肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其构建方法

摘要

本发明提供了一种肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其制备方法，该纳米诊疗复合物包括三个部分：以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体，与该载体相连接的肿瘤靶向归巢穿透肽，以及携载到该载体上的光敏剂。该纳米诊疗复合物具有肿瘤靶向深度穿透性、肿瘤微环境响应性原位产氧和MRI/荧光成像功能，可大大提高光动力治疗疗效。

权利要求

1.肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，包括以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体，与该复合产氧型载体以化学共价连接方式连接的肿瘤靶向归巢穿透肽，以及与该复合产氧型载体以π‑π堆积作用、疏水力作用、氢键或静电作用连接的光敏剂；

其中，以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体是通过氨基化阳离子的修饰在氧化石墨烯表面原位生长MnO2纳米粒子制得；

所述肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物通过以下方法制备得到：

（1）合成GO‑MnO2复合产氧型载体将GO与氨基化多聚阳离子聚合物进行自组装或者进行酰胺反应，制得GO‑多聚阳离子复合物，向GO‑多聚阳离子复合物中加入高锰酸钾溶液，室温下反应12‑36h，制得；氨基化多聚阳离子聚合物与GO的质量比为0.25：1‑2：1；GO与高锰酸钾的质量比为1:8‑12；氨基化多聚阳离子聚合物为聚（丙烯胺盐酸盐）；

（2）制备靶向穿透型产氧纳米复合载体合成FITC标记的巯基化肿瘤靶向归巢穿透肽，然后将GO‑MnO2复合产氧型载体、马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯和FITC标记的巯基化肿瘤靶向归巢穿透肽按重量比为1:

0.1‑1:0.1‑1混合，室温反应20‑28h，制得；

（3）制备靶向穿透型纳米诊疗复合物将光敏剂与靶向穿透型产氧纳米复合载体自组装制得靶向穿透型纳米诊疗复合物。

2.根据权利要求1所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，肿瘤靶向归巢穿透肽为LyP‑1、F3、iRGD或tLyP‑1。

3.根据权利要求1所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，光敏剂为近红外光激发下能够产生单线态氧的有机荧光染料。

4.根据权利要求3所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，光敏剂为二氢卟吩类、卟啉类、罗丹明类、亚甲基蓝类或菁类。

5.根据权利要求1所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，氨基化多聚阳离子聚合物与GO的质量比为1:1。

6.根据权利要求1所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，GO‑MnO2复合产氧型载体、马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯和FITC标记的巯基化肿瘤靶向归巢穿透肽的重量比为1:0.18:0.18，巯基化肿瘤靶向归巢穿透肽为巯基化tLyP‑1。

7.根据权利要求1所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，光敏剂与靶向穿透型产氧纳米复合载体的质量比为0.1‑4：1。

8.根据权利要求7所述的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，其特征在于，光敏剂与靶向穿透型产氧纳米复合载体的质量比为1:1。

说明书

肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物

及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种新型的肿瘤非侵袭性疗法，其基本原理是通过适当波长的激光激发一种蓄积在靶细胞或组织中的光敏剂，发生光化学反
应，使之与氧分子作用形成活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，从而产生细胞毒性杀
死肿瘤细胞，达到抗肿瘤目的。与化学疗法等其他方法相比，光动力疗法具有较低的毒副作
用、较高的选择性以及微创高效等优势。自20世纪70年代应用于临床以来，PDT已被广泛研
究用于治疗多类实体肿瘤和其他疾病。

[0003] 然而，PDT的进一步临床应用仍然受到许多棘手问题的限制。从常见的PD T II型光化学反应的原理可知，光敏剂、氧浓度和激光是其最重要的三要素。氧气是决定ROS产率
的最重要因素之一，然而随着PDT的进行，氧气的浓度逐渐被消耗，最终反而抑制了ROS的产
生。除了这种自限制因素外，众多周知的是实体肿瘤内部微环境处于缺氧状态；在绝大多数
肿瘤中，乏氧百分数从10％增加到30％，氧气压力低于15mm Hg。因此，肿瘤细胞通过乏氧应
答调控因子(HIF‑1)调控一系列肿瘤生长与代谢行为，如促进葡萄糖转运蛋白(GLUT)的表
达、促进糖酵解、下调线粒体氧化磷酸化的速率等。最为重要的是，乏氧极大地限制了PDT中
细胞毒性ROS的产率，致使肿瘤乏氧中心的侵袭性较强的细胞不能被有效杀灭，导致治疗抵
抗，引起肿瘤耐药。针对此问题，目前已经提出了多种缓解肿瘤缺氧的策略，例如高压氧注
射、微泡携带氧、金属与过氧化氢反应原位产生氧、全氟化碳或血红蛋白携载氧进行输送
等。但是这些方法仍然不能有效地解决肿瘤缺氧限制肿瘤PDT疗效的问题，同时某些方法存
在氧气携载效率不高，操作繁琐，可能会引起其他生物毒性等问题，因此仍迫切需要开发新
型技术以解决这一难题。

[0004] 当前，MnO2纳米材料由于其独特的化学反应活性、可降解性、较高的生物相容性等优异性质，引起研究者们极大的兴趣。(1)纳米MnO2与H2O2反应，尤其在瘤内酸性环境下与内
+
源性H2O2反应，消耗H ，释放氧气，直接实现瘤内原位增氧，改善乏氧状态。研究结果揭示，将
MnO2 NPs引入到纳米药物中，极大地提高了放疗、化疗、PDT等疗效。(2)纳米MnO2与H2O2反应
2+ 2+
时自身分解为Mn ，Mn 易被生物体迅速排出，因此避免了纳米MnO2在体内聚集而产生毒性，
2+
显示了优异的生物相容性。更为重要的是，Mn 具有5个自旋平行的未配对电子，是优异的磁
共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)对比剂。(3) 纳米MnO2还可与肿瘤细胞内较
高浓度的谷胱甘肽反应，能够改善瘤内氧化还原应激状态。因此，纳米MnO2是响应肿瘤微环
境多重生化特征，并特异性在肿瘤组织产氧与释放MRI成像探针的优异多功能材料。在各种
MnO2纳米材料中， MnO2 NPs具有合成简单、快速、原料便宜、比表面积大、尺寸可控、易于和
其它纳米材料复合等显著优点，但是，粒径较小的MnO2 NPs其光敏剂载药效率不高，尤其是
难以与疏水性的光敏剂复合，仍然需要其他的载体材料。

[0005] 另一方面，肿瘤内部乏氧状态常常是从肿瘤边缘到肿瘤内部，逐渐增强，解决肿瘤缺氧的问题，与此同时，还需要考虑如何光敏剂和产氧载体递送到肿瘤乏氧中心的问题。尽
管现有的研究认为纳米药物可以通过肿瘤组织增强透过性及滞留效应(即EPR效应)，将光
敏剂(>100nm)被动靶向递送至肿瘤；但由于肿瘤内部无序的血管系统、较高的组织间隙压
力和密集的胞外基质等病理障碍，纳米光敏药物仅聚集于肿瘤血管周围，难以在瘤内组织
有效扩散，更无法到达乏氧区域，极大地限制了其疗效。目前，为了增加纳米药物的肿瘤组
织渗透性，通过在纳米载体表面修饰肿瘤归巢穿透肽，或利用肿瘤微环境内响应性分子(如
基质金属蛋白酶，弱酸性)使纳米粒子的尺寸在瘤内解体或逐渐变小等策略逐渐被报道。然
而，但是，这些方法并没有能够同时实现改善肿瘤内部缺氧的问题。

[0006] 因此，考虑到肿瘤内部复杂的微环境和肿瘤深部缺氧逐渐加深的特征，如何从肿瘤内部缺氧的缓解和肿瘤内部靶向渗透相结合的角度提高肿瘤PDT疗效，成为本领域技术
人员亟待解决的问题。因此，构建基于纳米载体的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿
透型纳米诊疗体系对于肿瘤治疗具有重要意义。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其制备方法，在肿瘤治疗中运用本发明提供的纳米诊疗复
合物，能够高效靶向穿透至肿瘤深处，并同时在肿瘤深处原位产生氧气，进而增强肿瘤内部
单态氧的产率，并能同时进行磁共振/荧光成像，最终实现磁共振/荧光成像引导的恶性肿
瘤高效PDT的目的。

[0008] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0009] 一种肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，包括以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体，与该复合产氧型载体以化学共价连接方式连接的
肿瘤靶向归巢穿透肽，以及与该复合产氧型载体以π‑π堆积作用、疏水力作用、氢键或静电
作用连接的光敏剂；

[0010] 其中，以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体是通过氨基化阳离子的修饰在氧化石墨烯表面原位生长MnO2纳米粒子制得。

[0011] 进一步地，肿瘤靶向归巢穿透肽为LyP‑1、F3、iRGD或tLyP‑1，优选tLyP‑1。

[0012] 进一步地，光敏剂为可被近红外光(波长620～1100nm)激发的能够产生单线态氧的有机荧光染料，具体为二氢卟吩类、卟啉类、酞菁类、罗丹明类、亚甲基蓝类、菁类(如ICG、
IR820、IR825)等，优选方案为二氢卟吩类(如Ce6)。

[0013] 上述肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物的制备方法，包括以下步骤：

[0014] (1)合成GO‑MnO2复合产氧型载体

[0015] 将GO与氨基化多聚阳离子聚合物进行自组装或者进行酰胺反应，制得GO‑ 多聚阳离子复合物，向GO‑多聚阳离子复合物中加入高锰酸钾溶液，室温下反应12‑36h，制得；多聚
阳离子聚合物与GO的质量比为0.25：1‑2：1；GO与高锰酸钾的质量比为1:8‑12，优选1:8.4；

[0016] (2)制备靶向穿透型产氧纳米复合载体

[0017] 合成FITC标记的巯基化肿瘤靶向归巢穿透肽，然后将GO‑MnO2复合产氧型载体、马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯和FITC标记的巯基化肿瘤靶向归巢穿透肽按重量比
为1:0.1‑1:0.1‑1混合，室温反应20‑28h，制得；

[0018] (3)制备靶向穿透型纳米诊疗复合物

[0019] 将光敏剂与靶向穿透型产氧纳米复合载体自组装制得靶向穿透型纳米诊疗复合物。

[0020] 进一步地，氨基化多聚阳离子聚合物为聚(丙烯胺盐酸盐)(PAH)、多聚赖氨酸或聚乙烯亚胺，优选PAH，PAH的分子量范围为15‑50.0kDa，优选分子量为15000，分子量的单位为
道尔顿。

[0021] 进一步地，氨基化多聚阳离子聚合物与GO的质量比为1:1。

[0022] 进一步地，高锰酸钾反应浓度为10‑20mM，优选高锰酸钾反应浓度为13.3mM，反应时间优选24h。

[0023] 进一步地，GO‑MnO2复合产氧型载体、马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯和FITC标记的巯基化tLyP‑1的重量比为1:0.18:0.18。

[0024] 进一步地，光敏剂与靶向穿透型产氧纳米复合载体的质量比为0.1‑4：1。

[0025] 进一步地，光敏剂与靶向穿透型产氧纳米复合载体的质量比为1:1。

[0026] 本发明提供的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其制备方法，具有以下有益效果：

[0027] 本发明提供的肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物主要包括三个部分：以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体，与该载体相连接的肿瘤靶
向归巢穿透肽，以及携载到该载体上的光敏剂。以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型
载体中氧化石墨烯的粒径为150nm～500nm，其表面拥有羧酸残基、羟基和环氧基团，可以通
过化学修饰进行功能化，即可以在其表面原位生长小尺寸的MnO2纳米粒子，同时其二维平
面的结构以及芳香结构，可以通过π‑π堆积作用，疏水力作用、氢键和静电作用等方式携载
多种药物，比如光敏剂。而肿瘤靶向归巢穿透肽具有独特肿瘤组织靶向性和穿透能力的小
分子肽，其作用机理主要为C末端法则(C‑end Rule,CendR)途径,即归巢穿透肽的自由C端
必须含有(R/K)XX(R/K)基序，它们隐藏在肽段内部；当其与肿瘤细胞表面的受体(如整合
素)结合后，被蛋白酶水解切割，暴露出隐藏的 CendR基序，进而特异性地结合到靶细胞表
面的神经毡蛋白受体(Neuropilin Receptors,NRP)的b1结构域，触发细胞发生一种特殊的
内吞/跨细胞转运作用，将归巢穿透肽所携载的“货物”运输到肿瘤组织深处。而光敏剂就是
可被近红外光(波长620～1100nm)激发的能够产生单线态氧的有机荧光染料，当纳米诊疗
复合物上结合上光敏剂后可以被激发参与氧气反应，生成细胞毒性单线态氧。总之，本发明
中利用GO的平面结构和巨大比表面积，通过氨基化阳离子的修饰在GO表面原位生长MnO2纳
米粒子，同时修饰上靶向归巢穿透肽，靶向归巢穿透肽能特异性地结合到细胞表面的神经
毡蛋白受体(Neuropilin Receptors,NRP) 的b1结构域，触发细胞发生一种特殊的内吞/跨
细胞转运作用，进而穿透进入三维椭球体的内部，进而靶向肿瘤缺氧中心，肿瘤微环境及其
细胞内H2O2与MnO2纳米粒子反应产生氧气，从而缓解肿瘤深处缺氧微环境；再通过GO‑MnO2
的π‑π共轭和疏水作用对光敏剂高效共载，将光敏复合药物靶向穿透肿瘤深度，光敏剂被激
发从而与氧气反应，生成细胞毒性单线态氧，从而可以更好地缓解肿瘤深处的缺氧状态，大
大提高了光动力治疗疗效。

[0028] 本发明制得的纳米复合物还具有肿瘤微环境响应性原位产氧和MRI成像功能，具体为：本发明纳米复合物利用肿瘤微环境的H2O2能够原位与MnO2纳米粒子反应产生氧气，同
2+
时释放Mn ，可以实现肿瘤深处缺氧状态的改善，从而提高光动力治疗效果，有利于减少剂
2+
量，明显降低毒副作用；与此同时，利用Mn 为T1‑MRI成像探针，进行MRI成像，检测纳米诊疗
体系在肿瘤内部的靶向蓄积情况；同时光敏剂自身也可作为荧光探针进行荧光成像，检测
纳米诊疗体系在小鼠各组织和肿瘤内部的分布和代谢情况，可实现磁共振/荧光成像指导
的光动力治疗，极大提高肿瘤光动力治疗效率。另外，也可以避免MnO2纳米粒子在体内聚集
而产生毒性，显示了优异的生物相容性。

[0029] 基于上述优势，本发明制得的纳米复合物可用于治疗包括但不限于器官表面或者内部出现的各种实体瘤，包括有皮肤癌、恶性黑色素瘤、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺
癌、喉癌、甲状腺癌，舌癌，前列腺癌、阴茎癌、睾丸肿瘤，阴道恶性肿瘤、外阴恶性肿瘤中的
一种。治疗时可以采用瘤内直接给药或静脉给药的方式进行。

附图说明

[0030] 图1为GO‑MnO2产氧复合载体的紫外‑可见吸收光谱和Zeta电位结果。

[0031] 图2为GO‑MnO2产氧复合载体的透射电镜表征结果。

[0032] 图3为GM@tLyP‑1载体的Zeta电位、紫光‑可见吸收光谱、荧光光谱和 tLyP‑1的载药率和包封率。

[0033] 图4为GM@tLyP‑1/Ce6的结构示意图。

[0034] 图5为GM@tLyP‑1/Ce6的紫外‑可见吸收光谱、荧光光谱、Zeta电位和水合粒径图。

[0035] 图6为GM@tLyP‑1/Ce6的产氧性能和活性氧性能表征结果。

[0036] 图7为GM@tLyP‑1/Ce6的体外磁共振成像T1造影性能表征结果。

[0037] 图8为GM@tLyP‑1/Ce6的体外细胞毒性、靶向性内吞和穿透的检测结果。

[0038] 图9为GM@tLyP‑1/Ce6的体外靶向性产氧增强性光动力抗癌效果。

[0039] 图10为GM@tLyP‑1/Ce6体内肿瘤缺氧改善结果。

[0040] 图11为GM@tLyP‑1/Ce6体内MRI/FL双模成像结果。

[0041] 图12为GM@tLyP‑1/Ce6体内增强ROS的结果。

[0042] 图13为GM@tLyP‑1/Ce6体内产氧增强型光动力抗肿瘤结果。

具体实施方式

[0043] 实施例1

[0044] 一种肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物，包括以氧化石墨烯为基底的GO‑MnO2复合产氧型载体，

[0045] 与该复合产氧型载体以化学共价连接方式连接的肿瘤靶向归巢穿透肽，以及与该复合产氧型载体以π‑π堆积作用、疏水力作用、氢键或静电作用连接的光敏剂，具体制备过
程如下：

[0046] 第一步，合成GO‑MnO2复合产氧型载体

[0047] 将1mL聚(丙烯胺盐酸盐)(PAH)溶液(浓度为1mg/mL)在磁力搅拌条件下，逐滴加入2mL氧化石墨烯溶液(浓度为0.5mg/mL)，反应过夜，制得 GO‑PAH复合物；向GO‑PAH复合物中
逐滴加入1mL高锰酸钾溶液(8.4mg/mL)，室温搅拌过夜，然后高速离心溶液(15000rpm,
15min)，弃去上清，沉淀用去离子水洗三遍，加入0.1mL去离子水定容，得GO‑MnO2产氧复合
载体。

[0048] 对制得的GO‑MnO2产氧复合载体进行如下检测：

[0049] 1、紫外‑可见吸收光谱检测和Zeta电位检测，结果见图1。其中，图1a为紫外‑可见吸收光谱检测结果，图1b为Zeta电位检测结果。

[0050] 由图1a可知，GO‑MnO2产氧复合载体(缩写为GM)中具有MnO2的典型的紫外‑可见吸收峰(300‑400nm)；由图1b可知GO‑MnO2产氧复合载体的Zeta电位由GO‑PAH的+47.3mV下降
到+10.8mV。

[0051] 2、透射电镜表征

[0052] 通过透射电镜表征，如图2所示，其中，图2中(a)为GO的透射电镜(TEM) 表征图；(b)为GM的TEM图；(c)为GM的EDS元素分析图；(d)为GM 的STEM Mapping元素分布图。

[0053] 由图2可知，GO‑MnO2的TEM图上出现了明显的黑色纳米颗粒，通过EDS 元素分析证实该黑色纳米颗粒为MnO2 NPs。进一步通过STEM Mapping元素分布图证明GO‑MnO2上C元素、
Mn元素、N元素分布均匀，且几乎无游离状态，证明了GO‑MnO2产氧复合载体的成功合成。

[0054] 第二步，合成靶向穿透型产氧纳米复合载体GM@tLyP‑1

[0055] 将0.1mL GM溶液(GM溶液浓度为1mg/mL，GM质量为0.1mg)用PBS 缓冲液稀释至5.0mL，称取18μg的双功能PEG(NHS‑PEG‑MAL，马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯)和18
μg的FITC标记的巯基化tLyP‑1，迅速加入到反应瓶中，室温下搅拌过夜。反应结束后，高速
离心(15000rpm,15min)后，弃去上清，反复洗涤三次去除未结合上的NHS‑PEG‑MAL和tLyP‑
1。加入2mL 去离子水定容，得到GM@tLyP‑1载体溶液，4℃下保存。

[0056] 通过Zeta电位、紫光‑可见吸收光谱、荧光光谱对GM@tLyP‑1载体进行表征，表征结果见图3。图3中(a)为GO、GM、GM@tLyP‑1的Zeta电位；(b) 为GM、GM@tLyP‑1和tLyP‑1的紫外‑
可见吸收光谱图；(c)为GM@tLyP‑1和 tLyP‑1的荧光光谱图；(d)为tLyP‑1的载药率及包封
率。

[0057] 通过检测GO、GM、GM@tLyP‑1的Zeta电位，发现连接了tLyP‑1后，Zeta 电位进一步升高到+23mV；而紫外‑可见吸收光谱中480nm处出现FITC标记的 tLyP‑1特征峰，以及荧光
光谱中518nm左右出现FITC标记的tLyP‑1的特征峰，上述结果共同证明了tLyP‑1的成功修
饰；紫外‑可见吸收光谱测得tLyP‑1的在完全包封时的载药率为18％。

[0058] 第三步，制备靶向穿透型纳米诊疗复合物GM@tLyP‑1/Ce6

[0059] 取2mL GM@tLyP‑1载体溶液(0.5mg/mL)，在低速磁力搅拌下，加入1mL Ce6溶液(1mg/mL)，室温下搅拌过夜反应后，高速离心(15000rpm,15min)后弃上清，反复洗涤三次去
除未结合Ce6。加入2mL去离子水定容，得到 GM@tLyP‑1/Ce6纳米诊疗复合物溶液，4℃下保
存。

[0060] 制得的GM@tLyP‑1/Ce6纳米诊疗复合物的示意图如图4所示。再通过紫外 ‑可见吸收光谱、荧光光谱和粒度仪对GM@tLyP‑1/Ce6纳米诊疗复合物进行合成表征，结果见图5；其
中，(a)为各个纳米体系的紫外‑可见光谱图；(b)为 GM@tLyP‑1/Ce6和Ce6的荧光光谱图；
(c)为各个纳米体系的Zeta电位结果； (d)为各个纳米体系的水动力直径及实物图(插图，1
为GO，2为GM，3为GM@tLyP‑1，4为GM@tLyP‑1/Ce6)。

[0061] 如图5a所示，最终的靶向穿透型纳米诊疗复合物GM@tLyP‑1/Ce6在350nm 附近出现二氧化锰的特征吸收峰，在404nm和660nm附近出现Ce6的特征吸收峰，证明了GM@tLyP‑1/
Ce6的成功合成；如图5b所示，荧光光谱结果显示 GM@tLyP‑1/Ce6出现了显著的Ce6荧光淬
灭，这是因为Ce6负载于GO之上所导致的，进一步证明Ce6的成功负载。通过粒度仪进行了
Zeta电位和水动力直径检测，如图5c所示，在负载Ce6之后，GM@tLyP‑1/Ce6的电位由GM@
tLyP‑1 的+23mV变为‑26mV，水动力直径也逐渐增大；进一步，通过光谱法计算可得 GM@
tLyP‑1/Ce6的载药率最高达45％。以上结果进一步验证了GM@tLyP‑1/Ce6 的成功合成。

[0062] 实施例2 GM@tLyP‑1/Ce6体外产氧、单线态氧产率和MRI成像性能测试

[0063] 本发明所制得的靶向穿透型纳米诊疗复合物的性能，主要通过以下方法进行评价：

[0064] 1、产氧性能表征

[0065] 将等量100mg的GM@tLyP‑1/Ce6溶液分别在pH值为6.5和7.4的条件下与100μM过氧化氢溶液反应，并设置空白对照组。用JPBJ‑608便携式溶解氧分析仪每隔10s检测溶液氧含
量。

[0066] 如图6a所示，在H2O2溶液(100μM)+GM@tLyP‑1/Ce6组，可以快速触发反应产生O2，且随着酸度的增加产氧速率显著增加，证明了GM@tLyP‑1/Ce6 纳米复合物具有良好的产氧效
果。

[0067] 2、活性氧性能表征

[0068] 采用单线态氧探针(SOSG)检测光敏剂的单线态氧产率，无单线态氧存在时， SOSG分子内的电子转移淬灭了生色团的荧光；单线态氧存在时，SOSG形成内过氧化物，导致电子
转移发生改变，生色团的荧光(530nm)处得到恢复。因此， SOSG在530nm处的荧光强度的上
升量直接反映了单线态氧的产量。

[0069] 在0.5mL GM@tLyP‑1/Ce6溶液中(equiv.[Ce6]＝5μM)加入0.5μL单线态氧荧光探针SOSG母液(SOSG终浓度为2.5μM)，充分混合均匀后，利用660nm 的激光器(功率为2W/
2
cm)，激发溶液(0、2、4、6、8、10、12min)后，检其 530nm的荧光发射光谱。

[0070] 如图6b所示，GM@tLyP‑1/Ce6纳米复合物随着光照时间的增加，SOSG信号逐渐增强，证明了GM@tLyP‑1具有良好的单线态氧产率。但是与自由Ce6 相比，在相同条件下的
SOSG的荧光强度略弱，这是由于石墨烯载体与Ce6之间发生能量转移所致，但仍可进一步用
于光动力治疗。

[0071] 3、体外磁共振成像功能检测

[0072] 将不同Mn浓度的GM@tLyP‑1/Ce6纳米复合物溶液固定整齐放入磁共振成像仪中，调节参数(T1测试：IR序列，SFO1＝22.106MHz，P1＝16.20μs，P2＝32.80 μs，SW＝200KHz，
RG1＝20，DRGl＝3，PRG＝3，TW＝25000ms，NTI＝30，NS＝2)，检测得到各样品磁共振成像图
像。

[0073] 如图7所示(图7b中每组柱形图从左到右分别代表pH＝7.4，pH＝6.5和 pH＝5.0)，可以观察到随着pH值的降低以及Mn含量的升高，T1信号明显变亮。因此，在酸性条件下，T1信
号随Mn浓度增强而增强，GM@tLyP‑1/Ce6具有显著的T1‑MRI造影效果。

[0074] 实施例3 GM@tLyP‑1/Ce6体外细胞毒性、靶向性内吞与穿透实验

[0075] 按实施例1所提供的制备方法制备的GM@tLyP‑1/Ce6，小鼠乳腺癌细胞4T1 由ATCC购买，使用RPMI 1640培养基培养4T1细胞。

[0076] 1、GM@tLyP‑1载体的细胞毒性实验

[0077] 将处于对数生长期的4T1细胞接种于96孔板中(密度为1.0×104个/每孔)，培养24h。去掉孔板内的培养液，将不同浓度的GM@tLyP‑1(25.0、50.0、100.0、 150.0、200.0、
250.0μg/mL)加入到孔板内(每个浓度重复三个孔)，继续培养 12h。去掉细胞培养液，用PBS
缓冲反复清洗三次。每孔加入100μL配置好的 CCK‑8工作液，继续孵育45min。通过酶标仪检
测在450nm处的吸光值(OD 值)，按公式计算出细胞存活率：存活率＝(实验组OD值‑空白组
OD值)‑(对照组OD值‑空白组OD值)。

[0078] 如图8a所示(每组柱形图从左到右分别代表24h、48h)，不同浓度的 GM@tLyP‑1载体与4T1细胞共孵育24h和48h细胞的存活率，可以看到即使载体浓度高达250μg/mL，细胞的
存活率依然在85％，说明载体在一定范围内没有细胞毒性，具有良好的生物安全性。

[0079] 2、GM@tLyP‑1/Ce6在二维细胞平面的靶向内吞能力

[0080] 将处于对数生长期的4T1细胞接种于在直径15mm的共聚焦培养皿中接种细胞(密4
度为6.5×10 个/孔)，重复三组，继续培养24h。用PBS缓冲液洗涤3 次，分别加入用细胞培
养液稀释的Ce6、GM@PEG/Ce6、GM@tLyP‑1/Ce6纳米复合物([GM]＝200μg/mL，[Ce6]＝9μg/
mL))，继续培养4h。吸弃上清培养液，用PBS缓冲液反复洗涤3次，用4％的多聚甲醛固定细
胞，20min后将其吸出弃掉。用PBS缓冲液洗涤3次，在培养皿中加入1mL的细胞核染液
(DAPI)，室温下避光染色5min。弃掉DAPI染液，PBS缓冲液洗涤3次。加入1mL PBS 缓冲液浸
没细胞，保持培养皿底部无明水。将培养皿放置在激光共聚焦显微镜下观测，40倍油镜观
察，分别检测DAPI(λEx＝405nm)、Ce6(λEx＝640nm) 的荧光信号。

[0081] 如图8b所示，在GM@tLyP‑1/Ce6组可以看到tLyP‑1上标记的荧光探针FITC 的绿色荧光，且与对照组相比，GM@tLyP‑1/Ce6组Ce6的红色荧光最强；表明实施例1中所合成的GM@
tLyP‑1/Ce6纳米诊疗复合物具有良好的靶向内吞效果。

[0082] 3、GM@tLyP‑1/Ce6纳米诊疗复合物对三维肿瘤球的穿膜渗透能力

[0083] 通过悬滴法构建三维肿瘤球，将处于对数生长期的4T1细胞消化，以每滴 20μL(密5
度为1×10个/mL)滴加于细胞培养皿盖子上，在皿中加入1mL PBS，将盖子迅速盖上，放于
37±2℃培养箱中悬挂培养3天。用培养基轻轻吹打，转置于低黏附细胞培养皿中。分别加入
含有Ce6、GM@PEG/Ce6、GM@tLyP‑1/Ce6 纳米诊疗复合物([GM]＝500μg/mL，[Ce6]＝22.5μg/
mL)的培养基，内吞24h。转移到载玻片上，通过激光共聚焦显微镜三维层扫检测FITC(λEx＝
488nm)、 Ce6(λEx＝640nm)的荧光信号。

[0084] 如图8c所示，与对照组相比，GM@tLyP‑1/Ce6组能穿透约90μm的距离穿入到肿瘤球内部。而非靶向组和游离的Ce6组仅见极少量的纳米粒进入到肿瘤球内部，说明GM@tLyP‑1/
Ce6纳米诊疗复合物具有良好的靶向穿透能力。

[0085] 实施例4 GM@tLyP‑1/Ce6的体外靶向增强型肿瘤光动力治疗效果

[0086] 将处于对数生长期的4T1细胞接种于96孔板种(密度104个/孔)，培养24h。去掉旧培养液，用PBS缓冲液洗涤3次，按照下面的分组将细胞培养液稀释的 Ce6、GO@tLyP‑1/Ce6、
GM@PEG/Ce6、GM@tLyP‑1/Ce6([GM]＝200μg/mL， [Ce6]＝9μg/mL)溶液分别加入与细胞进行
孵育4h：

[0087] 第一组：Control；第二组：Control+Laser；第三组：H2O2+H+；第四组： H2O2+H++Laser。

[0088] 培养结束后去掉旧培养液，用PBS缓冲液洗涤3次，向孔板中加入新的细胞培养液，2
用波长为660nm的激光器，0.5W/cm 功率密度条件下每孔分别照射5min。光照后，继续培养
24h，去掉旧培养液，用PBS缓冲液洗涤3次。每孔加入100.0μL的CCK8工作液，继续培养
45min。将细胞孔板置于酶标仪中，设置检测波长为450nm，记录吸光度(OD值)，计算相对细
胞存活率。

[0089] 如图9所示(图9a中每组柱形图从左到右分别表示Ce6、GM@PEG/Ce6、 GO@tLyP‑1/+
Ce6、GM@tLyP‑1/Ce6；图9b中每组柱形图从左到右分别表示 control、H2O2+H 、Laser、H2O2+H
+
+Laser；在没有模拟肿瘤微环境情况下，自由的Ce6细胞存活率达到80％左右，将Ce6结合
到GM@tLyP‑1载体上后4T1 细胞存活率可降低到40％，这说明GM@tLyP‑1可以增强细胞对
Ce6摄取率。而在模拟肿瘤酸性和大量过氧化氢的微环境下，与对照组相比，GM@tLyP‑1/Ce6 
组细胞存活率降低至20％以内，光动力疗效提高了近2倍，证明了 GM@tLyP‑1/Ce6纳米诊疗
复合物在肿瘤中具有增强的PDT治疗潜力。

[0090] 实施例5 GM@tLyP‑1/Ce6体内肿瘤缺氧改善的研究

[0091] Balb/c小鼠为四川大学实验动物中心提供，均为雌性，5‑6周龄，体重18‑22g。

[0092] 体外扩增细胞，将细胞消化计数后稀释在无菌生理盐水中，在小鼠右后腿皮下注7 3
射100μL saline(1×10 4T1 cells)，8‑14天后肿瘤长到体积约～200mm 进行静脉注射，按
如下分成4组，每组2只，空白组瘤内注射生理盐水：第一组：control(对照组)；第二组：GO@
tLyP‑1/Ce6(靶向、无产氧组)；第三组：GM@PEG/Ce6(非靶向、产氧组)；第四组：GM@tLyP‑1/
Ce6(靶向、产氧组)；尾静脉注射：每只小鼠100μL([MnO2]＝0.045mg/mL，[Ce6]＝0.45mg/
mL， [GO]＝1mg/mL)；给药6小时后，瘤内注射低氧探针哌替啶盐酸盐(60mg/kg)， 90分钟
后，手术切除肿瘤，冰冻切片。按照说明将肿瘤切片与小鼠抗吡莫硝唑抗体(1:100稀释，
Hypoxyprobe Inc.)和Alex 488缀合的山羊抗小鼠二抗(1:200 稀释，Jackson Inc.)一起
温育，用DAPI染细胞核，结果见图10。图10为注射各组纳米粒子后，小鼠肿瘤部位的DCFH‑DA
荧光信号图(sacle bar＝50μm)。

[0093] 从图10可以看出，对照组肿瘤组织表现出明显的缺氧探针的绿色荧光信号，说明实体瘤内部本身就处在严重缺氧的状态；而GM@tLyP‑1/Ce6处理组，绿色荧光信号明显减
弱，且绿色荧光信号和DAPI的蓝色荧光信号高度共定位，这表明GM@tLyP‑1/Ce6确实可以缓
解肿瘤缺氧状态。

[0094] 实施例6 GM@tLyP‑1/Ce6体内MRI/FL的研究

[0095] 按实施例5中的方法构建4T1荷瘤小鼠模型并进行分组，共4组，每组3 只，进行尾静脉给药：100μL([MnO2]＝0.045mg/mL，[Ce6]＝0.45mg/mL，[GO]＝1 mg/mL)；48h成像结束
后，解剖小鼠，对主要器官和肿瘤进行荧光成像，通过检测Ce6的荧光来分析GM@tLyP‑1/Ce6
纳米诊疗复合物的积累情况。

[0096] 如图11a所示，相对于对照组，在肿瘤部位能够检测到明显的磁共振成像信号增强。给药后8h内在肿瘤部位检测到最强信号，此后信号强度随时间减弱，上述结果表明GM@
tLyP‑1/Ce6纳米诊疗复合物可以作为磁共振成像的T1造影剂。GM@tLyP‑1/Ce6组在注射48h
后在肿瘤部位有明显分布(如图11b)，表明 GM@tLyP‑1/Ce6确实能够实现药物在肿瘤部位
的靶向性富集，并具有更长的肿瘤滞留时间，有利于后续的PDT。

[0097] 实施例7 GM@tLyP‑1/Ce6体内增强型光动力抗肿瘤效果

[0098] 1、小鼠体内ROS产生情况检测

[0099] 按实施例5中的方法构建荷瘤小鼠模型，将含有GM@tLyP‑1/Ce6的 DCFH‑DA溶液(瘤内给药)到肿瘤内，光照后，收集肿瘤组织，冷冻切片到载玻片上检测荧光。

[0100] 如图12所示(柱形图从左到右分别代表Pre‑injection、GO@tLyP‑1/Ce6、 GM@PEG/Ce6、GM@tLyP‑1/Ce6)，肿瘤部位几乎没有明显的绿色荧光信号，这是由于肿瘤部位的严重
缺氧所导致的PDT效果抑制。而与对照组相比， GM@tLyP‑1/Ce6实验组出现了最强的绿色荧
光信号，代表了大量的ROS产生，证明了GM@tLyP‑1/Ce6纳米复合物确实可以通过产氧来增
强PDT效果。

[0101] 2、体内增强型光动力抗肿瘤效果检测

[0102] 体外培养小鼠4T1乳腺癌细胞构建异种移植荷瘤小鼠模型，随机分组，每组5只。空白组静脉注射100μL的生理盐水、GM@tLyP‑1/Ce6、GM@PEG/Ce6 和GO@tLyP‑1/Ce6。Ce6的注
射剂量为90μg/只，GO的注射剂量为200μg/只， MnO2注射剂量为9μg/只；将小鼠脱毛，暴露
2
出光照区。使用660nm近红外激光按0.5W/cm的激光密度照射小鼠肿瘤部位10min。隔日通
过游标卡尺测量肿瘤的两个维度的大小，检测荷瘤鼠的体重，并在第3天进行第二次给药治
2
疗。肿瘤体积计算公式为V＝WL/2(W代表肿瘤的长径，L代表肿瘤的短径)。第15 天，处死小
鼠，分离出瘤块并称重。

[0103] 如图13所示，显示了实施例六的体内联合抗肿瘤结果，与GM@PEG/Ce6 处理组和GO@tLyP‑1/Ce6处理组相比，靶向穿透型纳米诊疗复合物 GM@tLyP‑1/Ce6表现出极为明显
的肿瘤抑制效果(附图13a)，最终肿瘤体积和重量最小(附图13b)，并且，在整个治疗过程
中，小鼠的体重无明显变化，表明 GM@tLyP‑1/Ce6具有很好的生物安全性。