一种两性霉素B的酯衍生物及其用途

摘要

本发明公开了一种两性霉素B的酯衍生物，拓宽了现有抗菌化合物的范围，可作为先导化合物继续优化。同时本发明化合物具有良好的抗菌活性，其抗菌活性比两性霉素B更好；相对于两性霉素B而言，具有更低的血液毒性和细胞毒性，在保持抗菌活性的同时可以减少两性霉素对于人体的毒副作用。

权利要求

1.一种式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其具有如下结构：

2.一种制备如权利要求1所述的式I化合物的方法，其反应路线如下：其中n＝4。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将两性霉素B和Fmoc‑Osu加入到反应溶剂中，以无水DMF 60mL和无水甲醇为混合溶剂，搅拌溶解后，滴加吡啶，室温避光反应，反应完成后，经后处理得到化合物1；

2)将化合物1和过量二醇类化合物 溶解在无水THF中,依次加入DMAP及DCC,通干燥氮气0.5h后，无水条件下，室温反应24h，反应结束后，经后处理得到化合物2；

3)在N,N,N',N'‑四甲基‑O‑(3,4‑二氢‑4‑氧代‑1,2,3‑苯并三嗪‑3‑基)脲四氟硼酸盐(TDBTU)和N,N‑二异丙基乙胺存在下，以N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，将D‑葡萄糖酸与化合物

2反应，待反应完成后，待反应完成后，将溶液滴加至乙醚中，析出固体，收集固体，乙醚洗涤固体、干燥；

取前述制备好的固体，加入到反应瓶中，以N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，搅拌溶解，加入哌啶，待反应完成后，将反应液滴加至冷的乙醚溶液中，析出固体产物，经柱层析纯化，得到目标产物式I化合物；

其中步骤(2)的二醇类化合物 的n＝4。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中两性霉素B与Fmoc‑Osu的摩尔比为：1:(2‑3)；

步骤2)中化合物1、DMAP和DCC的摩尔比为1:0.5‑2:2‑6；

步骤3)中化合物2与D‑葡萄糖酸的摩尔比为1:(0.8‑1.2)。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中两性霉素B与Fmoc‑Osu的摩尔比为1:2‑2.5；

步骤2)中化合物1、DMAP和DCC的摩尔比为1:0.5‑1.5:3‑4；

步骤3)中化合物2与D‑葡萄糖酸的摩尔比为优选为1:1。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1所述式I化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求6所述的药物组合物在制备用于控制或治疗真菌感染的药物中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，所述真菌感染由来自于酵母菌、丝状真菌或念珠菌属的菌株的病原真菌引起的。

9.如权利要求7所述的用途，所述真菌感染由来自于白色念珠菌菌株的病原真菌引起的。

说明书

一种两性霉素B的酯衍生物及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种两性霉素B的酯衍生物及其作为抗真菌剂的用途。

背景技术

[0002] 随着社会经济的高速发展，人民生活水平的日益提高，于此同时人类的生命健康也遭受着越来越大的威胁。大量药物的使用，在拯救人类生命的同时，也“培养”了一些越来
越难杀死的超级病菌，这些病菌对现存药物有着强大的耐药性；超级病菌不是特指某一种
病菌，而是泛指那些对多种抗生素具有耐药性的细菌，它的准确称呼应该是“多重耐药性细
菌”。这类病菌能对抗生素具有强大的抵抗作用，能逃避被杀灭的危险，人类生命将因此会
遭受极大的威胁。目前引起特别关注的超级细菌主要有：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
(MRSA)、耐多药肺炎链球菌(MDRSP)、万古霉素肠球菌(VRE)、多重耐药性结核杆菌(MDR‑
TB)、多重耐药鲍曼不动杆菌(MRAB)以及最新发现的携带有NDM‑1基因的大肠杆菌和肺炎克
雷伯菌等等。由于大部分抗生素对其不起作用，超级细菌对人类健康造成极大地危害，因此
对相关药物的研发应用已受到广泛的关注。

[0003] 近年来，由于免疫受损人群快速增多，还有恶性肿瘤、恶性血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、严重烧伤等发病，以及广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛使用，导管、插管和器官移
植等新技术的开展，使机会性深部脏器的真菌感染发病率越来越高，也越来越严重。上述人
群中深部真菌感染发生率约为11％‑40％，病死率为40％。深部真菌感染的发病率比浅表面
真菌感染低得多，但深部真菌感染更令人担忧，因为它们有着非常高的死亡率，每年大约有
150万人死于深部真菌感染。所有与真菌相关的死亡报告中，90％以上是由属于以下四个之
一的物种引起的：隐球菌、念珠菌、曲霉和肺孢子虫。而且，真菌感染的流行病学数据非常的
差，真菌感染经常会被误诊，因为我们极大地低估了深部真菌感染的危险性。

[0004] 当前抗菌药物按照其结构划分主要有：三唑类、多烯类、棘白菌素类、尼可霉素类、氟尿嘧啶类、β‑1,3‑D‑葡聚糖合成酶抑制剂、甘露糖糖蛋白合成抑制剂等多种。尽管推出了
新的抗真菌药物，如下一代唑类和棘球菌素，但多烯大环内酯仍然是临床上可用的最有效
的广谱抗真菌药物。其中最具有代表性的就是两性霉素B，两性霉素B(AMB)是治疗由多种真
菌引起的深部真菌感染的首选药物，也是人类当前抵御真菌侵害的最后一道防线；其抗菌
具有广谱活性且耐药性极低，临床上是治疗深部真菌感染的“黄金标准”。

[0005]

[0006] 两性霉素B在临床治疗真菌感染有着非常重要的作用，但是两性霉素B所具有的副作用也不容忽视，最严重的毒性反应是不可逆的肾毒性。此外还会有肝毒性、对红细胞的溶
血毒性，同时可引起发热、恶心、呕吐，厌食等症状。这些严重的副作用，严重限制了两性霉
素B在临床上使用的范围。为了解决这一突出问题，世界各地科研工作者对两性霉素B进行
各种方式的结构修饰，以期在保留抗菌活性的同时，能显著降低两性霉素B对人体细胞的毒
性。现在修饰方法主要可以分为两类，一类是制备新型制剂：将两性霉素B用单层或多层脂
质双分子膜包被，用来增加两性霉素B的水溶性，进而增加聚集浓度，从而降低其肾毒性、肝
毒性，细胞溶血性。当前已有多种两性霉素B脂质体用于临床，在临床表现上其毒性已经降
低。但是其残存毒性对人体的影响还是较大，且两性霉素B脂质体制造过程复杂，成本较高，
保存条件苛刻，使用过程需配有其它辅助条件，因此使用两性霉素B脂质体治疗的成本比较
高，不适合临床上广泛应用。另一类是化学修饰：通过对两性霉素B分子各官能团进行修饰，
得到了一系列两性霉素B衍生物，并对衍生物进行抗菌活性和肾毒性、红细胞溶血毒性等相
关测试，大部分衍生物与两性霉素B相比抗菌活性相对保持，对肾细胞毒性和红细胞溶血毒
性均有不同程度的降低。

[0007] Jolanta,G.等在两性霉素B的氨基位置上引入一个D‑果糖基团，以此来大幅增加两性霉素B的水溶性，同时其与天冬氨酸成盐提高水溶性，不易在水中聚集，毒性降低。体外
活性比AMB低2倍，但是溶血毒性却降低了125倍。最近一些研究者为了解决两性霉素B口服
给药的问题，在两性霉素B的氨基上引入不同的多糖，来大幅提升两性霉素B的水溶性，同时
其肾毒性、溶血毒性均有不同程度的降低。但是此类修饰方法也存在一些问题，利用天然多
糖如壳聚糖、海藻酸、阿拉伯树胶、果胶等修饰时，由于分子量、分枝、糖苷键类型和溶解度
等物理性质的不一致，难以分离纯化，它们中的许多都被蛋白质污染，去除蛋白质是防止免
疫反应的关键。后来科研工作者利用单糖合成葡聚糖、聚半乳糖、多甘露糖等，然后与两性
霉素B进行共价键偶连，其与天然多糖达到相同效果，同时人工合成的多糖分子量、分支、糖
苷键类型可控，解决了天然多糖存在的弊端，表现出良好的应用前景。但是化学合成的多糖
其分子量可控制于某一范围，研究者对其与两性霉素B共价键结合的方式，衍生物释放两性
霉素B的效率等问题还需要进一步去探究。同时研究发现，两性霉素B糖胺上具有可质子化
的N原子对于抗菌活性具有重要作用，利用多糖修饰氨基，会影响两性霉素B与麦角甾醇的
结合能力，降低抗菌活性。

[0008] 现有技术报道了一种利用两性霉素B异构体28,29‑Didehydronystatin A1(S44HP)分子进行结构修饰得到一种S44HP衍生物。S44HP与两性霉素B相比其抗菌活性相
似，对肾细胞和红细胞都具有较强的伤害。科研工作者对S44HP进行结构修饰，在羧基位置
上以酰胺键连接引入一个多羟基醇的分子，得到S44HP的衍生物，对其进行相关活性测试发
现，衍生物与两性霉素B以及S44HP相比，抗菌活性相对保持。但是测试发现，其对人红细胞
具有强的溶血毒性，不适合于进一步研究拓展。

[0009]

[0010] US2017/0042923A1报道了一种降低毒性的抗真菌分子缀合物，该类化合物在保持抗菌活性的同时，不仅可以降低抗微生物剂存在的毒性，还可以解决此类药物存在运输不
善的问题。

[0011]

[0012] 综上所述，虽然目前已有文献报道了多种对于两性霉素B的结构改造，但是仍有必要开发新的两性霉素B衍生物，使其在保持抗菌活性的同时，又可以降低其肾毒性、红细胞
溶血毒性等，并且还可以解决两性霉素B水溶性差的问题。

发明内容

[0013] 为了克服现有技术中两性霉素B存在的肾毒性肝毒性、对红细胞的溶血毒性等技术问题，第一方面，本发明提供了一种如式I所示的两性霉素B的酯衍生物：

[0014]

[0015] 或其药学上可接受的盐；

[0016] 其中：n选自2‑6的整数；

[0017] 优选地，n选自3‑5的整数；

[0018] 特别地，式I化合物的结构如下：

[0019]

[0020] 在本发明的第二方面，提供了一种上述式I化合物的制备方法，其反应路线如下：

[0021]

[0022] 其包括如下反应步骤：

[0023] 1)将两性霉素B和Fmoc‑Osu加入到反应溶剂中，以无水DMF(60mL)和无水甲醇为混合溶剂，搅拌溶解后，滴加吡啶，室温避光反应，反应完成后，经后处理得到化合物1；

[0024] 2)将化合物1和过量二醇类化合物 溶解在无水THF中,依次加入DMAP及DCC,通干燥氮气0.5h后，无水条件下，室温反应24h，反应结束后，经后处理得到化合物2；

[0025] 3)在N,N,N',N'‑四甲基‑O‑(3,4‑二氢‑4‑氧代‑1,2,3‑苯并三嗪‑3‑基)脲四氟硼酸盐(TDBTU)和N,N‑二异丙基乙胺存在下，以N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，将D‑葡萄糖酸与化
合物2反应，待反应完成后，待反应完成后，将溶液滴加至乙醚中，析出固体，收集固体，乙醚
洗涤固体、干燥；

[0026] 取前述制备好的固体，加入到反应瓶中，以N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，搅拌溶解，加入哌啶，待反应完成后，将反应液滴加至冷的乙醚溶液中，析出固体产物，经柱层析纯化，
得到目标产物式I化合物。

[0027] 优选地，步骤1)中两性霉素B与Fmoc‑Osu的摩尔比为：1:(2‑3)，优选为1:2‑2.5，最优选为1:2.25；

[0028] 步骤2)中化合物1、DMAP和DCC的摩尔比为1:0.5‑2:2‑6，优选为1:0.5‑1.5:3‑4，最优选为1:1:3；

[0029] 步骤3)中化合物2与D‑葡萄糖酸的摩尔比为：1:(0.8‑1.2)，优选为1:1。

[0030] 本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

[0031] 本发明另一方面涉及一种式I化合物及其药学上可接受的盐或包含其药物组合物在制备用于控制或治疗真菌感染的药物中的用途；

[0032] 优选地，所述真菌感染由来自于酵母菌、丝状真菌或念珠菌属的菌株的病原真菌引起的。尤其是，所述真菌感染由来自于白色念珠菌、热带念珠菌或克鲁斯念珠菌菌株的病
原真菌引起的。

[0033] 定义：

[0034] 在某些实施方案中，药学上可接受的形式是药学上可接受的盐,药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。药学上可接受的盐的实例是诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、高氯
酸、乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、
草酸、乳酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等与化合物形成盐的形式。

[0035] “药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂不破坏公开的化合物的
药理学活性，并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时是无毒的。药物活性物质的
所述介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。

[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0037] (1)本发明提供了一类新的两性霉素B酯衍生物，拓宽了现有抗菌化合物的范围，可作为先导化合物继续优化；

[0038] (2)本发明化合物具有良好的抗菌活性，其抗菌活性比两性霉素B更好；

[0039] (3)本发明化合物相对于两性霉素B而言，具有更低的血液毒性和细胞毒性，在保持抗菌活性的同事可以减少两性霉素对于人体的毒副作用；

[0040] (4)本发明化合物有效改善两性霉素B的水溶性，提高生物利用度。

具体实施方式

[0041] 下面通过实施例来具体说明本发明的内容。在本发明中，以下实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特
殊说明，均可从商业途径得到。

[0042] 实施例1

[0043] 1)称取两性霉素B(1.033g，1.12mmol)、Fmoc‑Osu(0.852g，2.52mmol)，加入到250mL圆底烧瓶中，以超干DMF(60mL)和甲醇(30mL)为混合溶剂，搅拌溶解后，滴加吡啶
(99％，0.85mL)。氮气氛围下室温避光反应24小时。薄层色谱监控反应进程，待反应完成后，
减压蒸馏除去大部分溶剂。然后将其滴加至冷的乙醚(200mL)溶液中中，析出浅黄色固体，
离心或减压抽滤收集粗产物。快速柱层析纯化，得到1.05g化合物1，收率：81.8％；m/z：
+
1145.5[M‑H]。

[0044] 2)将化合物1(575mg，0.5mmol)和1,4‑丁二醇(360mg，4mmol)溶解在10mL无水THF中,依次加入DMAP(61.0mg,0.5mmol)及DCC(390mg，1.5mmol),通干燥氮气0.5h，无水条件
下，室温反应24h，反应结束后,过滤除去固体，滤液用甲苯沉淀,过滤,烘干，快速柱层析纯
化得到373mg化合物2，收率：61.2％；m/z：1219.1。

[0045] 3)称取葡萄糖酸(19.6mg，0.1mmol)，化合物2(122mg，0.1mmol)溶解在5mL无水THF中,依次加入DMAP(12.2mg,0.1mmol)及DCC(61.8mg，0.3mmol),通干燥氮气0.5h，无水条件
下，室温反应24h，反应结束后,过滤除去固体，滤液用甲苯沉淀,过滤,烘干，此步无需进一
步纯化，可进行下一步反应。

[0046] 取上述制备好的粗产物，加入到25mL圆底烧瓶中，以N,N‑二甲基甲酰胺(4mL)为溶剂，搅拌溶解。加入哌啶(0.8mL)，薄层色谱监控反应进程，待反应完成后，将反应液滴加至
冷的乙醚(200mL)溶液中，析出固体产物。经柱层析(DCM:MeOH：H2O＝20:10:1)纯化，得到
+
44.4mg目标产物，收率：37.8％；m/z：1173.1[M‑H]。

[0047] 1H‑NMR(400MHz,CD3OD:CDCl3＝2:1,ppm):6.69‑5.90(m,14H),5.61‑5.22(m,2H),4.98‑4.10(m,7H),3.94‑3.51(m,7H),3.49‑3.19(m,9H),2.80‑2.11(m,4H),2.11‑1.25(m,
22H),1.22(d,J＝6.3Hz,3H),1.15(d,J＝6.3Hz,3H),1.03(d,J＝7.1Hz,3H).

[0048] 实施例2体外活性测试

[0049] 根据标准方法(National Committe forClinical Laboratory Standards)，在96孔微孔板中，在缓冲介质RPMI 1640pH 7.0中，使用连续稀释的方法以测定体外抗真菌活
性。在波长λ＝531nm(A531)处，使用微孔板读数器测定细胞悬浮液的光密度。在获得的结果
的基础上，制作A531值和检测化合物的浓度之间的关系图。从这些图表中，读取IC50值，这
是测试化合物的内插浓度，在该值处，A531值恰好是对照样品的A531值的50％。此外，MIC值，
其是测试化合物的最低浓度，在该值处，A531值是对照样品的测得A531值的最多20％。

[0050] 按已知的方法(Slisz,M.,et al.,E.,J Antibiot,57:669‑678(2004))通过连续7
稀释法进行血液毒性测定。将人红细胞悬浮于盐水溶液中以获得2×10/ml的悬浮细胞密
度。将合适量的化合物稀释液加入到试管内的细胞悬浮液中并在37℃孵育30分钟，然后离
心(4℃)。在红细胞悬浮液离心后，通过测量在波长λ＝540nm(A540)处的吸光度，测定上清液
中的血红蛋白浓度。在0.1％Tritone X‑100(对照样品)存在下，细胞悬液孵育后得到最大
水平的溶血。在获得的结果的基础上，制作A540值与检测化合物的浓度之间的关系图。从这
些图表中，读出化合物的内插浓度EH50值，其A540值正好是对照样品的测得A540值的50％。测
试衍生物的最大浓度不能超过100μg/ml，以保持在实验条件下的充分溶解度。在化合物的
最大浓度下，其表现出特别低的血液毒性，不可能测定EH50值，在这种情况下，血液毒性指定
为EH50＞100μg/ml。相应的测试结果见下表：

[0051]

[0052] 由上表可知，本发明的化合物相对于两性霉素B而言，其抗菌效果提高的同时，可以显著降低其血液毒性，具有良好的开发应用前景。

[0053] 实施例3对哺乳动物细胞的细胞毒性测试

[0054] 用于检测的细胞系：CCRF‑CEM‑人急性淋巴细胞白血病；HepG2‑人恶性肝癌、LLC‑PK1‑猪肾脏的上皮细胞；所有细胞系均来自商业购买。

[0055] 在RPMI 1640+10％胎牛血清(FBS)培养基中培养CCRF‑CEM细胞，在培养基199+3％FBS培养基中培养LLC‑PK1细胞，在MEM+10％FBS培养基中培养HepG2细胞。所有培养基包含
4
100μg/ml的青霉素G和链霉素。将1.2×10 细胞/孔的量的细胞接种在含有适当的培养基的
24‑孔微孔板中，并静置过夜。接着，以10μl的体积(系列2x稀释)加入测试化合物，其作为二
甲基亚砜(DMSO)中的溶液。向对照孔中加入10μl的DMSO。在95％/5％CO2的气氛，在37℃的
温度孵育具有细胞悬浮液的微孔板120小时。孵育后，向所有孔中加入200μl的3‑(4，5‑二甲
基三唑‑2‑基)‑2，5‑二苯基四唑溴化物(MTT)的PBS溶液(4mg/m1)，并将板在37℃再培养4h。
接着，加入1ml DMSO以溶解甲月替晶体并且使用微板读数器(Victor3，Perkin‑Wallac)在
波长λ＝540nm(A540)处测定溶液的吸收。在获得的结果的基础上，制作A540值与检测化合
物的浓度之间的关系图。从这些图表，读取IC50值，即存在的测试化合物的A540值是对照样
品中测得的A540值的一半时的浓度。所得到的结果如下表所示：

[0056]

[0057] 由上表可知，本发明的化合物对于动物细胞具有较低的毒性，相对于两性霉素B具有更低的副作用。