一种促进宿主细胞生长速率及其底物利用的方法及应用

摘要

本发明提供了一种促进丝状真菌生长速率及其底物利用的方法及其在微生物发酵中的应用，属于基因工程领域。利用敲除、突变等基因工程方法对丝状真菌调控因子LaeA进行改造，所得到的重组菌株，获得生长速率和底物利用速率显著提高的能力，进而提高发酵生产有机酸等生物基化学品的生产效率。

权利要求

1.一种重组嗜热毁丝霉菌在生产琥珀酸中的应用，其特征在于：所述重组嗜热毁丝霉菌是利用基因工程方法抑制嗜热毁丝霉菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平而获得。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，生产琥珀酸时的碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控因子LaeA为如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制嗜热毁丝霉菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平是通过对所述调控因子LaeA进行敲除、或突变、或表达水平被下调来实现。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控因子LaeA的突变是通过基因工程的方法对LaeA蛋白的第88位至第175位氨基酸进行删除以实现其活性的丧失或下降。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控因子LaeA的突变是通过基因工程的方法对LaeA蛋白的第89至第96位氨基酸进行删除以实现其活性的丧失或下降。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控因子LaeA的突变是通过基因工程的方法对LaeA蛋白的第89至90位氨基酸进行替换以使其活性丧失或下降。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，抑制表达水平通过所述调控因子LaeA的抑制剂来实现。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自所述调控因子LaeA的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA或者活性抑制剂。

说明书

一种促进宿主细胞生长速率及其底物利用的方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及调控因子LaeA在提高嗜热毁丝霉生长速率及糖代谢中的功能及其应用。

背景技术

[0002] 丝状真菌是一类重要的真核微生物，广泛存在于自然界中，在工业、农业和医药等领域发挥着重要作用。里氏木霉、黑曲霉、米曲霉以及嗜热毁丝霉被广泛用于生产工业酶制剂(如纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和淀粉酶等)和有机酸(如柠檬酸等)。与细菌、酵母相比，丝状真菌具有较高的蛋白质分泌能力，能够利用简单、廉价的培养基进行生长，在工业发酵中受到了关注。但值得注意的是丝状真菌一般存在底物利用速率低，生长较慢等问题，使得丝状真菌发酵周期较长，目标产品产率及生产强度较低，成为解决发酵成本较高、生产设备利用率低等问题的关键。

[0003] 嗜热毁丝霉是天然纤维素降解高温丝状真菌，是耐高温纤维素酶的优良生产者，天然具有分泌大量生物质降解酶类的能力。嗜热毁丝霉最适生长温度为45-48℃，与纤维素酶最佳酶活温度50℃非常接近，是发酵工业非常卓越的底盘细胞。目前，经过代谢工程改造后，嗜热毁丝霉已被用于发酵生产大宗化学品，如苹果酸、富马酸等。嗜热毁丝霉最适生长温度较高，可以节约发酵过程中的冷却水用量，降低生产成本，已被证实可以用来大规模工业发酵（Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, Bartels J, Visser J. Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1. Ind Biotechnol. 2011;7:214-23）。但是嗜热毁丝霉存在生长速率慢、发酵周期长、纤维素酶分泌相对较低等问题，限制了其工业发酵中的广泛应用。因此，有必要开发生长速率快，发酵时间短，生产有机酸如苹果酸等的产量高的嗜热毁丝霉。

[0004] 全局调控因子LaeA为蛋白甲基转移酶，前期研究表明LaeA参与调控丝状真菌发育、次级代谢合成等生理过程。在本发明中通过实验证实LaeA蛋白与重要的工业丝状真菌嗜热毁丝霉的生长速率及其底物利用和发酵时间相关，突变其编码基因后能够显著目标产物的生产效率，极具推广意义。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种提高丝状真菌嗜热毁丝霉底物利用和生长速率的方法。经验证，本发明能够显著提高嗜热毁丝霉苹果酸工程菌株的生长速率，显著提高有机酸的生产效率。为达此目的，本发明采用以下技术方案。

[0006] 第一方面，本发明提供一种重组丝状真菌，其特征在于，利用基因工程方法抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA表达水平而获得或通过突变使其丧失/降低活性，其生长速率和/或碳源底物利用的能力得以提升，其中优选的所述碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合，优选地所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、半纤维素、蔗糖、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

[0007] 在更具体的实施方式中，所述调控因子LaeA为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽以及同源性达到或超过70%,优选80%，90%，95%，以及99%的氨基酸序列,优选其源自丝状真菌,更优选源自毁丝霉，最优选源自嗜热毁丝霉。

[0008] 更优选地，所述调控因子LaeA为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽，优选其编码核苷酸是如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 在优选地实施方式中，所述抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平是通过对所述调控因子LaeA进行敲除、或突变、或表达水平被下调来实现。

[0010] 其中，所述敲除是通过基因编辑方式实现,更优选地是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法实现。所述抑制表达水平通过所述调控因子LaeA的抑制剂来实现，优选地，所述的抑制剂选自所述调控因子LaeA的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNAmiRNA、siRNA、shRNA或者活性抑制剂。

[0011] 更优选的，所述突变调控因子LaeA使其丧失/降低功能是指通过基因工程删除或替换其核苷酸序列或其所编码的氨基酸序列，从而使调控因子LaeA功能丧失或下降。

[0012] 在优选地实施方式中，所述突变调控因子LaeA是指对其第88位至第175位氨基酸，第89至第96位氨基酸，和/或第89位至第90位氨基酸进行删除或替换，从而使其丧失调控功能。

[0013] 在优选地实施方式中，所述丝状真菌选自毁丝霉。更优选地，所述丝状真菌是嗜热毁丝霉菌。

[0014] 第二方面，本发明提供一种利用嗜热毁丝霉生产有机酸的方法，其特征在于：利用本发明上述的重组丝状真菌生产有机酸，相对于野生型的丝状真菌而言提高了有机酸的合成效率。优选实施方式中，其是利用本发明上述的嗜热毁丝霉重组菌生产苹果酸和/或琥珀酸。

[0015] 第三方面，本发明提供了一种构建重组丝状真菌的方法，其利用基因工程方法抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平，而获得生长速率和/或碳源底物利用能力得以提升的丝状真菌。其中优选的所述碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合，优选地所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

[0016] 在优选实施方式中，所述的方法通过基因编辑方式实现，更具体的基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。更优选地，所述方法包含的元件为：Cas9蛋白编码序列（编码序列如SEQ ID NO.5所示），sgRNA调控表达框（如SEQ ID NO.3所示）和供体DNA（如SEQ ID NO.4所示）；其中，所述sgRNA转录的表达框包括对基因laeA的靶向位点的sgRNA转录的表达框的序列；所述的供体DNA序列是由laeA上/下游两条同源片段与抗性基因通过Gibson Assembly的方法连接而成，通过将所述同源供体DNA序列一起导入丝状真菌细胞，可实现高效率同源重组，若不导入同源供体DNA序列也能通过非同源端连接（NHEJ）实现所述基因位点的编辑。

[0017] 在一个具体实施例中，将Cas9蛋白的表达框和调控sgRNA转录的表达框共转化进入嗜热毁丝霉菌株的原生质体细胞后，通过非同源端连接（NHEJ）对laeA位点特异性DSB的不精确修复，进而得到laeA突变株。

[0018] 本发明通过失活调控因子LaeA，显著加快了嗜热毁丝霉的底物利用效率、生长速率以及产物合成效率，能够用于生产有机酸如苹果酸等。因而，本发明对于提高丝状真菌发酵水平及目标产品生产效率具有重要意义。

附图说明

[0019] 图1 嗜热毁丝霉laeA突变菌株的葡萄糖消耗速率。

[0020] 图2 嗜热毁丝霉laeA突变菌株在葡萄糖条件下的生物量积累。

[0021] 图3 嗜热毁丝霉laeA突变菌株在不同碳源条件下生长表型分析。

[0022] 图4 嗜热毁丝霉laeA突变菌株在蔗糖条件下的生物量积累。

[0023] 图5 嗜热毁丝霉有机酸株JG207缺失laeA后的底物利用。

[0024] 图6 嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株JG207缺失laeA后的苹果酸产量。

[0025] 图7 嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株JG207缺失laeA后的琥珀酸产量。

[0026] 图8 导入LaeA突变体后菌株KoLaeA的葡萄糖消耗速率。

[0027] 图9 导入LaeA突变体后菌株KoLaeA葡萄糖条件下的生物量积累。

[0028] 图10 导入LaeA突变体后菌株KoLaeA在蔗糖条件下的生物量积累。

具体实施方式

[0029] 本发明经过广泛而深入的研究，发现LaeA蛋白作为在丝状真菌中具有调控菌株的生长发育、碳源利用等生理活动的功能，尤其经过实验证实在嗜热毁丝霉中敲除laeA基因后，突变体表现出生长加快、糖耗加快、生物量增大等性状。另外，为了进一步证实LaeA蛋白在丝状真菌有机酸生产中作用，发明人还敲除了嗜热毁丝霉苹果酸发酵菌株laeA基因，实验证实突变体在发酵过程中底物利用速率以及苹果酸合成速率均有所提高。如此形成了本发明。

[0030] 为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0031] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如Sambrook 等人所著的《分子克隆：实验室手册》(New York: Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0033] 实施例1 LaeA失活能够加快嗜热毁丝霉野生菌株的糖耗速率

[0034] 本实施例主要针对丝状真菌中的全局性调控因子LaeA(Mycth_2294559)，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术（Liu Q, Gao RR, Li JG, Lin LC, Zhao JQ,Sun WL, Tian CG. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnology for Biofuels. 2017, 10:1.）将目标基因在嗜热毁丝霉中失活，以提高菌株糖耗速率。其中，LaeA蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。LaeA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0035] 具体实施过程如下：

[0036] 1. 载体构建

[0037] （1）sgRNA表达框构建

[0038] 通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因laeA（Mycth_2294559）的靶标位点。采用融合PCR的方法将序列U6p启动子、laeA靶标位点以及引导序列连接在一起，构建sgRNA表达框载体。

[0039] PCR反应体系为：2×Phanta® Max Buffer 25μL，10 mM dNTPs 1μL，上游/下游引物各1.5μL，模板1μL，Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，水 19μl。

[0040] PCR反应条件为：先95℃ 30s； 然后98℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 45s，32个循环；最后72℃ 5min，4℃ 10min。

[0041] 通过融合PCR的构建的sgRNA表达质粒U6p-laeA-sgRNA，其sgRNA转录调控元件序列如SEQ ID No.3所示。

[0042] （2）供体DNA载体构建

[0043] 本发明中供体DNA片段分别由目标基因上/下游约1000bp同源片段，新霉素抗性基因表达框PtrpC-neo片段，通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶XbaI和EcoRV线性化的质粒PPk2NeoGFP中，最终构建供体DNA片段Donor-laeA，其核酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0044] PCR反应体系为：2×Phanta® Max Buffer 25μL，10 mM dNTPs 1μL，上游/下游引物各1.5μL，模板1μL，Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，水 19μl。

[0045] PCR反应条件为：先95℃ 30s； 然后98℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 2min，32个循环；最后72℃ 5min，4℃ 10min。

[0046] （3）Cas9表达框构建

[0047] Cas9表达框通过PCR扩增的方式，从质粒p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC上扩增（Liu Q, Gao RR, Li JG, Lin LC, Zhao JQ,Sun WL, Tian CG. Development of a genome-editing CRISPR/ Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnology for Biofuels. 2017, 10:1.）获得，其核酸序列如SEQ ID No.5所示。

[0048] PCR反应体系为：2×Phanta® Max Buffer 25μL，10 mM dNTPs 1μL，上游/下游引物各1.5μL，模板1μL，Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，水 19μl。

[0049] PCR反应条件为：先95℃ 30s； 然后98℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 3min，32个循环；最后72℃ 5min，4℃ 10min。

[0050] 本实施例中载体构建所用引物如下：

[0051] SEQ ID NO. 引物 序列（5’-3’）6 LaeA_UP-F TGTGGAGTGGGCGCTTACACAGTACACGAGGACTTACAGCTTATACCTCTTATCTC
7 LaeA_UP-R GCCCAAAAAATGCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGTTAGACTTCTTGGTAGGTGCGA
8 neo-F CGACGTTAACTGATATTGAAGGA
9 neo-R TCAGAAGAACTCGTCAAGAA
10 LaeA_Dn-F TCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCTAACATCGTCTTACCCCTTG
11 LaeA_Dn-R AGTCATGTGATTGTAATCGACCGACGGAATTGAGGATGCAGAGTAATCCATGACAGCA
12 Cas9-F TCCTCCGAGGTTCGACATCAGGGTT
13 Cas9-R CTCTAAACAAGTGTACCTGTGCAT
14 U6p-F AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCGGAA
15 LaeA_sgRNA-R TCTAGCTCTAAAACTACCAGCGGCCGTTTTCGGCGAGGAAAGAAAGAAAAGAAG
16 LaeA_sgRNA-F CTTCTTTTCTTTCTTTCCTCGCCGAAAACGGCCGCTGGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAG
17 sgRNA-R AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
18 laeA_orf-F TTATAGAGGCCACCTGTGAGTT
19 laeA_orf-R CTCACGGGTGGCACTCACAA

[0052] 2、在嗜热毁丝霉中敲除laeA

[0053] 2.1嗜热毁丝霉孢子准备

[0054] 将嗜热毁丝霉野生型菌株在XM平板培养基[50×Vogel’s盐20mL，木糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌；50×Vogel’s盐（1L）：柠檬酸三钠（1/2H2O）150g，KH2PO4 
250g，NH4NO3 100g，MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 5g，微量元素液 5mL，生物素（0.1mg/mL）
2.5mL，定容体积到1L；微量元素液配方（100 mL）：5g C6H8O·7H2O， 5 g ZnSO4·7H2O，1 g Fe(NH4)2(SO4)·6H2O，0.25g CuSO4·5H2O，0.05g MnSO4·H2O，0.05 g H3BO3，0.05g NaMoO4·2H2O，溶于水中，定容至100mL]上35℃培养7天后待用。

[0055] 2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化

[0056] 1）菌丝体准备

[0057] 将成熟的嗜热毁丝霉孢子，用0.05%吐温80灭菌水收集，经擦镜纸过滤出去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的GM平板[50×Vogel’s盐20mL，葡萄糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌]，37℃培养20h。

[0058] 2）原生质体制备

[0059] 将带有菌丝的玻璃纸放置于30mL裂解液（配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30mL溶液A，过滤除菌；溶液A:1.036g磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90mL去离子水，氢氧化钾调pH到5.6，定量至100mL，高温高压灭菌）中，28℃裂解2h，每隔15min轻轻摇动。

[0060] 而后经过擦镜纸过滤后，2000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入4mL溶液B（0.735g氯化钙，18.22g山梨醇，1mL Tris·HCl （1M，pH7.5），溶于90mL去离子水，盐酸调pH到7.6，定量至100mL，高温灭菌），2000rpm 4℃离心10min；弃上清，按200µL/5ug质粒加入一定体积溶液B。

[0061] 3）原生质体转化

[0062] 预冷的15ml离心管，加入50µL预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500µL Tris·HCl (1M pH 7.5))，10µLCas9表达框，sgRNA片段U6p-laeA-sgRNA（SEQ ID No.3）以及供体DNA片段donor-laeA（SEQ ID No.4）等比例混合溶液，200µL原生质体。放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素培养基A（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂糖
7.5g，定容体积到1L，高温高压灭菌）中，平板中先倒入一层含抗生素G418的培养基B（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌），再倒入一层混合原生质体的培养基A，35℃培养，3d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。

[0063] 2.3 嗜热毁丝霉转化子验证

[0064] 1）基因组提取

[0065] 采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体包括以下操作：

[0066] 1）2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠及1mL的裂解液（lysis buffer，配方：0.2M Tris·HCl (pH 7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％SDS(w/v)），挑取平板中生长的嗜热毁丝霉菌丝于DNA提取管中。

[0067] 2）将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。

[0068] 3）65℃水浴30分钟，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。

[0069] 4）水浴结束后取出，每管加入 80μL pH 7.5的1M Tris·HCl中和。

[0070] 5)加入400μL的酚：氯仿（1:1），13000rpm离心5分钟。

[0071] 6）取300μl上清液于新的1.5mLEP管中，加入600μl 95％的乙醇（DNA）。

[0072] 7）冰上孵育一小时，随后4℃，13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。

[0073] 8）用75％的酒精（DNA级）400μL清洗，4℃、13000rpm离心，轻轻取出上清液。

[0074] 9）将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。

[0075] 10）加入50μL ddH2O溶解DNA，用NanoDrop测定DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。

[0076] 2)PCR验证嗜热毁丝霉转化子

[0077] 以提取的基因组DNA为模版，用引物laeA_orf-F和laeA_orf-R对转化子进行基因PCR验证，Donor-laeA质粒为阳性对照，嗜热毁丝霉野生型基因组为阴性对照。对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳（120V电压，20分钟），在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在引物laeA_orf-F和laeA_orf-R引导下经PCR扩增获得了单一目的条带，大小与阳性对照质粒片段相同，表明laeA基因在野生型嗜热毁丝霉中成功敲除（称为laeA缺失菌株KolaeA）。

[0078] 3. 嗜热毁丝霉转化子糖耗速率测定

[0079] 1）采用0.05%吐温80灭菌水收集嗜热毁丝霉野生菌和laeA缺失菌株KolaeA的孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种于2%（W/V）葡萄糖液体培养基（葡萄糖20g，50×Vogel’s盐20 mL，定容体积到1L，高温高压灭菌），培养基体积为100mL/瓶，接种量
5
均为2.5*10 个/mL， 45℃条件下培养，摇床转速150 rpm。

[0080] 每隔12小时，取出1mL样品离心取上清液，测定葡萄糖含量；结果如图1所示，菌株KOlaeA菌株在48小时后将培养基中20g/L葡萄糖耗尽，相比野生型（60小时）糖耗速率提高25%，消耗同等葡萄糖时间缩短25%，说明基因laeA的缺失促进了嗜热毁丝霉对葡萄糖的利用速率, 显著缩短发酵时间。

[0081] 实施例2 LaeA失活能够促进嗜热毁丝霉生物量合成

[0082] 将实施例1中所构建的laeA缺失菌株KolaeA及其野生型菌株接种于2%（W/V）葡萄糖液体培养基中（葡萄糖20g，50×Vogel’s盐20 mL，定容体积到1L，高温高压灭菌），45℃条件下培养，摇床转速150 rpm。

[0083] 每隔12小时，取出100mL样品抽滤烘干，测定生物量。结果如图2所示，laeA缺失菌株KolaeA生长48小时后生物量达到8.27mg/mL，相比野生型（5.508mg/mL）提高了40.6%，说明laeA失活后有助于嗜热毁丝霉糖在液体培养基中生物量的积累。

[0084] 将laeA缺失菌株KolaeA与嗜热毁丝霉野生菌株点板于不同碳源平板（碳源2g，50×Vogel’s盐2mL，琼脂1.5g，定容体积到100mL，高温高压灭菌），分别以葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和纤维素为唯一碳源。用0.05%吐温80灭菌水收集获得的孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，点板的孢子量均为1*105个，点板的体积为4µL，35℃条件下培养4 5~天。结果如图3，在葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维素条件下，laeA缺失菌株KolaeA生长速率显著高于野生型菌株。

[0085] 同时，如图4所示，在液体培养基中以蔗糖为唯一碳源时，菌株KOlaeA菌株的生物量，相比野生型提高39.1%。

[0086] 综合可知，失活嗜热毁丝霉中laeA能够显著提高突变体对不同底物（葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、纤维素及蔗糖）条件下生长。

[0087] 实施例3 基因laeA失活促进有机酸发酵中碳源的利用

[0088] 本实施例主要针对嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术（Liu Q, Gao RR, Li JG, Lin LC, Zhao JQ,Sun WL, Tian CG. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnology for Biofuels. 2017, 10:1.）将目标基因laeA（Mycth_2294559）失活，促进突变体发酵液中碳源利用，缩短发酵周期。其中嗜热毁丝霉有机酸工业菌株JG207为前期所获得（Li J, et  al.  Direct production  of commodity  chemicals from lignocellulose using Myceliophthora thermophila. Metabolic engineering 2019.DOI:10.1016/j.ymben），通过代谢工程改造，在JG207菌种中构建了有机酸途径，可以利用多种复杂碳源高效合成苹果酸和琥珀酸。

[0089] 1. 突变体构建

[0090] 本实施例利用实施例1中构建sgRNA表达框U6p-laeA-sgRNA（如SEQ ID No.3所示）及其供体DNA表达载体Donor-laeA（如SEQ ID No.4所示），失活嗜热毁丝霉菌株JG207中基因laeA，得到突变体菌株JG207-KOlaeA。

[0091] 本实施例中嗜热毁丝霉JG207菌株laeA基因敲除过程中所使用的转化方法与验证方法均与实施例1中所述相同。

[0092] 2.失活laeA转化子发酵性能测定

[0093] 将所获得的突变体菌株JG207-KOlaeA与对照菌株嗜热毁丝霉JG207菌株接种于50mL发酵培养基中（磷酸二氢钾150mg/L，磷酸氢二钾150mg/L，硫酸镁100mg/L，氯化钙
100mg/L，生物素1mL/L，微量元素液1mL/L，葡萄糖75g，碳酸钙80g/L，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为50mL/瓶，45℃条件下培养，摇床转速150 rpm。

[0094] 每2天，取出1mL样品加入到1mL 20%（W/V）硫酸中，离心取上清液，测定发酵液中剩余葡萄糖含量与有机酸产量。结果如图5所示，在发酵4天后，突变体菌株JG207-KOlaeA菌株已经将葡萄糖全部耗尽，而菌株JG207需要6天时间将碳源耗尽，证明laeA基因的缺失加速了菌株JG207的耗糖速率，消耗相同量的葡萄糖，发酵时间显著缩短。

[0095] 同时突变体菌株JG207-KOlaeA菌株合成苹果酸和琥珀酸的速率也有所提高，如图6所示，在发酵4天时突变体菌株JG207-KOlaeA菌株苹果酸产量达到40.8g/L，比菌株JG207发酵4天苹果酸产量32.9g/L提高了24.5%；如图7所示，失活laeA后，菌株JG207-KolaeA的琥珀酸合成效率显著高于菌株JG207，其中第四天时，琥珀酸产量达到8.7g/L，相比对照菌株JG207提高38%；同时，生产相同量的苹果酸或琥珀酸，突变体所用时间显著缩短30%以上（对照菌4天生产苹果酸水平，突变体菌种只需3天即可达到或超过其产量）。

[0096] 综合可知，laeA基因的缺失加速了嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株JG207的耗糖速率，同时提高了菌株的产酸速率，缩短了发酵时间。

[0097] 实施例4 全局调控因子LaeA关键位点的鉴定与分析

[0098] 本实施例主要针对实施例1中所构建的laeA(Mycth_2294559)突变体菌株KolaeA，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术（Biotechnol Biofuels 2017,10:1）将LaeA蛋白质序列中关键位点突变/删除后导入目标菌株KolaeA，获得含有laeA突变体的菌株。

[0099] 其中LaeA蛋白突变体分别为laeAM1（删除第88位到第175位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.20所示，核苷酸序列如SEQ ID No.21所示）、laeAM2（删除第89到第96位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.22所示，核苷酸序列如SEQ ID No.23所示）、laeAM3（包含两个氨基酸残基突变分别为L89G和D90G，氨基酸序列如SEQ ID No.24所示，核苷酸序列如SEQ ID No.25所示）。

[0100] 具体实施过程如下：

[0101] 1. 载体构建

[0102] （1）sgRNA表达框构建

[0103] 通过软件sgRNACas9 tool设计抗性基因neo的靶标位点。采用融合PCR的方法将序列U6p启动子、neo靶标位点以及引导序列连接在一起，构建sgRNA表达框载体。

[0104] PCR反应体系与条件与实施例1中sgRNA表达框构建相同。

[0105] 通过融合PCR的构建的sgRNA表达质粒U6p-neo-sgRNA，其sgRNA转录调控元件序列如SEQ ID No.26所示。

[0106] （2）供体DNA载体构建

[0107] 本实施例中供体DNA片段由启动子PtrpC片段、目标基因下游约1000bp同源片段、laeAM1/laeAM2/laeAM3片段，通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶XbaI和EcoRV线性化的质粒PPk2BarGFP中，最终构建供体DNA片段Donor-laeAM1、Donor-laeAM2和Donor-laeAM3，其核酸序列分别如SEQ ID No.27、SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示。

[0108] PCR反应体系与条件与实施例1中供体DNA载体构建相同。

[0109] （4）Cas9表达框构建与实施例1相同

[0110] 本实施例中载体构建所用引物如下：

[0111] SEQ ID NO. 引物 序列（5’-3’）30 M-TrpC-F GTGGGCGCTTACACAGTACACGAGGACTTCGACGTTATCTGATATTGAAGGAGCATT
31 M-Bar-R CTGATGTCGAACCTCGGAGGACGTCAAGGTACATGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC
32 M-Ptef-F GTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCGTCACCGAGATTTGACATGTACCTTGACGTCCTC
33 Tef-laeAM-R GGAGTCCATTGCCACGGCCGAATCAGCGGAAGACATTCTGAAGAACGAAACTGGCGA
34 laeAM-up-F TTAAGCGCAAGTCGCCAGTTTCGTTCTTCAGAATGTCTTCCGCTGATTCGGCCGT
35 laeAM1up-R CCAGTCGATCTCGACTTGCTCAAAGTAGCCGTAGTAGATGTGAGGGGTTTCTTGGT
36 laeAM2up-R TATTTATCTGCCATGTCAATGCCCCAGATGATGTGAGGGGTTTCTTGGTTGGGGAAG
37 laeAM3up-R AATGCCCCAGATCCCTGTGCCACAGCCCAGTCCACCGATGTGAGGGGTTTCTTGGT
38 laeAM1down-F GTGCCCCCTTCCCCAACCAAGAAACCCCTCACATCTACTACGGCTACTTTGAGCA
39 laeAM2down-F GTGCCCCCTTCCCCAACCAAGAAACCCCTCACATCATCTGGGGCATTGACATGGC
40 laeAM3down-F GCCCCCTTCCCCAACCAAGAAACCCCTCACATCGGTGGACTGGGCTGTGGCACAGGGAT
41 M-LAE-R GTAATCCATGACAGCAACAACAGGCCAGGACTCACCGTGGCTTTCTGGCGGTA
42 M-laeDN-F GTTACACATCTTTACCGCCAGAAAGCCACGGTGAGTCCTGGCCTGTTGTTGCTG
43 M-laeDN-R GTCATGTGATTGTAATCGACCGACGGAATTGAGGATCTGCTGTAAAGAGAATTAGA[0112] 2、在嗜热毁丝霉菌株KolaeA导入laeAM突变体

[0113] 2.1 嗜热毁丝霉孢子准备

[0114] 将嗜热毁丝霉KOlaeA菌株在XM平板培养基[50×Vogel’s盐20mL，木糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌]上35℃培养7天后待用。

[0115] 2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化

[0116] 1）菌丝体与原生质体制备

[0117] 菌丝体与原生质体制备方法与实施例1中所述相同。

[0118] 2）原生质体转化

[0119] 取200µL原生质体于预冷的15ml离心管，加入50µL预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500µL Tris·HCl (1M pH 7.5))，10µLCas9表达框，sgRNA片段U6p-neo-sgRNA（SEQ ID No.20）后，分别与体DNA片段donor-laeAM1、donor-laeAM2、donor-laeAM3等比例混合溶液，放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取
3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素培养基A（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂糖7.5g，定容体积到1L，高温高压灭菌）中，平板中先倒入一层含抗生素PPT的培养基B（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂15g，定容体积到
1L，高温高压灭菌），再倒入一层混合原生质体的培养基A，35℃培养，3d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。

[0120] 2.3 嗜热毁丝霉转化子验证

[0121] 1）基因组提取

[0122] 采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体方法与实施例1中所述相同。

[0123] 2)PCR验证嗜热毁丝霉转化子

[0124] 以提取的基因组DNA为模版，用引物laeAM_orf-F和laeAM_orf-R对转化子进行基因PCR验证，Donor-laeAM质粒为阳性对照，嗜热毁丝霉WT-KOlaeA基因组为阴性对照。对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳（120V电压，20分钟），在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在引物laeAM_orf-F和laeAM_orf-R引导下经PCR扩增获得了单一目的条带，大小与阳性对照质粒片段相同，表明laeAM1、laeAM2和laeAM3分别导入至菌株KolaeA中，分别获得菌株wt-laeAM1、wt-laeAM2和wt-laeAM3。

[0125] 3. 嗜热毁丝霉转化子生长表型测定

[0126] 1）菌株糖耗速率测定

[0127] 菌株糖耗速率测定方法与实施例1中所述相同，结果如图7，菌株wt-laeAM1、wt-laeAM2和wt-laeAM3对底物葡萄糖的消耗速度与突变体KoLaeA相似，均显著高于野生型菌株，消耗同样葡萄糖，突变体菌种所用时间显著缩短。

[0128] 2）葡萄糖条件下菌株生物量合成

[0129] 菌株生物量合成测定方法与实施例2中所述相同，结果如图8，三种突变株在葡萄糖摇瓶中生物量积累均增加，在48小时，wt-laeAM1菌株生物量达到8g/L，wt-laeAM2菌株生物量达到6.4g/L，wt-laeAM3菌株生物量达到7.8g/L，均显著高于野生型菌株（4.95g/L）。

[0130] 3）蔗糖条件下的生物量合成

[0131] 在2%（W/V）蔗糖摇瓶中测定菌株的生物量积累，方法与实施例4中所述相同。结果如图9，WT-laeAM菌株生物量平均达到4.91g/L，相比野生型菌株（3.53g/L）提高39.1%。

[0132] 综合可知，LaeA蛋白的第88位至第175位氨基酸，第89至第96位氨基酸，以及第89位和第90位氨基酸均为其行使功能的关键区域，对三个区域进行删除或替换后均表现为LaeA突变菌株的表型，与敲除整个ORF表型是相同的。