‑213aa、1‑247aa和1‑272aa区域， 产生了三个MARCH8的
C‑末端CT缺失突变体。当这些突变体与全长GP或 GPΔMLD一起表达时，WT和突变体1‑247和
1‑272阻断了GP加工，而1‑213 突变体没有(图3E)。然后将这些突变体与GFP标签融合，并比
较它们的亚细胞 定位。WT和1‑272突变体都在细胞质中显示分散的点状定位，而1‑213突变
体 扩散到整个细胞质中(图3F)，1‑247突变体部分扩散到细胞质中。这些结果表明 213‑
247区域决定了MARCH8的细胞内区室化，这对于其活性是关键的。

[0077] 实施例4：MARCH8阻断了由Nc‑和O‑聚糖对EBOV GP的修饰

[0078] 由于蛋白水解加工，GP糖基化的分析变得颇为复杂。为了检测GP糖基化， 我们通过去除GP1和GP2之间的弗林蛋白酶切割位点来阻断GP加工。最初， 我们通过阻断内源弗林
蛋白酶活性来测试弗林蛋白酶是否负责GP加工。人弗林 蛋白酶是具有大内腔区域的794‑
aa的I型TM蛋白，其具有信号肽(SP)、前结 构域(Pro)、枯草杆菌蛋白酶样催化结构域(CD)、
P结构域、富含半胱氨酸的区 域(CRR)、TM结构域和56‑aa CT(图4A)。CD和P结构域在功能上
对于弗林蛋 白酶转化酶活性是关键的。我们通过删除CD(114‑402aa)、P域(402‑587aa)和
三 个CD子域CD1(114‑210aa)、CD2(210‑305aa)和CD3(305‑402aa)创造了五个 弗林显性失
活突变体，包括ΔCD、ΔP、ΔCD1、ΔCD2和ΔCD3。当测试这五 个突变体对GP表达影响时，发
现它们都阻断GP从GP0到GP1的切割(图4A， 泳道2到6)，证实EBOV GP被弗林蛋白酶加工。一
致地，当它们的相互作用通 过免疫沉淀确定时，GP被WT和ΔP突变体共沉淀，但是不被那些
ΔCD、ΔCD1、 ΔCD2和ΔCD3突变体(图4A)共沉淀，这表明GP与弗林蛋白酶催化结构域相 
互作用。

[0079] 接下来，从全长GP和GPΔMLD产生两个弗林蛋白酶切割位点缺陷(ΔFR) 的突变体，并且通过用内切糖苷酶H(Endo H)和PNGase F处理来分析GP糖基 化，所述内切糖苷酶H
和PNGase F分别去除NH‑聚糖或所有N‑聚糖。GPΔFR 在170‑和130‑kDa处被检测到，并且GP
ΔMLDΔFR在90‑kDa和70‑kDa处被检 测到(图4B，泳道1，13)。所有这些蛋白都对PNGase F
敏感，证实了它们被 N‑聚糖修饰(图4B，泳道2，14)。在用该酶处理后，从GPΔFR中检测到了
～110 kDa的PNGase F抗性蛋白，证实GP而不是GPΔMLD被O‑聚糖修饰(图4B， 泳道2)。170‑
kDa GPΔFR和90‑kDa GPΔMLDΔFR对Endo H具有抗性(图4B， 泳道3，15)，表明它们被Nc‑
聚糖修饰。130‑kDa GPΔFR和70‑kDa GPΔMLDΔFR 对Endo H敏感(图4B，泳道3，15)，表明
它们是由Nh‑聚糖修饰的。当MARCH8 被表达时，仅检测到了Endo H敏感性130‑kDa GPΔFR
和70‑kDa GPΔMLDΔFR (图4B，泳道4至6，16至18)。

[0080] 通过使用具有活性弗林蛋白酶切割位点的全长GP和GPΔMLD来验证这些 结果。从全长GP中检测到更多的O‑糖基化GP蛋白，所述全长GP来自GP0和 GP1(图4B，泳道8)。所有
GP0蛋白都是敏感的，而所有GP1蛋白都是Endo H 抗性的(图4B，泳道9、21)，证实GP0和GP1
分别被Nh‑或Nc‑聚糖修饰。同样， MARCH8选择性地抑制了Endo‑H‑抗性和PNGase F‑敏感的
GP表达(图4B，泳 道10到12，22到24)。这些结果证明MARCH8阻断了由Nc‑和O‑聚糖而不是 
由Nh‑聚糖进行的GP修饰。

[0081] Nc‑和O‑聚糖对EBOV GP的修饰是弗林蛋白酶对其进行蛋白水解切割并 组装到病毒颗粒中是必需的。因为GP0被包装到EBOV病毒体中，GP△FR和 GP△MLD△FR与EBOV VP40
和MARCH8一起表达，并且比较它们在VLP中 的表达。我们再次证实MARCH8选择性地抑制具
有Nc‑和O‑聚糖的GP0的表达 (图4C，泳道1、2、4、5)。值得注意的是，在VLP中仅检测到具有
这两种聚糖 类型的GP0(图4C)，表明仅具有Nc‑和O‑聚糖的GP0蛋白被选择性掺入病毒颗 
粒中。

[0082] 当在本实验中用弗林蛋白酶代替MARCH8时，具有Nc‑和O‑聚糖的GP0 的表达也被抑制，但出现了另一个也被掺入病毒粒子的～55‑kDa的GP(图4C， 泳道3、6)。该55kDa GP的
产生比GPΔFR显著得多，并且在没有异位弗林蛋 白酶表达的情况下，从病毒颗粒中富集的
GPΔMLDΔFR也可以检测到(图4C， 泳道1)。因此，在MLD前的GP1中发现了新的弗林蛋白酶
299 302
切割位点 RKIR ， 将该新的55kDa蛋白质命名为GP1*(图5B)。这些结果证明弗林蛋白酶
选择性 地切割具有Nc‑和O‑聚糖的GP0。另外，因为GP1*能够整合到VLP中(图4C， 泳道1、3、
6)，所以推测仅完全糖基化的GP整合到病毒粒子中。

[0083] 为了理解GP1*是如何从野生型GP蛋白产生的，随着弗林蛋白酶的量增 加，全长GP表达的GP0水平没有变化。但GP1、GP1*的物质通过弗林蛋白酶 而以剂量依赖性降低或增加
(图4D)。这些结果表明，GP1的处理主要是利用弗 林蛋白酶对其进行处理。因为已经表明
GP1被Nc‑和O‑聚糖修饰，所以该结果 证实弗林蛋白酶选择性地加工完全糖基化的GP。

[0084] 实施例5：MARCH8阻断EBOVGP脱落和分泌

[0085] 细胞膜表面的GP1/GP2聚合体进一步被GP2近膜外部区域的TNFα转化酶 (TACE)切割，以释放可溶性GP脱落。为了验证MARCH8对EBOV GP成熟的 抑制作用，我们测试了MARCH8
如何影响GP脱落。在GP和GPΔMLD与 MARCH8或弗林蛋白酶一起表达之后，GP蛋白从上清液
中免疫沉淀并且通过 WB分析。MARCH8显著地阻断GP脱落，相反，弗林蛋白酶显著地增加GP
脱 落(图5A)。GP1*也作为可溶性蛋白质被检测到。

[0086] 除了GP之外，EBOV通过RNA编辑产生分泌型GP(sGP)和分泌型小 GP(ssGP)，所有这些都共享N‑末端295aa(图5B)。为了说明MARCH8如何影 响GP分泌，我们用MARCH8蛋白表达
sGP并测量其分泌。与其W114突变体 不同，MARCH8在细胞中保留sGP，并有效地减少了其分
泌(图5C，泳道9至 11)。接下来，我们仅表达GP1或GP1ΔMLD，来自不同物种的MARCH8蛋白 
显著增加了GP1和GP1ΔMLD在细胞中的表达，但是完全阻断了它们的分泌(图 5C，泳道1至
8)。

[0087] 实施例6：MARCH8阻断HIV‑1ENV和IAV HA成熟

[0088] 当HIV‑1ENV和H5N1HA与弗林蛋白酶和MARCH8一起表达时，弗林 蛋白酶与MARCH8一起共沉淀HIV‑1gp160或H5N1HA0(图6A)，证实MARCH8 与ENV/furin或HA/furin复合物相
互作用。当MARCH8与这些融合蛋白一起表 达时，HIV‑1gp120/gp41和H5N1HA1/HA2表达水平
都降低(图6B)，这证实了 MARCH8也阻断了由弗林蛋白酶对ENV和HA的切割。

[0089] 当用糖苷酶处理后分析ENV和HA糖基化时，它们都对PNGase F敏感(图 6C，泳道2和8)，证实它们被N‑聚糖修饰。HIV‑1gp160对Endo H完全敏感， 表明其被Nh‑聚糖修饰(图
6C，泳道3)。HIV‑1gp120对Endo H仅部分敏感(图 6C，泳道3)，表明其被Nh‑和Nc‑聚糖修饰。
H5N1HA0和HA1对Endo H完全 敏感或具有抗性(图6C，泳道9)，表明HA0和HA1分别被Nh‑或
Nc‑聚糖修饰。 当MARCH8表达时，由于弗林蛋白酶活性被抑制，gp120表达降低(图6C，泳 道
4)。此外，对Endo‑H敏感的HA0表达有所增加(图6C，泳道12)。这些结果 证明MARCH8不会阻
断ER中ENV和HA的Nh‑聚糖修饰。