伯氨基暴露量为5%的多肽单层膜及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN202010754464.7
文献号 : CN111840636B
文献日 : 2022-01-18
发明人 : 许静 , 马慧君 , 李天铎 , 班青 , 张震
申请人 : 齐鲁工业大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种伯氨基暴露量为5%的多肽单层膜的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)在一定温度下,配制浓度为4%wt的胶原多肽溶液,然后加入表面活性剂十六烷基硫酸钠,得到多肽‑十六烷基硫酸钠混合溶液,保温备用,混合溶液中十六烷基硫酸钠的浓度为6.83mmol/L;
(2)将钛片表面打磨抛光,浸入混酸溶液中处理,冲洗至中性,用氮气吹干后再烘干;
(3)将烘干后的钛片浸入聚乙烯亚胺水溶液中处理后,用水冲洗,用氮气吹干后再烘干,得到沉积有聚乙烯亚胺的正离子化的钛片;
(4)将正离子化的钛片浸入步骤(1)所得多肽‑十六烷基硫酸钠混合溶液中,沉积8~
12min,然后将其在去离子水中提拉20‑25次,用高纯氮气吹干后,即得多肽单层膜;
5
所述多肽是由分子量为(1.48±0.2)×10g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为
15.2±0.1nm,膜表面的伯氨基暴露量为5±0.2%,多肽单层膜的Zeta电位为‑4.97±0.1mV;
所述膜的接触角为50±1°;
所述多肽单层膜中多肽的二级结构含量为:α‑helix为9.73 ± 0.36%;β‑sheet为
35.71 ± 0.12%;β‑turn为19.53 ± 0.14%;random coil为35.36 ± 0.14%。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述温度与步骤(4)中沉积过程温度均为50℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,胶原多肽溶液的配制方法为:将胶原多肽和去离子水混合,于室温溶胀0.5小时后,加热至50℃,搅拌2小时,使胶原多肽完全溶解;然后调节pH至10.00 ± 0.02。
4.根据权利要求1 3任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,钛片使用金相砂~
纸打磨抛光后,依次用去离子水,无水乙醇,丙酮超声清洗钛片各15 min,然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12 h。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,打磨抛光的方法为:使用金相砂纸按照800,1500,3000,5000,7000目的顺序依次打磨抛光。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,混酸溶液为体积比为 1:1的质量分数为30%H2O2和98%H2SO4的混合溶液,处理时间为1小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,钛片在聚乙烯亚胺水溶液中的处理时间为20 40分钟。
~
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述多肽的氨基酸的组成为甘氨酸(Gly):7.30±0.5%;缬氨酸(Vla):17.48±0.5%;异亮氨酸(Ile):36.97±0.5%;亮氨酸(Leu):13.85±0.5%;酪氨酸(Tyr):2.68±0.5%;苯丙氨酸(Phe):1.5±0.5%;赖氨酸(Lys):
4.41±0.5%;组氨酸(His):0.45±0.5%;精氨酸(Arg):3.45±0.5%;脯氨酸(Pro):5.96±
0.5%;半胱氨酸(Cys):5.95±0.5%。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,膜表面的伯氨基暴露量为4.89%;多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒组成的,球形纳米颗粒的平均粒径为40±2nm。
10.一种含有多肽单层膜的复合膜,其特征在于,包括聚乙烯亚胺薄膜和含有权利要求
1 9任一项所述方法制备的多肽单层膜,聚乙烯亚胺和多肽分子之间通过离子键结合,其~
中,聚乙烯亚胺薄膜的厚度为0.25 0.38nm,多肽单层膜的厚度为15.2±0.1nm。
~
11.权利要求1 9任一项所述方法制备的多肽单层膜或权利要求10所述复合膜作为生~
物相容性涂层在硬组织修复仿生骨架中的应用。
说明书 :
伯氨基暴露量为5%的多肽单层膜及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
为一种可生物降解和可再生资源,被广泛应用于制备医用材料、仿生材料、包装及涂饰材
料。生物固定化涂层常被应用于生物仿生支架领域,解决酶、乳糖、聚多巴胺等生物分子、药
物分子、合成高分子或有机小分子的搭载问题,若将胶原多肽制备成多肽单层膜具有搭载
量易精确控制等优点。
的分子间氢键,形成网状结构,再脱水后形成脆性薄膜;此外,这些基团与水分子形成氢键,
从而使多肽薄膜易吸水。这些特性导致胶原多肽材料变脆并且容易溶于水,限制了它在一
些领域的应用。
质、亲润性、电性质,使其能够应用于心脑血管支架制备等领域。
分子的下一步改性,能够进一步弥补其自身的缺点。
发明内容
荷、亲疏水等性质,将多肽单层膜作为涂层材料应用于硬组织修复仿生骨架,且可进一步为
实现多种生物制剂的可控接枝提供基础。
(1.48±0.2)×10 g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为15.2±0.1nm,膜表面的伯氨
基暴露量为5±0.2%,多肽单层膜的Zeta电位为‑4.97±0.1mV;所述膜的接触角为50±1°。
2.68±0.5%;苯丙氨酸(Phe):1.5±0.5%;赖氨酸(Lys):4.41±0.5%;组氨酸(His):0.45
±0.5%;精氨酸(Arg):3.45±0.5%;脯氨酸(Pro):5.96±0.5%;半胱氨酸(Cys):5.95±
0.5%。
色谱仪(CD)对单层膜多肽的二级结构进行表征。
~0.38nm,多肽单层膜的厚度为15.2±0.1nm。
0.02。
磨抛光的方法为:使用金相砂纸按照800,1500,3000,5000,7000目的顺序依次打磨抛光。
肌体组织游离,导致肌体组织变质,生物相容性差,并且由于它与肌体为机械嵌合,生物活
性低,不利于病体的迅速愈合。
水性和细胞相容性、表面润湿性等,能促进细胞活性,且与人体骨组织有较好的相容性,有
利于病体迅速愈合。由于具有较弱的亲水性质,能提高种植处细胞的附着和增殖,植入人体
后对肌体组织没有伤害。
附图说明
(c)的 H NMR谱图;
具体实施方式:
10~1.80×10g/mol,经透析方法到的分子量为的多肽(1.48±0.2)×10g/mol。其他试剂
没有特别说明的均为普通市售产品。
达到与分子量较大的胶原多肽分开的目的。凝胶电泳、激光粒度仪的研究结果表明,规格为
‑1
5万的透析袋,胶原多肽的透析浓度为2%,透析温度为45℃,NaCl的浓度为0.9mol·L 的条
件下可制备出窄分子量分布的胶原多肽。
类对比如表2所示。GPC测试结果表明透析胶原多肽的重均分子量Mw=1.48×10g·mol ,
Mw/Mn=1.43。凯氏定氮法测出胶原多肽中蛋白质含量(CP)为83.38%,氨基酸含量(CA)为
‑4 ‑1
4.95×10 mol·g ,伯氨基定量仪于50℃测定结果表明透析胶原多肽分子中包含4.95×
‑4 ‑1
10 g·mol 的伯氨基,透析前后胶原多肽的分子结构没有明显改变。将胶原多肽配制为
‑1 ‑1
5%的水溶液,其电导率为5.98μS cm ,去离子水自身电导率为2.06μS cm ,上述结果表明
分子量较小的胶原多肽以及胶原多肽中混杂的无机盐都被透析出去了。
50±1℃的水浴中,加热搅拌2h,使其完全溶解,然后用2mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节
至10.00±0.02,在水浴中稳定0.5h后。
6%);在水浴中稳定6h备用。
15min,然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。配制30%H2O2和98%H2SO4体积比
为1:1的混酸溶液,冷却至室温后,将上述处理好的钛片用混酸处理1h,然后用自来水冲洗
至中性,再用去离子水清洗5次,最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
干燥12h备用。将正离子化的钛片放入沉积盒中,分别向沉积盒中倒入上述配制好的不同体
系的多肽溶液,50℃下沉积10min,然后将其在去离子水中提拉20次,用高纯氮气吹干后置
于氮气中保存。
瓶中,室温溶胀0.5h后,将三口烧瓶在50℃的水浴中加热搅拌2h,使其完全溶解,然后用
1mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节至10.00±0.02备用。
差Δε(M ·cm )和摩尔椭圆度θ来度量圆二色性的大小。CD测试是在Chirascan系统(英国
应用光物理有限公司)上进行的,使用氮气吹扫时流速为35mL/min。将所有溶液中蛋白质的
浓度稀释至0.16mg/mL,混合样品在50℃下平衡1h,同时在50℃下,取200μL溶液于1mm样品
池中进行测量,测量温度保持在50℃。在190~260nm范围内记录光谱,分辨率为0.2nm,共扫
描6次。数据处理:减去缓冲溶液的光谱以校正基线,CD光谱以摩尔椭圆度为单位进行了归
一化,采用峰回归计算方法和CONTIN拟合程序对二级结构含量进行了计算。多肽浓度对其
二级结构的影响结果见图1和表3所示。
turn、random coil结构呈现出先减少后增加的趋势,在浓度为4%时达到最小。该结果表明
在4%时,多肽分子二级结构发生较大变化。此浓度正好处于多肽分子接触浓度和缠结浓度
交界区域。因此,本发明在制备胶原多肽单层膜时,将多肽的质量浓度优选为4%。
50±1℃的水浴中,加热搅拌2h,使其完全溶解,然后用2mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节
至10.00±0.02,在水浴中稳定0.5h后。
15min,然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。配制30%H2O2和98%H2SO4体积比
为1:1的混酸溶液,冷却至室温后,将上述处理好的钛片用混酸处理1h,然后用自来水冲洗
至中性,再用去离子水清洗5次,最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用
干燥12h备用。将正离子化的钛片放入沉积盒中,分别向沉积盒中倒入上述配制好的不同体
系的多肽溶液,50℃下沉积10min,然后将其在去离子水中提拉20次,用高纯氮气吹干后置
于氮气中保存。
量了多肽单层膜在沉积过程中不同提拉次数的荧光强度。随着提拉次数的增加(5~20次),
通过物理吸附到基底的多肽会被洗掉而由离子键结合的则会牢固地固定在基底上。由图3
可以看出,提拉15次后,荧光强度不再降低,表明通过物理吸附到基底上的胶原多肽已被去
除。
备多肽单层膜时,用锡纸包裹钛片的一半,使其不被溶液沾染。测试时,先用原子力显微镜
自带的光学辅助系统找到钛片的边界,然后把测试范围设置为20μm以横跨基底和样品区
域,沿边界用AFM针尖进行扫描,从对应于膜基质的高度一直到边界底部,扫描3个不同区域
以获得平均膜厚。扫描速度0.977Hz,扫描范围20μm、10μm、5μm、1μm,数据处理软件为AFM自
带的NanoScope Analysis。
SHxaS多肽单层膜的厚度为15.2±0.1nm,球形纳米颗粒的平均粒径约为60nm,其AFM图像见
表4。
G‑SHxaS,4.89%;G‑SDS6%,13.13%;G,2.89%。伯胺的结合能为400.05eV,酰胺键为
398.89eV,仲胺为398.26eV。XPS数据通过检测结合能和局部化学状态的变化,对官能团进
行半定量分析。使用CasaXPS对N1s高分辨率图谱进行分峰并计算伯氨基含量XPS和Raman的
结果表明,胶原多肽单层膜中氨基暴露量不仅与增加的β‑sheet和random coil结构有关,
而且与胶原多肽和表面活性剂的非共价相互作用有关。
Young拟合算法自动确定CA。通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值,并用数码相机
(日本索尼有限公司)拍摄图像。使用SurPASS电动固体表面分析仪测定膜表面Zeta电位。
是‑4.97mV。结果表明,4wt.%多肽单层膜电位较低,亲水性差,蛋白质等易吸附,不能用于
生物体内载药;G‑SDS6%的电位高,亲水性强,不易吸附蛋白质且能促进细胞活性,可用于心
脑血管支架涂层等体内载药;而G‑SHxaS多肽单层膜电位介于两者之间,不可用于血管内载
药,但可以用作仿生骨架表面涂层。
SHxaS胶原多肽单层膜表面的接触角约为50°,如图6所示。而G‑SDS6%多肽单层膜的接触角
为10°。本发明多肽单分子层适用于仿生骨架等。
0.14%。G‑SHxaS多肽单层膜与G多肽单层膜相比改变了多肽的二级结构,促进了膜厚的减
小,β‑sheet增加使结构更稳定。β‑sheet结构的增加可能有助于降低胶原多肽层的厚度,有
利于多肽分子链的伸展,从而促进伯氨基的展露。伯氨基暴露量的多少会影响zeta电位与
接触角等性质。
2‑三苯基乙烯(TPE‑ITC),四苯基乙烯(TPE)和异硫氰酸酯(ITC)的加合物。
入15mL(2.5M己烷溶液,37.5mmol)正丁基锂。将混合物在0℃搅拌1小时。然后将4.91g
(25mmol)4‑甲基二苯甲酮加入到反应混合物中。将混合物加热至室温并搅拌6小时。合成化
合物3。
温后,反应混合物用二氯化碳萃取。收集有机层并浓缩。通过使用己烷作为洗脱剂的硅胶色
谱法纯化粗产物,得到白色固体4。
甲烷和水萃取。将有机层合并,用无水硫酸镁干燥。通过使用己烷作为洗脱剂的硅胶色谱法
纯化粗产物,得到5,为白色固体。
用乙醚萃取三次。将有机层合并,用无水硫酸镁干燥。通过使用己烷/氯仿(v/v=3:1)作为
洗脱剂的硅胶色谱法纯化粗产物,得到6,为白色固体。
(0.55g,7.242mmol)和蒸馏过的二氯甲烷(50mL)加入烧瓶中搅拌。将所得反应混合物回流
过夜,然后减压除去溶剂。粗产物用冷乙醚(250mL)沉淀,过滤沉淀并洗涤三次。最后将产物
真空干燥得到TPE‑ITC,为白色固体。
H NMR由AVANCE II 400核磁共振波谱仪(Bruker,德国)获得,将~0.5cm的待测样品放入
核磁管中,加入0.6mL氘代氯仿使其全部溶解,以四甲基硅烷(TMS)作为内标,在室温下手动
1
匀场进行测定,扫描次数为64次,获得的 H NMR谱图使用MestReNova软件进行处理,结果如
图7所示。
ppm):7.15‑6.98(m,15H),6.89(s,4H),2.24(s,3H);(图7b)H NMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,
1
ppm):7.12‑6.90(m,19H),4.24(s,2H);(图7c)H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):6.90‑7.15(m,
1
19H),4.61(s,2H)。例如,由于TPE和ITC单元之间亚甲基单元的共振,产物在H NMR(图7c)
光谱中的δ4.16处显示出峰。
分子。TPE‑ITC的AIE属性通过将大量AIE标签附着到胶原多肽链上,使得TPE‑多肽生物共轭
物能够产生强烈的荧光。通过简单地增加其标记度(DL),可以大大提高生物结合物的荧光
输出(高达2个数量级)。AIE探针策略是对伯氨基进行实时观察的有效方法。其优点是操作
简单,低成本和高效率。此外,进一步调整AIE荧光基团的结构仍将有助于开发用于表面官
能团检测的特定探针。
匀。将多肽单层膜放入沉积盒中,然后把超声过的混合溶液缓缓倒入沉积盒中,50℃反应
2h,反应完成后,在DMSO中提拉10次以去除未标记的TPE‑ITC,最后用高纯氮气吹干后置于
氮气中保存。
超灵敏HyDTM探测器一起使用。用405nm激光激发样品,在430~493nm处检测到荧光。结果表
明,CLSM结果与XPS分析的结果一致。
5
在孔内,每个样品使用三个平行孔。人脐静脉内皮细胞(HUVECs,5×10 细胞/mL)接种于各
孔中,在37℃、5%CO2和10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养24小时。随后,用无
血清必需培养基伊格尔(MEM)清洗细胞两次,并在每个含有100μL无血清MEM的孔中加入15μ
L CCK‑8溶液。在37℃、5%CO2下孵育1h后,将100μL混合物转移到另一个12孔板上,因为残
留的G‑SHxaS单层膜会影响450nm处的吸光度值。以655nm为参比,用iMark微孔板读取器在
450nm处测量混合溶液的吸光度,仅含细胞和培养基的孔作为对照。细胞活力计算公式如
下:
(10mM,pH=7.4)洗涤细胞3次。随后,将这些细胞在37℃的新鲜细胞培养基中,在5%CO2的
DMEM中再培养10天,然后用4%多聚甲醛固定,并用0.2%结晶紫染色。计数每个细胞超过50
个的菌落。从三个平行实验中获得平均存活分数。
后对细胞集落进行计数(图10)。对照组,G‑SHxaS组中的菌落数量仅略有不同,这表多肽原
多肽单层膜中的痕量表面活性剂对细胞活力没有影响。说明本发明所得多肽单层膜表面具
有优异的细胞相容性。
天后,样品使用高纯氮气吹干备用。将G‑SHxaS继续放置于40℃生化培养箱中浸泡15天后,
使用高纯氮气吹干备用。观察前,需先把荧光模块打开,将机器预热15min后使用。将载玻片
清洗干净,取待测样品于清洗干净的载玻片上,放在载物台上固定,先粗略调节载物台高
度,随后微调聚焦,用明场找到最清晰的样品细节,然后用荧光模块观察,先用50X观察荧光
点分布情况,然后依次把倍数放大,观察荧光点分布,对比胶原多肽单层膜浸泡前后荧光点
分布情况,可以直观地分析其稳定性。结果如图11所示,浸泡一周后绿色荧光点的分布没有
减少;将样品在40℃的恒温箱中放置15天,荧光点分布也没有明显变化。综合以上结果,可
以得出在Ti表面上形成了相对稳定的G‑SHxaS单层膜,这种稳定性归因于PEI和胶原多肽之
间的静电相互作用和其他非共价相互作用。