一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层及制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医用材料的技术领域，公开了一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层及制备方法和应用。该制备方法按照以下步骤：1)通过3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架，依次用氯化钙及京尼平交联，后用L‑谷氨酸钠浸泡，中间用去离子水冲洗、浸泡多次；(2)将多巴胺盐酸盐溶、姜黄素大分子药物与明胶于pH为8.5的Tris‑HCl中搅拌溶解；(3)支架浸入刚得到的溶液中恒温震荡，取出后立即速冻交联；(4)支架在京尼平再次交联后用L‑谷氨酸钠浸泡，中间用去离子水冲洗、浸泡多次，在羟基磷灰石支架表面获得姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层。

权利要求

1.一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)通过3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架，用5wt％氯化钙快速交联15min，去离子水冲洗后用0.5wt％的京尼平在室温下避光交联72h后取出，用去离子水再次冲洗后用0.5wt％的L‑谷氨酸钠浸泡48h，然后再用去离子水浸泡24h；

(2)将多巴胺盐酸盐溶于pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液中，然后依次加入姜黄素大分子药物与明胶，在40℃水浴锅中充分搅拌溶解，得到混合溶液；所述姜黄素大分子药物具有如下结构式：

n1为42～50的自然数，n2为≥5的自然数；

(3)将步骤(1)处理的羟基磷灰石支架浸入步骤(2)得到的混合溶液中恒温震荡，取出后立即放入‑80℃冰箱中速冻交联；

(4)将步骤(3)速冻交联后的支架取出，用0.5wt％的京尼平在4℃下避光交联12h，用去离子水冲洗后用0.5wt％的L‑谷氨酸钠浸泡2h，再用去离子水冲洗，即可在羟基磷灰石支架表面获得姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层，得到3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层；

步骤(2)所述姜黄素大分子药物是按照以下步骤制备得到：将聚乙二醇、丁二酸酐与对甲基苯磺酸一起在80℃氮气环境下反应；反应所得产物溶解于溶剂中，过滤，用沉淀剂沉淀后，离心，用溶剂再次溶解，重复纯化3次，得到产物冷冻干燥后与姜黄素、二环己基碳二亚胺一起加入到溶剂中，充分溶解，充入氮气，再加入用溶剂溶解好的4‑二甲氨基吡啶及三乙胺，搅拌反应24h，过滤后用沉淀剂沉淀，离心，用溶剂溶解后再次用沉淀剂沉淀，重复纯化3次，冷冻干燥，得到姜黄素大分子；所述溶剂均为二氯甲烷，所述沉淀剂均为无水乙醚。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架是具体按照以下步骤：将磷酸氢二铵溶于去离子水中，利用硝酸将溶液pH值调至6.0，得到磷酸氢二铵溶液；将六水合硝酸钙溶于去离子水中，得到硝酸钙溶液；混合磷酸氢二铵溶液和硝酸钙溶液，加入柠檬酸钠，搅拌15min后转移到至高压反应釜中，180℃反应3h，得到羟基磷灰石微球粉体，去离子水洗涤、陈化、冷冻干燥，备用；将海藻酸钠、明胶和羟基磷灰石微球粉体依次加入超纯水中，水浴锅加热搅拌至均匀浆料，转入料筒中后超声除去所有气泡，利用3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液的配制方法为：称取0.61g三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶于500mL水中，待完全溶解后，利用pH计测其pH值，逐滴滴加0.5M的盐酸溶液，直至pH调至8.5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述多巴胺盐酸盐在混合溶液中的终浓度为0.2‑0.4mg/mL，所述姜黄素大分子药物在混合溶液中的终浓度为1‑2mg/mL，所述明胶在混合溶液中的终含量为5wt％；

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述恒温震荡的温度为40℃，时间为30min；所述速冻交联的时间为30min；

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所得3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层，预冻过夜，然后冻干得到冻干样品。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述冻干的步骤之后设置有无菌处理步骤。

8.一种由权利要求1‑7任一项所述的制备方法制备得到的3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层。

9.根据权利要求8所述的3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层在制备骨肉瘤术后骨缺损部分的修复材料中的应用。

说明书

一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协

同抗癌涂层及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医用材料的技术领域，特别涉及一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 骨肉瘤是骨科最常见的原发恶性骨肿瘤，发病年龄主要有2个高峰，第一个高峰为<24岁，发病率为4.4/100万人年；第二个高峰为>59岁，发病率为4.2/100万人年，其好发部
位主要为股骨、胫骨和肱骨。临床上对骨肉瘤的治疗手段主要包括有手术治疗、放/化疗及
介入治疗。其中手术治疗的传统方案是进行截肢手术，但此种方案通常会给患者带来严重
的肢体功能障碍，患者长期生存率(>5年)仅能达到20％。因此，近年来临床手术方案的主要
选择是保肢手术，最大程度保留患者肢体功能，提高患者生存质量，但此方案可能会增加骨
肉瘤的复发率，并极度依赖有经验的术者。传统放/化疗治疗可最大程度帮助患者实现保
肢，提高生存质量，但传统放/化疗存在极大的副作用，最好的情况下只能将长期生存率提
升至70～75％，且通常无法达到。介入治疗包括微波消融、射频消融、氩氦刀消融等，其优点
在于可在影像引导下治疗，损伤小，痛苦少，安全系数高，但与保肢手术一样，其同样存在可
能增加复发率的风险，复发的骨肉瘤长期生存率只能达到20％左右，同时可能诱发并发症。

[0003] 目前，临床骨肉瘤治疗主要采取“保肢手术+放/化疗辅助”的方案，但外科手术会造成无法自行治愈的骨缺损，同时难以确保完全切除所有的肿瘤细胞，而传统的放/化疗则
会带来严重的副作用。因此，设计一种能够实现在对正常细胞影响较小的同时对可能存在
的残余肿瘤细胞杀灭，并在完成对残余肿瘤细胞的杀灭后有利于骨组织修复的生物材料有
着重要意义。

[0004] 姜黄素(Curcumin，Cur)，是从姜科姜黄属植物根茎中提取的一种多酚类物质。研究表明，姜黄素具有广泛的药理活性，能在一定光照条件下高效产生ROS；毒理学研究证明，
其在高剂量下依然安全可靠，已被FDA列为第三代癌化学预防药。但由于姜黄素在水中溶解
度极差，生理条件下不稳定，体内代谢快，导致其生物利用度低，临床应用受到极大限制。

[0005] 光热疗法因其无创、有效且无毒副作用的特点已受到广泛关注。聚多巴胺(PDA)作为黑色素类似物，具有很强的近红外吸收能力和很高的光热转化效率，且与其他广泛使用
的光热材料不同，PDA具有优良的生物相容性和生物可降解性。光热疗法高温下杀死癌细胞
的同时也会对周围正常组织造成较大影响，而低于43℃时癌细胞只是活性受到抑制。此外，
研究表明多巴胺可能具有成瘾性，不可过量使用。

[0006] 肿瘤双模式协同治疗具有高效性、抗耐药性及较低的副作用，使得肿瘤的双模式协同治疗成为了近年来备受关注的肿瘤治疗方式。光动力疗法与光热疗法与传统肿瘤治疗
方式相比更加精准、高效，且无创、低毒副作用。本发明在合理设计的情况下，一种光照条件
即可同时启动光动力与光热疗法，使之协同作用于肿瘤组织，极大简化治疗手段，提肿瘤治
疗效率。同时本发明采用了一种利用聚乙二醇改性得到的大分子化的姜黄素药物，相比姜
黄素单药其水溶性及稳定性有了极大地提高，代谢速率改善的同时保留了抗癌活性。

发明内容

[0007] 为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的制备方法。

[0008] 本发明的又一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层。

[0009] 本发明的再一目的在于提供一种上述3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的应用。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0011] 一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的制备方法，包括以下步骤：

[0012] (1)通过3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架，用5wt％氯化钙快速交联15min，去离子水冲洗后用0.5wt％的京尼平在室温下避光交联72h后取出，用去离子
水再次冲洗后用0.5wt％的L‑谷氨酸钠浸泡48h，然后再用去离子水浸泡24h；

[0013] (2)将多巴胺盐酸盐溶于pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液(Tris‑HCl)中，然后依次加入姜黄素大分子药物(pCur)与明胶，在40℃水浴锅中充分搅拌溶解，得到混合
溶液，所述姜黄素大分子药物具有如下结构式：

[0014]

[0015] n1为42～50的自然数，n2为≥5的自然数；

[0016] (3)将步骤(1)处理的羟基磷灰石支架浸入步骤(2)得到的混合溶液中恒温震荡，取出后立即放入‑80℃冰箱中速冻交联；

[0017] (4)将步骤(3)速冻交联后的支架取出，用0.5wt％的京尼平在4℃下避光交联12h，用去离子水冲洗后用0.5wt％的L‑谷氨酸钠浸泡2h，再用去离子水冲洗，即可在羟基磷灰石
支架表面获得姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层，得到3D打印羟基磷灰石支架复合姜
黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层。

[0018] 步骤(1)所述3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架是具体按照以下步骤：将磷酸氢二铵溶于去离子水中，利用硝酸将溶液pH值调至6.0，得到磷酸氢二铵溶
液；将六水合硝酸钙溶于去离子水中，得到硝酸钙溶液；混合磷酸氢二铵溶液和硝酸钙溶
液，加入柠檬酸钠，搅拌15min后转移到至高压反应釜中，180℃反应3h，得到羟基磷灰石微
球粉体，去离子水洗涤、陈化、冷冻干燥，备用；将海藻酸钠、明胶和羟基磷灰石微球粉体依
次加入超纯水中，水浴锅加热搅拌至均匀浆料，转入料筒中后超声除去所有气泡，利用3D打
印技术制备明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架。

[0019] 步骤(2)所述姜黄素大分子药物是按照以下步骤制备得到：将聚乙二醇、丁二酸酐与对甲基苯磺酸一起在80℃氮气环境下反应；反应所得产物溶解于溶剂中，过滤，用沉淀剂
沉淀后，离心，用溶剂再次溶解，重复纯化3次，得到产物冷冻干燥后与姜黄素、二环己基碳
二亚胺一起加入到溶剂中，充分溶解，充入氮气，再加入用溶剂溶解好的4‑二甲氨基吡啶及
三乙胺，搅拌反应24h，过滤后用沉淀剂沉淀，离心，用溶剂溶解后再次用沉淀剂沉淀，重复
纯化3次，冷冻干燥，得到姜黄素大分子；所述溶剂均为二氯甲烷，所述沉淀剂均为无水乙
醚。

[0020] 步骤(2)所述pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液的配制方法为：称取0.61g三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶于500mL水中，待完全溶解后，利用pH计测其pH值，逐滴滴加0.5M的
盐酸溶液，直至pH调至8.5。

[0021] 步骤(2)所述多巴胺盐酸盐在混合溶液中的终浓度为0.2‑0.4mg/mL，所述姜黄素大分子药物在混合溶液中的终浓度为1‑2mg/mL，所述明胶在混合溶液中的终含量为5wt％；

[0022] 步骤(3)所述恒温震荡的温度为40℃，时间为30min；所述速冻交联的时间为30min；

[0023] 步骤(4)所得3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层，预冻过夜，然后冻干得到冻干样品。

[0024] 所述冻干的步骤之后设置有无菌处理步骤。

[0025] 上述各个步骤中，所有溶液配制所用水为实验室自制超纯水。

[0026] 一种由上述的制备方法制备得到的3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层。

[0027] 上述的3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层在骨肉瘤术后骨缺损部分的修复材料中的应用。

[0028] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0029] 本发明设计了一种具有pCur/PDA复合涂层的羟基磷灰石3D打印支架，其中合成的姜黄素大分子具有良好水溶性及生理稳定性，复合涂层在一定光照条件下利用少量PDA局
部较低提升肿瘤微环境温度，协同姜黄素大分子产生的ROS，最大程度降低对周围正常组织
影响的同时杀死可能残余的骨肉瘤细胞；本发明涂层部分在快速降解的同时可启动光动力
与光热疗法，使之协同作用于肿瘤组织，极大简化治疗手段，提肿瘤治疗效率，涂层降解暴
露出的羟基磷灰石支架部分则有利于骨肉瘤术后骨缺损部分的修复。

附图说明

[0030] 图1是姜黄素大分子药物pCur的核磁共振氢谱图。

[0031] 图2是3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的实物图，可以看出支架表面有一明显涂层。

[0032] 图3是3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的表面扫描电镜(SEM)及能谱元素分析图；SEM图说明涂层在包覆在3D支架上，并在形成凹凸不平
带有孔洞的表面；同时，能谱图中C、O、N元素分布与SEM图匹配，说明pCur及PDA能均匀存在
于涂层当中。

[0033] 图4是3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的纵截面扫描电镜(SEM)图，放大倍数分别为1000倍、500倍、100倍及50倍；纵截面SEM图中存在明
显的疏松带孔洞的涂层部分及密实的支架部分，涂层部分均匀包裹支架部分，同时1000倍
放大图中可以看出两部分之间能紧密结合。

[0034] 图5是3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的横截面扫描电镜(SEM)及能谱元素分析图；SEM图同样可以看出疏松多孔的涂层结构能均匀加载
进入密实的3D支架部分的内部结构上。同时，能谱图中P、Ca元素只存在于含羟基磷灰石的
支架结构式，C、O、N元素则均匀分布，说明加载进入直接内部的涂层中含pCur及PDA。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0036] 实施例1：

[0037] 实验室自制羟基磷灰石粉体，为具有微纳结构的微球，平均粒径为10μm，其制备方法为：

[0038] 将磷酸氢二铵溶于去离子水中，得到终浓度为24mmol/L的溶液，利用硝酸将溶液pH调至6；将六水合硝酸钙溶于去离子水中，得到终浓度为40mmol/L的溶液；混合上述两种
溶液后再加入3.6g柠檬酸钠，剧烈搅拌15min后转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，
180℃反应3h，乙醇及去离子水洗涤、陈化，冷冻干燥，得到羟基磷灰石粉体，备用。

[0039] 实施例2：

[0040] 明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架，其制备方法包括以下步骤：

[0041] (1)打印浆料的制备：将4wt％的海藻酸钠、10wt％的明胶及10wt％的实施例1中制得的羟基磷灰石粉体依次加入超纯水中，在50℃水浴锅中搅拌至均匀后迅速转移至3D打印
料筒中，在40℃条件下超声至无气泡，放入‑20℃冰箱快速降温10min后备用；

[0042] (2)复合支架的3D打印：利用软件设计建模，得到整体尺寸为Φ10×2mm，层高为0.32mm，层与层之间为90°旋转的圆柱体模型文件，导入3D打印机中，设置料筒温度为30～
32℃，接收台温度为0℃，挤出压力参数为2.5～3bar，打印速度为8～10mm/s，在24℃环境温
度下，通过0.4mm针头进行打印，得到内部纤维直径为0.4～0.6mm，同层纤维间距为0.4～
0.6mm，未交联的明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架；

[0043] (3)复合支架的交联：打印出的明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架，用5wt％氯化钙快速交联15min，去离子水冲洗后用0.5wt％的京尼平在室温下避光交联72h后取出，用
去离子水再次冲洗后用0.5wt％的L‑谷氨酸钠浸泡48h，然后再用去离子水浸泡24h，得到交
联好的明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架，冷冻干燥，保存备用。

[0044] 实施例3：

[0045] 姜黄素大分子(pCur)为实验室自制，分子量约为20000，姜黄素载药率约为14.6％。合成原料中聚乙二醇为Sigma购买，数均分子量为2050。其制备方法包括以下步骤：

[0046] (1)将8g数均分子量为2050的聚乙二醇加入烧瓶中，再依次加入1.17g丁二酸酐及0.332g对甲基苯磺酸，80℃氮气环境下反应3h；

[0047] (2)反应后得到产物溶解于20ml二氯甲烷中，过滤，用160ml无水乙醚将产物沉淀，后在室温下离心，用20ml二氯甲烷再次溶解，重复纯化3次，得到产物预冻过夜后冻干；

[0048] (3)将750mg姜黄素，4.58g步骤(2)中产物与1.26g的DCC溶解至150ml超干二氯甲烷中，充分溶解，充入氮气，再加入用超干二氯甲烷溶解好的DMAP 0.1g及TEA 0.1ml，剧烈
搅拌下室温反应24h；

[0049] (4)反应完的溶液过滤，抽真空浓缩溶液至原来体积的一半，用8倍体积比的无水乙醚沉淀，在室温下用二氯甲烷溶解后再次用无水乙醚沉淀，重复操作3次，得到姜黄素大
分子药物pCur；

[0050] (5)所得的pCur药物，预冻过夜，冻干备用。其核磁共振氢谱图如图1所示，特征峰的出现表明合成成功。

[0051] 所得姜黄素大分子药物具有如下结构式：

[0052]

[0053] n1为42～50的自然数，n2为≥5的自然数。

[0054] 实施例4：

[0055] 一种3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层的制备方法，包括以下步骤：

[0056] (1)称取0.61g的Tris溶于500mL水中，带完全溶解后，利用pH计测其pH值，逐滴滴加0.5M的盐酸溶液，直至pH调至8.5；

[0057] (2)称取多巴胺盐酸盐溶于步骤(1)刚配好的Tris‑HCl(pH＝8.5)中，后依次加入实施例3所得姜黄素大分子药物pCur与明胶，在40℃水浴锅中充分搅拌溶解，得到混合溶
液，其中多巴胺盐酸盐溶液的终浓度为0.2mg/mL，pCur溶液的终浓度为1mg/mL，明胶的终含
量为5wt％；；

[0058] (3)将实施例2所得交联好的明胶/海藻酸钠/羟基磷灰石复合支架放入24孔板中，每孔加入2ml步骤(2)得到的混合溶液，40℃恒温震荡30min，取出后立即放入‑80℃冰箱中
速冻交联30min；

[0059] (4)将速冻交联后的支架取出，用0.5wt％的京尼平在4℃下避光交联12h，用去离子水冲洗后用0.5wt％的L‑谷氨酸钠在常温下浸泡2h，再用去离子水冲洗；即可在羟基磷灰
石支架表面获得pCur/PDA协同抗癌涂层；

[0060] (5)复合了pCur/PDA协同抗癌涂层的羟基磷灰石支架经过预冻过夜、冻干、伽马射线辐照灭菌处理，得到3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层。

[0061] 实施例5：

[0062] 本实施例的协同抗癌涂层的制备方法的步骤(1)、(3)、(4)、(5)同实施例4，步骤(2)是称取多巴胺盐酸盐溶于刚配好的Tris‑HCl(pH＝8.5)中，后依次加入pCur与明胶，在
40℃水浴锅中充分搅拌溶解，其中多巴胺盐酸盐溶液的终浓度为0.4mg/mL，pCur溶液的终
浓度为1mg/mL，明胶的终含量为5wt％。

[0063] 实施例6：

[0064] 本实施例的协同抗癌涂层的制备方法的步骤(1)、(3)、(4)、(5)同实施例4，步骤(2)是称取多巴胺盐酸盐溶于刚配好的Tris‑HCl(pH＝8.5)中，后依次加入pCur与明胶，在
40℃水浴锅中充分搅拌溶解，其中多巴胺盐酸盐溶液的终浓度为0.2mg/mL，pCur溶液的终
浓度为2mg/mL，明胶的终含量为5wt％。

[0065] 实施例7：

[0066] 本实施例的协同抗癌涂层的制备方法的步骤(1)、(3)、(4)、(5)同实施例4，步骤(2)是称取多巴胺盐酸盐溶于刚配好的Tris‑HCl(pH＝8.5)中，后依次加入pCur与明胶，在
40℃水浴锅中充分搅拌溶解，其中多巴胺盐酸盐溶液的终浓度为0.4mg/mL，pCur溶液的终
浓度为2mg/mL，明胶的终含量为5wt％。

[0067] 实施例8：

[0068] 将实施例4中得到3D打印羟基磷灰石支架复合姜黄素大分子/聚多巴胺协同抗癌涂层，湿态时利用相机拍摄，结果如图2所示。支架冷冻干燥后，将支架利用刀片由中间切
开，分别得到表面、横截面及纵截面样品，用导电胶固定在铝制的样品台中，喷金处理90秒，
扫描电子显微镜观察，并作能谱元素分析，结果如图3～5所示。

[0069] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。