CAND1在制备抑制心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药物中的应用

摘要

本发明公开了CAND1在制备抑制心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药物中的应用。所述的CAND1的mRNA的NCBI登录号为NM_027994.1。制备的药物可以只含CAND1，也可制成一种药物的复合物，其包含有效剂量的CAND1及药学上可接受的载体；其中，所述的载体可为病毒、胆固醇，纳米颗粒，壳聚糖，脂质体等，合成CAND1并利用上述载体包裹，可制成注射制剂，通过静脉或肌肉注射的方式，用于治疗心肌肥厚、心力衰竭以及心肌纤维化。

权利要求

1.CAND1(Cullin‑Associated And Neddylation‑Dissociated Protein 1)在制备抑制人心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药物中的应用。

说明书

CAND1在制备抑制心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药

物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及CAND1(Cullin‑Associated And Neddylation‑Dissociated Protein1)的新的制药用途，特别涉及CAND1在制备抑制心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药物中的应用，本发明属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 心肌肥厚(Cardiac Hypertrophy)是各种心血管疾病共有的病理性过程，心肌细胞在肥大初期是一种适应性的代偿过程，但随着心脏长期受到压力和容量负荷情况下，会引起心肌缺血、心律失常、心肌适应性降低等，最终会导致心力衰竭甚至猝死等严重后果。因此，病理性心肌肥厚的预防和治疗一直是心血管疾病领域研究的热点问题。心肌肥厚发生的分子机制尤为复杂，其发生时的分子水平变化主要包括：心肌细胞的电活动紊乱，能量代谢改变和mRNA翻译的增加等。此外，心肌细胞内蛋白质合成和降解也会出现失衡——合成增加，降解减少，导致蛋白质在胞内大量聚集，引起心肌细胞的体积增大，心力衰竭。

[0003] 泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin proteasome system，UPS)是蛋白质降解最重要的一条通路，降解约80％的细胞内蛋白质。UPS参与消除细胞内损伤或错误折叠的蛋白质，并且通过快速的蛋白溶解和调节细胞内功能蛋白，对维持蛋白质合成与降解的平衡，维持细胞正常大小起了重要调控作用。由于UPS系统在蛋白降解中发挥重要作用，因此，长期以来被认为是一个介导心肌萎缩的机制。泛素与所要被降解的蛋白结合(泛素化)并且将它们转移到蛋白酶被降解(蛋白水解)。在RING指域E3泛素连接酶中有cullin‑RING泛素连接酶(CRL)家族，它是UPS中最丰富的基因产物。有研究表明，CRL负责了高达20％的蛋白质用于蛋白酶体介导的泛素化降解。正是因为SCF介导的心肌细胞中错误折叠蛋白的泛素化可能在维持蛋白质平衡和维持心脏功能方面发挥重要作用。所以，对于了解调控CRL复合物的活性至关重要。

[0004] CAND1(Cullin‑Associated And Neddylation‑Dissociated Protein 1，也称TIP120A，TATA‑binding protein‑interacting protein 120A)是CRL复合物最重要的调节因子，其通过促进了CRL复合物中底物受体FBP蛋白家族的装配，完成了对CRL复合物的调控作用。但是，关于CAND1在心血管领域的研究知之甚少。因此发现不同病理生理情况下CAND1的变化，并阐明其功能，将会对心脏疾病的治疗带来新的靶标和产生新的干预策略。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供CAND1在治疗心脏疾病中的新用途。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用多种技术手段证明了CAND1对心脏疾病的具有一定的预防和治疗价值，最终确定CAND1可以作为制备治疗心肌肥厚、心力衰竭以及心肌纤维化的防治药物。

[0007] 因此，在本发明的研究基础上，本发明提出了CAND1(Cullin‑Associated And Neddylation‑Dissociated Protein 1)在制备抑制心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药物中的应用。

[0008] 其中，优选的，所述的CAND1的mRNA的NCBI登录号为NM_027994.1。

[0009] 本发明的CAND1在制备抑制心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化药物中的应用，制备的药物可以只含CAND1，也可通过制成一种药物复合物的方式实现，包含有效剂量的CAND1及药学或临床上可接受的载体；所述的CAND1的mRNA的NCBI登录号为NM_027994.1。

[0010] 其中，优选的，所述的载体为病毒、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。

[0011] 其中，优选的，所述的药物组合物为注射制剂。

[0012] 通过静脉或肌肉注射的方式，用于治疗心肌肥厚、心力衰竭以及心肌纤维化，进而用于预防和治疗心肌梗死、心衰等心脏疾病。

附图说明

[0013] 图1为pPB[Exp]‑alphaMHC_long>mCand1载体结构图；

[0014] 图2为CAND1转基因鼠的鉴定；

[0015] 图3为M‑mode代表图及主动脉弓血流速度；

[0016] 图4利用构建的CAND1转基因鼠，实施主动脉弓缩窄术6周后假手术组和手术组小鼠的心功能状态；

[0017] 图5为利用HE染色检测假手术组和手术组心肌细胞面积情况；

[0018] 图6为利用WGA和MASSON染色检测心肌细胞面积和心肌纤维化情况；

[0019] 图7为pAV[Exp]‑CAG>mCand1[NM_027994.1]/Myc:IRES:EGFP载体图谱；

[0020] 图8为注射腺病毒两周后，检测腺病毒在心肌的表达情况；

[0021] 图9为给予野生型小鼠主动脉弓缩窄术后2周，对假手术组和手术组分别实施腺病毒注射，在10周后检测心功能状态；

[0022] 图10为利用MASSON染色检测假手术组和手术组心肌纤维化情况。

具体实施方式

[0023] 下面通过药理性及临床观察实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

[0024] 实施例1 CAND1转基因鼠对病理性心肌肥厚的保护作用

[0025] 1、构建CAND1的转基因小鼠

[0026] 建立心肌高表达CAND1转基因小鼠：RT‑PCR法克隆CAND1基因,把该基因插入心肌α肌球蛋白重链启动子下游,构建转基因表达载体,即：pPB[Exp]‑alphaMHC_long>mCand1[NM_027994.1]，其载体结构图如图1所示，通过显微注射法建立心肌细胞高表达CAND1转基因的C57BL/6J小鼠。

[0027] 构建CAND1转基因鼠的PCR引物序列如下所示：

[0028] Transgene PCR primer F1：5’‑AGAGCCATAGGCTACGGTGTA‑3’[0029] Transgene PCR primer R1：5’‑CAAGGCATTTGACAGCTAAGTTC‑3’；

[0030] Transgene PCR primer F2:5’‑TGTTGAGCCACTGCGTGCTAC‑3’

[0031] Transgene PCR primer R2:5’‑AGCCAGAAGTCAGATGCTCAAGG‑3’[0032] 利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平。检测结果如图2所示，转基因小鼠的三个系中CAND1蛋白水平均出现显著上调，其中1系得表达含量最高(P<0.05)，因此，后续实验中均采用1系的小鼠进行实验研究。研究该基因在心肌表达水平的变化对动物的影响,探索该基因的功能。

[0033] 2、主动脉弓缩窄术(TAC)模型的建立

[0034] 实验分为四个实验组：野生型假手术组，CAND1转基因假手术组，野生型的TAC模型组，CAND1转基因TAC模型组。

[0035] 称取小鼠体重，按照比例0.1mL/10g采用腹腔注射法给与小鼠注射阿弗汀。使用脱毛膏或者剪刀将颈部的毛发去除，将小鼠仰卧位固定于手术台并采用碘伏擦拭消毒。将呼吸机插入小鼠的气管中，使其呼气频率与呼吸机频率一致，以此辅助麻醉后小鼠的呼吸。器械使用之前需要经过高温高压灭菌。镊子、剪刀、止血钳等器械擦拭酒精消毒。剪开气管周围的皮肤，钝性分离气管周围的组织直至暴露出气管，拨开胸骨处肌肉找到V形胸骨，沿着胸骨中间剪开0.5cm左右，扒开腺体寻找主动脉弓，主动脉弓呈V型；将7‑0缝合线穿过主动脉弓，钩住主动脉弓之后，将线头抽出，27‑G的垫针、线管与缝合线结扎，然后慢慢取出垫针。此时，如果造模成功，小鼠气管右侧的颈总动脉的血管跳动频率非常快，左侧没有明显变化。证明本次造模是成功的。接下来，擦掉淤血，逐级将开口处进行缝合，缝合胸骨采用的是6‑0缝合线。待小鼠的自主呼吸恢复后，撤去呼吸机即可。将所有手术后的模型小鼠至于干净通风的笼具中。定期查看水、粮食及饲养情况，7天后开始记录小鼠的死亡例数。6周后，检测主动脉弓的血流速度及小鼠射血分数、LVEDd、LVPWd等肥厚相关指标。所有录入实验组小鼠主动脉弓的血流速度范围在1800mm/s‑2500mm/s，结果如图3所示。

[0036] 3、结果：

[0037] 实施主动脉弓缩窄术(TAC)6周后，采用超声检测各个实验组小鼠的心功能状态，如图4所示，通过心动超声，假手术组的野生型小鼠和CAND1转基因鼠并未出现差异，而手术组中的野生型和CAND1转基因鼠相比，CAND1转基因鼠的心功能出现了显著的改善，并且CAND1转基因鼠的心体重比也显著降低(P<0.05)。此外，CAND1转基因的鼠的存活率较高。这说明CAND1转基因鼠具有明显的抑制心肌肥厚，改善心脏功能的作用。为了进一步观察CAND1的抑制心肌肥厚的作用，采用HE染色、WGA染色和MASSON染色实验，分别检测了心肌细胞的大小和心肌纤维化的情况。图5、图6结果显示，CAND1转基因鼠具有明显的抑制心肌细胞肥大的作用，并且抑制了心肌纤维化的发生(P<0.05)。

[0038] 实施例2 构建CAND1腺病毒载体，观察CAND1对病理性心肌肥厚、心力衰竭的治疗作用

[0039] 1、CAND1腺病毒载体的构建

[0040] 从NCBI网站上得到目的基因CAND1(NM_027994.1)CDS区信息，从文库中调出基因，克隆至腺病毒系统穿梭载体。将携带目的基因片段的穿梭质粒线性化后与腺病毒大骨架质粒共转入在特定的大肠杆菌中进行同源重组，由于腺病毒骨架质粒是氨苄抗性，而与穿梭质粒同源重组后，氨苄抗性丢失，同时表达卡那霉素抗性，因此，通过抗性的变化可筛选出腺病毒载体骨架重组子，挑取重组子进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的克隆，命名为pAV[Exp]‑CAG>mCand1[NM_027994.1]/Myc:IRES:EGFP，其载体图谱如图7所示。

[0041] 2、CAND1腺病毒载体对心肌肥厚、心力衰竭的治疗作用

[0042] 选用体重20‑25g成年健康C57/B6小鼠，分为4组：(1)假手术组(NC‑V)；(2)假手术10
组(CAND1‑V)；(3)手术组(NC‑V)；(4)手术组(CAND1‑V)。经尾静脉将1×10 VP的腺病毒以及空载体分别注入四组小鼠体内。2周后，检测病毒的表达情况，如图8结果所示，由于病毒携带GFP，所以在荧光显微镜下明显的观察到病毒注射组的GFP的表达量明显高于野生型组。
同时，采用western blot实验结果显示：病毒注射组的CAND1蛋白表达也出现了明显的上调(P<0.05)。这证明了本实验的病毒感染是真实有效的。接下来，对手术组的小鼠实施主动脉弓缩窄术(TAC)，方法同实施例1，2周后，对四个实验组进行腺病毒以及空载体的注射。第6周时，对实验组继续进行腺病毒及空载体的注射。第10周时，对实验组小鼠进行心动超声检测，如图9结果所示：CAND1病毒注射组小鼠的心功出现了较为显著的改善作用，并且，心体重比也出现下降的情况(P<0.05)。接下来，如图10所示，通过Masson染色等一系列形态学分析来看，CAND1病毒注射组的小鼠具有明显的抑制心脏肥厚、心力衰竭的作用，并且对TAC模型后心脏的纤维化程度也具有一定的改善作用。

[0043] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。