PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用

摘要

本发明提供PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用，PGAM1别构抑制剂HKB99能够显著抑制肺腺癌及其耐药细胞增殖和迁移，且对正常支气管上皮细胞影响较小，具有良好的选择性；体内实验发现HKB99能抑制人肺腺癌皮下瘤生长和肿瘤转移。HKB99有望成为高效、低毒的抗肿瘤新药，为PGAM1抑制剂联合厄洛替尼治疗肺腺癌提供实验理论依据。

权利要求

1.PGAM1别构抑制剂HKB99与抗肺腺癌药物联合用药在制备治疗肺腺癌药物中的应用，

其特征在于，所述抗肺腺癌药物是指厄洛替尼，所述HKB99的结构式如下：

说明书

PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及技术药物化学领域，尤其涉及PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

背景技术

[0002] 磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1，PGAM1)是肿瘤细胞有氧糖酵解通路中的重要酶，催化其底物3‑磷酸甘油酸(3‑phosphoglycerate，3‑PG)转化为2‑磷酸
甘油酸(2‑phosphoglycerate，2‑PG)，不仅能调控糖酵解速率，同时还通过调控3‑PG和2‑PG
的浓度，参与调控磷酸戊糖途径和丝氨酸合成通路，进而影响整个代谢网络。PGAM1表达与
活性异常升高，在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，有望作为抗肿瘤新靶标，设计并筛选
出高活性、高特异性的PGAM1抑制剂已受到越来越多研究者的关注。

[0003] 代谢重编程已成为肿瘤的重要特征之一，在细胞癌变过程中有氧糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等多个代谢途径发生了显著变化，不仅能提供肿瘤生长所需的能量，其代
谢中间产物也为蛋白质、脂肪、核酸等生物大分子合成提供原料，使肿瘤形成依赖代谢关键
酶的调节，增加恶性潜能。其中，PGAM1处于糖酵解通路中游，在肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠
癌和神经胶质瘤等多种肿瘤组织中高表达，其蛋白水平与患者预后呈负相关，与肿瘤组织
分级和严重程度呈正相关，提示PGAM1有望成为抗肿瘤新靶标。

[0004] Evan等首次报道小分子化合物MJE3，能特异性抑制PGAM1，但是细胞水平抑制活性较弱。Hitosugi等筛选得到PGMI‑004A，能选择性抑制PGAM1活性，显著抑制肿瘤细胞增殖和
皮下移植瘤生长，但是抑制活性仍需进一步提高。Xiaoguang Li等从绿茶中分离得到的天
然产物EGCG，能抑制PGAM1活性，但是特异性不佳，存在其他作用靶标，体内实验结果也未见
报道。因此，研究与开发更高活性和特异性的PGAM1抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的热点。

[0005] 肺癌分为非小细胞肺癌(non‑small cell lung cancer,NSCLC,～80％)和小细胞肺癌(SCLC,～20％)。其中肺腺癌发病率逐年急剧上升，已成为最常见的NSCLC病理类型，约
占50％。大多数肺癌患者确诊时已进入疾病进展期或晚期，错过最佳手术机会，以放化疗为
主要的治疗方案，有效应答率低，毒副反应较高。

[0006] 以厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼为代表的第一代EGFR‑TKIs药物极大的缓解了EGFR敏感型活化突变(主要包括外显子19的缺失突变Del19与外显子21的错义突变L858R)
NSCLC患者的临床症状，延长无进展生存期。EGFR敏感突变阳性的NSCLC在我国高达30‑
40％，特别是肺腺癌中占60％以上，使得EGFR‑TKIs类药物在治疗我国肺腺癌患者中的地位
显得尤为重要。然而在临床实践中发现，即便是治疗初期有效者，在治疗后4～12个月发生
不同程度的耐药现象，继而导致肿瘤复发，已成为TKIs类药物在临床应用中的最大障碍。

[0007] 中国专利申请CN201810273938.9公开了一种9,10‑蒽醌类化合物或其药学上可接受的盐及其药物用途，其中9,10‑蒽醌类化合物结构式如下：

[0008]

[0009] 该类化合物能抑制磷酸甘油酸变位酶活性，降低细胞代谢水平，可用于治疗实体肿瘤及血液肿瘤等疾病。其中HKB99化学结构式如下：

[0010]

发明内容

[0011] 本发明的第一个目的在于，提供PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

[0012] 本发明的第二个目的在于，提供PGAM1别构抑制剂HKB99与抗肺腺癌药物联合用药在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

[0013] 为了实现上述本发明第一个目的，本发明提供了PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用，其特征在于，所述HKB99的结构式如下：

[0014]

[0015] 为了实现本发明第二个目的，本发明提供了PGAM1别构抑制剂HKB99与抗肺腺癌药物联合用药在制备治疗肺腺癌药物中的应用，其特征在于，所述HKB99的结构式如下：

[0016]

[0017] 作为一个优选方案，所述抗肺腺癌药物是指厄洛替尼。

[0018] 本发明的优点在于，PGAM1别构抑制剂HKB99，能够显著抑制肺腺癌及其耐药细胞增殖和迁移，且对正常支气管上皮细胞影响较小，具有良好的选择性；体内实验发现HKB99
能抑制肺腺癌皮下瘤生长和肿瘤转移。HKB99有望成为高效、低毒的抗肿瘤新药，为PGAM1抑
制剂联合厄洛替尼治疗肺腺癌提供实验理论依据。

附图说明

[0019] 图1.HKB99选择性抑制肺腺癌细胞增殖。

[0020] 图2.小剂量HKB99短时间处理抑制肺腺癌细胞运动。

[0021] 图3.HKB99抑制耐药细胞增殖和运动，提高对厄洛替尼敏感性。

[0022] 图4.联合使用HKB99对PC9细胞皮下移植瘤的作用。

[0023] 图5.HKB99抑制HCC827‑Luc尾静脉注射移植瘤体内转移。

具体实施方式

[0024] 以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

[0025] 实施例1.制备4‑(氮杂环丁烷‑1‑基)‑N‑(3,4‑二羟基‑9,10‑二氧‑9,10‑二氢蒽‑2‑基)苯磺酰胺(HKB99)

[0026]

[0027] HKB99的合成路线

[0028] 第一步、制备3‑硝基‑1,2‑二羟基蒽‑9,10‑二酮(2)

[0029]

[0030] 向1L圆底烧瓶中加入1,2‑二羟基蒽‑9,10‑二酮(5g,20.8mmol)和冰醋酸(350mL)，50℃搅拌约10分钟，逐滴加入1.5mL浓硝酸，TLC检测原料点消失停止反应，待反应液恢复至
室温后，抽滤得黄色固体，该粗产品可不经纯化直接用于下步反应,粗产率70％。

[0031] 第二步、制备3‑氨基‑1,2‑二羟基蒽‑9,10‑二酮(3)

[0032]

[0033] 向1L圆底烧瓶中加入化合物2(1.75g,6.14mmol)和无水乙醇(350mL)，室温搅拌，依次加入锡粉(10.5g,341mmol)和二水合氯化亚锡(12.5g,55.4mmol)，再逐滴加入50.4mL
浓盐酸，TLC检测原料点消失停止反应，抽滤除去锡粉，减压浓缩除去部分乙醇，将剩余反应
液逐滴加入1L水中，抽滤并真空干燥得黑色固体，该粗产品可不经纯化直接用于下步反应，
粗产率90％。

[0034] 第三步、制备N‑(3,4‑二羟基‑9,10‑二氧‑9,10‑二氢蒽‑2‑基)‑4‑碘苯磺酰胺(4)

[0035]

[0036] 向25mL圆底烧瓶中加入化合物3(255mg,1mmol)和干燥吡啶(5mL)，室温搅拌，缓慢加入对碘苯磺酰氯(454mg,1.5mmol)，反应4h。将反应液逐滴加入10％盐酸中，调pH 1‑2，乙
酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(二氯甲烷)，得黄色固体
281mg，产率54％。

[0037] 第四步、制备4‑(氮杂环丁烷‑1‑基)‑N‑(3,4‑二羟基‑9,10‑二氧‑9,10‑二氢蒽‑2‑基)苯磺酰胺(HKB99)

[0038]

[0039] 把N‑(3,4‑二羟基‑9,10‑二氧‑9,10‑二氢蒽‑2‑基)‑4‑碘苯磺酰胺(52.1mg,0.1mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(9.2mg,0.01mmol)、(±)‑2,2'‑双‑(二苯膦基)‑1,1'‑联
萘(9.3mg,0.015mmol)、叔丁醇钠(48.1mg,0.5mmol)和哌啶(1mL)加入5mL圆底烧瓶，依次抽
真空、充氮气三次，80℃反应，TLC检测原料点消失停止反应。待反应液冷却至室温后，将反
应液逐滴加入约20mL的10％盐酸中，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅
1
胶柱层析分离(二氯甲烷)，得橘黄色固体29.3mg，产率65％。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ
12.60(brs,1H),10.82(brs,1H),9.80(brs,1H),8.22–8.10(m,2H),7.94–7.84(m,2H),7.80
(s,1H),7.66(d,J＝8.0Hz,2H),6.41(d,J＝8.4Hz,2H),3.88(t,J＝6.4Hz,4H),2.30(p,J＝
13
6.4Hz,2H). C NMR(151MHz,DMSO)δ187.59,180.71,153.76,150.13,141.14,134.90,
134.19,133.29,132.85,132.07,128.41,126.75,126.33,125.47,123.86,112.36,111.08,
‑
109.74,51.25,15.93.MS(ESI)(m/z):449.0(M‑H) .HRMS(ESI)calcd for C23H18N2O6S[M‑
‑
H]:449.0813；found:449.0816.

[0040] 实施例2.HKB99抑制肺腺癌细胞

[0041] (1)CCK8法检测结果发现HKB99抑制多种肺腺癌细胞，对正常支气管上皮细胞16HBE没有影响。图1为HKB99选择性抑制肺腺癌细胞增殖。

[0042] 在96孔板中加入100μL细胞悬液，4000cells/well,将培养板在37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中培养24h。将候选药物不同浓度梯度配制在培养液中，吸去旧培养液，每孔加
入100μL新配的培养液，将培养板在37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中培养72h。将CCK‑8溶液
按照1:10用不含血清的培养液稀释10倍，吸去培养板中的旧培养液，每孔加入100μL新配的
含CCK‑8的培养液。将培养板置于37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中孵育30至60min。用酶标仪
在450nm处检测吸光度值。以下列公式计算肿瘤细胞增殖的抑制率：

[0043] 抑制率＝(A450对照孔－A450给药孔)/A450对照孔×100％

[0044] 根据各浓度抑制率，采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC50。以上每个实验重复2次，求出2次实验的平均IC50值作为抑制能力的最终指标。

[0045] (2)划痕实验发现HKB99抑制肺腺癌细胞运动；

[0046] 对数生长期肺腺癌细胞接种到96孔板，2×104个细胞/孔，3复孔，过夜贴壁，观察细胞汇合度约100％时，进行细胞划痕。PBS清洗3遍后，对照组加入不含血清的培养液，实验
组加含有小剂量HKB99(0.2μM)的无血清基础培养液。放入Incucyte活细胞检测仪进行实时
监测，数据分析得到细胞迁移速率。图2显示HKB99短时间处理抑制肺腺癌细胞运动。

[0047] (3)HKB99能逆转耐药细胞对厄洛替尼的耐药性，抑制耐药细胞增殖和运动；

[0048] CCK8法检测细胞增殖活力，计算HKB99和厄洛替尼对肺腺癌细胞增殖抑制率；划痕实验观察细胞运动，具体方法描述同上。图3显示HKB99抑制耐药细胞增殖和运动，提高对厄
洛替尼敏感性。

[0049] (4)裸小鼠皮下异种移植瘤模型观察HKB99和厄洛替尼对肺腺癌皮下肿瘤生长的抑制作用。HKB99缓释制剂能显著抑制肺腺癌皮下瘤生长，厄洛替尼剂量爬坡诱导皮下瘤适
应性耐药，联用HKB99缓释制剂可抑制肿瘤耐药性产生。

[0050] 收集细胞制成5×106个/mL细胞悬液，在BACL/c裸小鼠上腋窝皮下注射100μL。注3
射7天之后，肿瘤体积约为100mm ，将裸小鼠随机分为4组：空载对照组(缓释制剂载体
PLGA),单加HKB99组(腹腔注射，100mg/kg，每隔2天注射1次)，厄洛替尼剂量爬坡组(灌胃，
3
爬坡剂量见图示)，HKB99+厄洛替尼联合加药组，待对照组肿瘤长到1500mm ,取出皮下移植
肿瘤，拍照并称瘤重。HE染色观察皮下瘤病理状况。图4显示联合使用HKB99对PC9细胞皮下
移植瘤的作用。

[0051] (5)裸小鼠体内肺腺癌转移瘤模型发现HKB99抑制肺腺癌体内转移。收集HCC827‑6
Luc肺腺癌细胞悬液1×10个/mL，BACL/c裸小鼠尾静脉注射100μL，隔天注射一次，待细胞
6
总量达到5×10个/只停止注射。IVIS小动物活体成像实验每两周1次观察体内荧光素信
号，在细胞结束接种后的第2周进行第一次活体成像，此时裸鼠肺部荧光信号均值约为1×
5 2
10p/sec/cm /sr，表明肺腺癌细胞已经在裸鼠体内形成稳定转移灶。待体内肿瘤转移灶形
成后，进行随机分组，对照组不做处理，实验组给予HKB99缓释制剂(腹腔注射，100mg/kg，每
隔2天注射1次)，持续观察小鼠体内荧光信号和体重变化。在持续给药2周后，再次进行小动
物活体成像实验，结果显示实验组小鼠体内荧光信号无明显变化，而对照组小鼠体内荧光
信号明显增加，表明肿瘤发生转移。

[0052] 持续至接种后84天，当小鼠出现体重急剧下降或恶变质、或者体内荧光信号值达7 2
到1×10p/sec/cm/sr时，定义为小鼠死亡。相对于HKB99加药组，无处理对照组小鼠生存期
明显缩短(图5A)；小鼠活体成像结果显示给药组荧光强度显著低于对照组(图5B)；统计接
种后14天和84天的荧光强度值，发现给药组荧光强度显著低于对照组(图5C)；通过体重曲
线可以看出，加药组体重有所上升，说明持续长时间HKB99给药对小鼠毒性低；而对照组中
部分小鼠发生恶变质而导致体重明显下降(图5D)。图5显示HKB99抑制HCC827‑Luc尾静脉注
射移植瘤体内转移。

[0053] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为
本发明的保护范围。