一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段转让专利
申请号 : CN202010740319.3
文献号 : CN111793129B
文献日 : 2021-09-24
发明人 : 黄竞荷 , 吴凡 , 刘梅
申请人 : 上海市公共卫生临床中心
摘要 :
权利要求 :
1.一种抗体,或其抗原结合片段,包含重链可变区和轻链可变区,其特征在于:条件a):重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的重链可变区的CDR1序列、如SEQ ID NO.2所示的重链可变区的CDR2序列以及如SEQ ID NO.3所示的重链可变区的CDR3序列;
条件b):轻链可变区包含如SEQ ID NO.4所示的轻链可变区的CDR1序列、如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区的CDR2序列以及如SEQ ID NO.6所示的轻链可变区的CDR3序列;
所述抗体或其抗原结合片段同时满足条件a)和b)。
2.如权利要求1所述抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述重链可变区具有第一氨基酸序列或具有与所述第一氨基酸序列有80%以上的序列同源性的序列;
所述轻链可变区具有第二氨基酸序列或具有与所述第二氨基酸序列有80%以上的序列同源性的序列;
所述第一氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述第二氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.如权利要求2所述抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体或其抗原结合片段的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.如权利要求1至3中任意一项所述抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体或其抗原结合片段为特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求4所述抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体或其抗原结合片段为冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
6.如权利要求5所述抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体为单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体为全人源单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种或几种的组合。
9.如权利要求1所述的抗体,或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗原结合片段为Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2或单链抗体。
10.一种核酸分子,其特征在于:所述核酸分子编码如权利要求1至9中任意一项所述的抗体,或其抗原结合片段。
11.如权利要求10所述的核酸分子,其特征在于:所述核酸分子中,编码所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.9所示。
12.如权利要求10所述的核酸分子,其特征在于:所述核酸分子中,编码所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
13.如权利要求10所述的核酸分子,其特征在于:所述核酸分子中,编码重链的核酸序列如SEQ ID NO.13所示,编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO.14所示。
14.包含如权利要求10至13中任意一项所述核酸分子的载体。
15.包含如权利要求14所述载体的宿主细胞。
16.如权利要求15所述宿主细胞,其特征在于:所述宿主细胞为293细胞。
17.一种药物组合物,其特征在于:所述药物组合物包含如权利要求1至9中任意一项所述的抗体,或其抗原结合片段。
18.如权利要求1至9中任意一项所述抗体,或其抗原结合片段,或者如权利要求17所述的药物组合物,在制备治疗或预防SARS‑CoV‑2、SARS‑CoV或类SARS冠状病毒所导致的疾病的药物方面的用途。
19.一种检测产品,其特征在于:所述检测产品包含如权利要求1至9中任意一项所述的特异性结合冠状病毒的抗体,或其抗原结合片段。
20.一种生产如权利要求1至9中任意一项所述的特异性结合冠状病毒的抗体,或其抗原结合片段的方法,其特征在于:培养如权利要求15所述的宿主细胞,以生产所述的抗体,或其抗原结合片段。
说明书 :
一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段
技术领域
其抗原结合片段制备治疗或预防冠状病毒所导致的疾病的药物方面的应用,以及在检测产
品方面的应用,属于生物医药领域。
背景技术
已扩散至全球各地,形成世界范围大流行。截止至2020年7月1日,SARS‑CoV‑2冠状病毒已在
全球范围内累计造成超过1000万例感染,其中超过50万人死亡,给全世界的公共卫生安全
带来严峻挑战。
蛋白,简称S蛋白),在病毒感染过程中被细胞内的蛋白酶水解成S1和S2两部分。其中S2是跨
膜蛋白,S1具有识别和结合细胞受体血管紧张素转换酶‑2(ACE‑2)的受体结合区(Receptor
Binding domain,简称RBD)。S1和S2构成的刺突蛋白是SARS‑CoV‑2病毒特异性识别、结合靶
细胞受体,并介导病毒感染的病毒受体,同时也是待开发的中和抗体的识别靶点。
复人血浆,可有效中和病毒,防止病毒在体内各器官扩散,对病人病程的转归也起了重要作
用。但多抗血浆不仅来源有限,同时其临床应用也受到诸如难以质控、供受体血型差异、潜
在的传染性因子等条件的限制。从新冠肺炎康复者体内分离可中和SARS‑CoV‑2病毒的全人
源单克隆抗体,可有效克服上述问题,是目前新冠病毒药物开发的主要方向之一。
阶段。这些研究团队所采用的技术方法是利用重组表达的SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白或S蛋白
受体结合区(RBD)为钓饵,从康复者外周血中筛选分离出可结合这些蛋白的B细胞(记忆B细
胞),利用细胞测序或单细胞测序的方法获得单个B细胞所表达抗体的重链和轻链配对基
因,通过体外重组的方式表达出抗体后,再对其中和病毒的能力进行验证。由于该方法在进
行抗体基因测序前,利用标记蛋白(上述被称作钓饵的重组表达的SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白
或S蛋白受体结合区)预先对B细胞进行筛选和富集,因此只有特异性结合标记蛋白的抗体
才能被筛选出来。
中分离全人源单克隆抗体,其流程为:首先利用SARS‑CoV‑2和SARS‑CoV假病毒中和体系检
测新冠肺炎康复者血清的中和抗体,筛选出对SARS‑CoV‑2和SARS‑CoV同时具有较高中和活
性的康复者;然后采集康复者的外周血淋巴细胞,利用流式细胞分选出记忆性B淋巴细胞;
将单个B细胞接种到384孔板中,并加入细胞因子和饲养细胞培养,培养的B细胞在体外扩增
分化后分泌抗体到上清中。然后利用体外高通量中和实验检测上清中的抗体对SARS‑CoV‑2
和SARS‑CoV病毒的中和能力,筛选出可同时中和这两种病毒的阳性克隆,利用RT‑PCR的方
法克隆出抗体的重链和轻链可变区,并构建至抗体重链、轻链表达载体后,转染293T细胞表
达纯化出单克隆抗体。
乏结合和中和能力,说明这些抗体特异性结合于SARS‑CoV‑2病毒的非保守区域。由于SARS‑
CoV‑2病毒是RNA病毒,在传播流行过程中病毒的基因组序列容易产生突变。当这些抗体所
识别的非保守区域位点发生突变,产生新的流行毒株时,会导致抗体失去对突变病毒的保
护效果。
发明内容
CDR1序列、如SEQ ID NO.2所示的重链可变区的CDR2序列以及如SEQ ID NO.3所示的重链可
变区的CDR3序列;
CDR1序列、如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区的CDR2序列以及如SEQ ID NO.6所示的轻链可
变区的CDR3序列;
生序列的同一性百分比。
守序列部分的氨基酸增减或替代,获得的变体与第一氨基酸序列具有较高的同源性(80%
以上的同源性),且保留原有的抗体功能,即与冠状病毒特异性结合的功能和性质,这些变
体也落入本发明的保护范围之内;同样的,上述轻链可变区可以在第二氨基酸序列的基础
之上进行氨基酸的增减或替代,例如相似氨基酸的替代或少量氨基酸的增减,特别是在保
守序列部分的氨基酸增减或替代,获得的变体与第二氨基酸序列具有较高的同源性(80%
以上的同源性),且保留原有的抗体功能,即与冠状病毒特异性结合的功能和性质,这些变
体也都落入本发明的保护范围之内。
所示。
病毒感染靶细胞的能力;在本申请中,冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段是指结合冠
状病毒的S蛋白的抗体或其抗原结合片段。
性。例如,常见的化学修饰有糖基化修饰和聚乙二醇化修饰等。其中,例如,可以在重链或轻
链可变区进行糖基化修饰,增加一个或多个糖基化位点,以改善抗体的部分功能,例如增强
抗体的免疫原性或改善抗体的药物动力学等。例如,在合适的条件下,将抗体或其抗原结合
片段与活性的聚乙二醇(例如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物)进行酰化反应或烷基化反应
实现聚乙二醇化修饰,以改善抗体的部分功能,例如增加抗体的生物(如血清)半衰期等。上
述的化学修饰不显著改变本发明抗体或其抗原结合片段的基本功能和性质,即与冠状病毒
特异性结合的功能和性质;这些经过化学修饰后的变体也落入本发明的保护范围之内。
点的作用或其他性能;上述的抗体,或其抗原结合片段与其他因子缀合形成的复合物,落入
本发明的保护范围之内。
件在宿主细胞内得以表达。载体可以包含多种控制表达的元件,例如启动子序列、转录起始
序列、增强子序列、选择元件及报告基因等。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还有可
能包括协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。
在本发明的实施方案中,载体可以选自,但不限于:质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体(如
酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC或P1来源的人工染色体PAC)、噬菌体(如λ噬菌体
或M13噬菌体)以及用作载体的动物病毒,例如,逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关
病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如
SV40)。
NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞等动物细胞模型。
释剂,与治疗有效量的所述抗体,或其抗原结合片段组合,施用于患者,用于治疗或预防冠
状病毒所导致的疾病。
量的上述的抗体,或其抗原结合片段的药物组合物。优选的,冠状病毒所导致的疾病是
SARS‑CoV‑2、SARS‑CoV或类SARS冠状病毒所导致的疾病。
落入本发明的保护范围之内。
片段之间的免疫反应。
病毒等具有广谱的中和能力,未来具有良好的临床应用前景。
附图说明
具体实施方式
变换均包含在本发明的保护范围内。
全面和完整,并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版,科学出版社)或按照产品说明书进
行。
筛选,发现其中一名轻症患者的血清对于SARS‑CoV‑2假病毒中和活性很强,经发明人所在
单位伦理委员会及患者本人书面同意,抽取其外周血进行研究。
巴细胞,操作过程参见淋巴细胞分离液说明书。
(Jackson Immunoresearch)、IgD‑FITC(BD Bioscience)和IgM‑PE(Jackson
Immunoresearch)构成的混合物;染色后,用10ml PBS‑BSA缓冲液洗涤,并重悬浮在500μl
PBS‑BSA中;最后用FACSAria III细胞分选仪(Becton Dickinson)分选出CD19+IgA‑IgD‑
IgM‑记忆B细胞。
细胞/孔的密度接种在384孔微量滴定板中(终体积为50μl),孵育13天;生长因子IL‑2和IL‑
21刺激记忆B细胞分裂生长,分泌抗体到孵育的培养液中。具体培养方法见参考文献Huang
J et al.Nature Protocols 2013,8(10):1907‑15。
拟SARS‑CoV‑2、SARS‑CoV病毒对宿主细胞(如人肝癌细胞系Huh‑7、稳定表达人ACE2受体的
293T细胞系293T‑ACE2)的感染过程,并在感染细胞内表达荧光素酶报告基因。由于假病毒
感染无法产生成熟的病毒颗粒,因此可以安全地在生物安全二级实验室内进行相关操作。
SARS‑CoV的S基因序列根据NCBI GenBank序列NC_045512和ABD72979.1设计,基因序列经密
码子优化后,由南京金斯瑞公司合成,并连接到pcDNA3.1真核表达载体构建成SARS‑CoV‑2
和SARS‑CoV S蛋白表达质粒。pNL4‑3.Luc.R‑E‑骨架质粒源自美国NIH AIDS Reagent
Program。所有质粒通过转化DH5α感受态细胞扩增,并利用美基生物生产的质粒纯化试剂盒
纯化,纯化操作过程参照试剂盒说明书。
3.Luc.R‑E‑)与表达SARS‑CoV或SARS‑CoV‑2质粒以3:1的比例共转染293T细胞,详细转染方
法参见EZ Trans细胞转染试剂的使用说明书。转染48小时后,收取含有假病毒的上清液,
1500转离心10分钟去除细胞碎片后并分装冻存于‑80℃冰箱,用于中和抗体的检测。
毒的上清液,在384孔细胞培养板中混合,室温孵育30分钟后,每孔加入50μl 5000个293T‑
ACE2细胞并继续在细胞培养箱内培养。48小时后,利用荧光素酶检测试剂盒(Luciferase
Assay System,Promega Cat.#E1500)裂解细胞并检测每孔的荧光素酶活性,具体检测方法
参照试剂盒说明书。利用多功能酶标仪(Perkin Elmer)检测每孔化学发光RLU值。根据培养
上清与病毒对照RLU值的比例计算培养上清对假病毒的中和抑制百分比,筛选出抑制百分
比大于90%的孔作为病毒中和阳性孔。
2018,329:112–124.扩增获得的抗体重链和轻链可变区基因经琼脂糖凝胶电泳纯化回收
后,利用PMD19‑T vector克隆试剂盒(Takara 6013)克隆到PMD19‑T载体中,具体操作过程
参见试剂盒说明书,并挑选出单克隆进行基因测序。
DH5α感受态细胞构建抗体表达重链质粒;测序正确的抗体轻链可变区基因与pCMV/R‑10E8
轻链基因(NIH AIDS Reagent Program Cat 12291)分别经Age I和Xho I酶切后,连接胶纯
化回收后的目的片段并转化DH5α感受态细胞构建抗体表达轻链质粒;抗体重链、轻链质粒
经质粒纯化试剂盒(美基生物)纯化(参见图1为表达纯化的抗体SDS‑PAGE检测结果),并利
用EZ Trans细胞转染试剂(李记生物)以1:1的比例共转染293T细胞表达。72小时后,收集细
胞转染上清,利用protein‑G柱(天地人和生物科技公司,常州)纯化上清中的抗体IgG,纯化
方法参照protein‑G柱的使用说明。纯化获得的抗体IgG(命名为单抗GW01)利用Nanodrop
2000(Thermo Fisher)测定280nm吸光值并计算抗体浓度。
封闭1小时。PBS‑T洗板3次,将单抗GW01用PBS稀释液(PBS,5%FBS,2%BSA,1%Tween‑20)进
行5倍系列稀释后,取100μl样本加入到ELISA板中,37℃孵育1小时。PBS‑T洗板5次,每孔加
入100μl用PBS稀释液1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体(Jackson
Immunoresearch),室温孵育1小时。PBS‑T洗板5次,加入150μl ABTS显色底物(Thermo
Fisher),室温避光显色30分钟后,通过酶标仪读取405nm波长的吸光度值。
的单抗GW01对于冠状病毒有广谱中和能力。
进行。
秒获得检测基线;2)捕获抗体,将探针浸入10μg/ml的GW01抗体溶液中作用200秒捕获抗体;
3)再次调零,将探针浸入缓冲液(加入0.02%Tween20的PBS溶液)中作用120秒去除未结合
的抗体;4)结合RBD,将探针浸入起始浓度为111.1nM、3倍梯度稀释的RBD蛋白溶液中,作用
300秒得到单抗GW01与RBD结合的动态曲线;5)结合解离,将探针放入缓冲液中作用300秒。
蛋白的结合引起生物膜厚度的变化,导致干涉光波发生相对位移,被光谱仪检测到,形成干
涉光谱,以干涉图谱的实时位移(nm)显示出来。以此检测RBD与本申请的单抗GW01结合解离
的动态曲线。在数据分析时样本孔的数据减去缓冲液对照孔的数据,扣除缓冲溶液的非特
异性干扰,采用1:1结合模型,对不同的RBD稀释浓度下与GW01的结合进行整体曲线拟合,得
到平均结合常数Kon、解离常数Koff以及亲和力常数KD值。
RBD的结合后进行解离,解离的RBD非常少,KD值为(0.65±0.02)nM,显示本申请的单抗GW01
与SARS‑CoV‑2的RBD保守区域有非常强的亲合力。由此可以推断,本申请的单抗GW01对于
SARS‑CoV‑2病毒的RBD保守区域有非常强的中和活性是由于本申请的单抗GW01对于冠状病
毒的RBD保守区域有非常高亲和力的结果。结合图2和图3的结果,进一步验证了本申请的单
抗GW01对于冠状病毒有广谱中和能力。
RS3367病毒的中和能力。
积含100TCID50的假病毒稀释液混合,在37℃孵育1小时;3)弃掉细胞培养液,每孔加入50μl
病毒抗体复合物,设置复孔,同时设置无抗体组,无病毒组及阳性血清对照组;4)培养12小
时后,每孔加入150μl维持液,37℃继续培养48h;5)利用荧光素酶检测试剂盒(Luciferase
Assay System,Promega Cat.#E1500)裂解细胞并检测每孔的荧光素酶活性,具体检测方法
参照试剂盒说明书;利用多功能酶标仪(Perkin Elmer)检测每孔化学发光RLU值;6)根据抗
体与病毒对照RLU值的比例计算不同浓度抗体对假病毒的中和抑制百分比,并利用PRISM7
软件(GraphPad)计算出抗体抑制病毒的半数抑制剂量IC50。
抗GW01对冠状病毒具有很强的广谱中和能力。
述的一种或多种抗体来治疗或预防冠状病毒感染,从而降低或消除冠状感染。
求保护的特异性结合冠状病毒的抗体及其抗原结合片段,也可用于检测产品,即筛查SARS‑
CoV‑2冠状病毒感染的检测产品,如检测试剂盒)。
并可经熟练的临床医生决定。
或新生婴儿)。可将另外药物如抗病毒剂在施用所公开的药剂同时、之前或之后施用于对
象。通过本领域已知的任何方法如口服施用、吸入、静脉、肌肉、腹膜内或皮下来实现施用。
为预防、降低,抑制和/或治疗对象的状况,而施用的组合物的量取决于正在治疗的对象、病
症的严重程度和治疗对象的施用方式。理想地,药剂的治疗有效量是足以预防、降低、和/或
抑制、和/或治疗对象的状况而不引起对象中实质性细胞毒性效应的量。有效量可容易地由
本领域技术人员例如用建立剂量应答曲线的常规试验来确定。同样地,这些组合物可用惰
性稀释剂或药学上可接受的载体配制。在一个具体实例中,根据SARS‑CoV‑2病毒感染的特
定阶段,每两周以5mg每kg或每两周10mg每kg施用抗体。在一实例中,连续施用抗体。在另一
实例中,以50μg每kg施用抗体或抗体片段,每周两次,持续2‑3周。治疗组合物可长期施用
(如持续几个月或几年时间)。
对对象进行一次或多次分析。采用本领域已知的任何方法监控对象。例如,可获得来自对象
的生物样品包括咽拭子,并对SARS‑CoV‑2病毒水平的变化进行评估。
明书作为一个整体,各实施方式中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可
以理解的其他实施方式。
或变更均应包含在本发明的保护范围之内。