无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养工艺

摘要

本发明公开了一种无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养工艺，属于细胞培养领域。本发明的培养工艺包括如下步骤：1)将无血清培养基培养的Vero细胞接种到固定床生物反应器，待溶液清澈；2)接种后12～24h内，在不灌流条件下设置如下参数进行培养：温度37.0±0.2℃、pH 7.20±0.1、溶氧60±20％、转速90～110rpm；3)接种后12～24h开始灌流培养。本发明的方法可培养得到高密度Vero细胞，且不涉及牛血清及动物胰酶的使用，大大提高了Vero细胞所得生物制品的安全性。

权利要求

1.一种无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养工艺，其特征在于，步骤如下：

1）将无血清培养基培养的Vero细胞接种到固定床生物反应器，待溶液清澈；

2）接种后12 24h内，在不灌流条件下设置如下参数进行培养：温度37.0±0.2℃、pH ~

7.20±0.1、溶氧60±20%、转速90 110rpm；

~

3）接种后12 24h开始灌流培养；

~

上述各步骤中均使用如下配方的无血清培养基：VP‑SFM 15.0 17.6 g/L，谷丙二肽2 4 ~ ~

mmol/L，果糖0.5 2.0 g/L，Tricine 0.5 2.0 g/L；

~ ~

灌流时，通过控制培养基的灌流速度，保证培养基内葡萄糖的浓度不低于1.0g/L；

步骤3）的灌流体积为每天1.0 2.0倍培养体积。

~

2.如权利要求1所述的培养工艺，其特征在于：所述Vero细胞为美国标准菌种保藏中心（ATCC）编号为CCL‑81.5的无血清Vero细胞。

5

3. 如权利要求1或2所述的培养工艺，其特征在于：步骤1）的接种密度为5 8×10 ~

cells /ml。

说明书

无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养工艺

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养领域。

背景技术

[0002] 细胞的培养是病毒性疫苗以及其他大部分生物制品必不可少的前提条件，高密度、高质量的细胞能够使产品收率大大的提升。

[0003] Vero细胞是一种非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾细胞，由日本千叶大学(Chiba)的Yasumura和Kawakita于1962年3月27日建立细胞系。该Vero细胞系于1964年6月
15日由B.Simizu博士带到美国的热带病毒学实验室(laboratory  of  tropical 
virology)、国立变态反应和传染病研究所(NIAID)、国立卫生研究院(NIH)，此时细胞的传
代水平是第93代。于第113代传代水平时，再提交给美国典型培养物典藏中心(ATCC)，在
ATCC培养传代至第121代，并且建库，此细胞库编号为ATCC CCL‑81TM。

[0004] 无血清Vero细胞(Vero‑SF‑ACF)是2011年ATCC从CCL‑81TM(Lot58954145)经无血清、无动物源性培养基驯化得到，ATCC编号为CCL‑81.5。

[0005] 目前经过无血清、无动物源性驯化的用于大规模生产的无血清细胞(Vero‑SF‑ACF)培养方式未见报道。有关小规模培养实验试验的报道主要使用细胞工厂、转瓶或微球
生物反应器。各培养方式的优缺点如表1。

[0006] 表1细胞工厂、转瓶或微球生物反应器优缺点

[0007]

[0008]

[0009] 综上表所示：转瓶或细胞工厂由于生产效率低、易污染等缺点不适宜大规模生产。

[0010] 而微球生物反应器由于非静止培养细胞质量容易受到较大影响，对于产品质量或下游处理工艺难度要求提升。

[0011] 固定床生物反应器是固定化培养细胞的装置，细胞可附着于其内固定的载体，而反应器内的培养液是流动的。固定床生物反应器能减少培养的剪切力，培养细胞的效率较
7
高，其中，培养Vero细胞的密度可达到1.0×10 cells/ml【杨屹，汝东宇，郭秀霞，崔广文，
等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2011年5
月，第25卷，第5期】，但仍然具有提升的空间。

发明内容

[0012] 本发明要解决的问题是：应用固定床生物反应器静止培养的特点，使用灌流方式，提供无血清Vero细胞(Vero‑SF‑ACF)大规模、高质量、高密度培养工艺。

[0013] 本发明的技术方案如下：

[0014] 一种无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养工艺，包括如下步骤：

[0015] 1)将无血清培养基培养的Vero细胞接种到固定床生物反应器，待溶液清澈；

[0016] 2)接种后12～24h内，在不灌流条件下设置如下参数进行培养：温度37.0±0.2℃、pH 7.20±0.1、溶氧60±20％、转速90～110rpm；

[0017] 3)接种后12～24h开始灌流培养；

[0018] 上述各步骤中均使用如下配方的无血清培养基：15.0～17.6g/L，谷丙二肽2～4mmol/L，果糖0.5～2.0g/L，Tricine 0.5～2.0g/L；

[0019] 灌流时，通过控制培养基的灌流速度，保证培养基内葡萄糖的浓度不低于1.0g/L。

[0020] 如前述的培养工艺，所述Vero细胞为美国标准菌种保藏中心(ATCC)编号为CCL‑81.5的无血清Vero细胞。

[0021] 如前述的培养工艺，步骤1)的接种密度为5～8×105cells/ml。

[0022] 如前述的培养工艺，步骤3)的灌流体积为每天1.0～2.0倍培养体积。

[0023] 本发明的有益效果如下：

[0024] 1)本发明培养工艺能大幅提高细胞密度，达到3×107cells/ml，高于现有文献的7
1.0×10cells/ml【杨屹，汝东宇，郭秀霞，崔广文，等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞
人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2011年5月，第25卷，第5期】。

[0025] 2)本发明培养工艺不需要血清、传代不涉及动物胰酶，大大降低了外源因子的污染。

[0026] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0027] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容
所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0028] 图1：固定床生物反应器结构略图。

[0029] 图2：细胞生长趋势图。

具体实施方式

[0030] 实施例1无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养

[0031] 1.生产用细胞

[0032] 生产用细胞为适应无血清培养的Vero细胞Vero‑SF‑ACF，购自美国ATCC(American type culture collection，美国标准菌种保藏中心)，ATCC编号为CCL‑81.5。

[0033] 2.方法

[0034] 1)在固定床生物反应器的载体填充区域按70g/L填装片状载体(如图1的紫色区域)。

[0035] 2)将工作细胞库无血清Vero细胞置于T75方瓶中，用无血清培养基培养，长成致密单层时，使用重组细胞消化酶(代替动物源性胰酶)消化细胞，按1:6扩增传代，重组细胞消
5
化酶消化细胞，再接种到固定床生物反应器，接种时反应器内细胞密度为6×10cells/ml。

[0036] 3)细胞悬液完全进入反应器60min后细胞吸附完成，溶液变的清澈后设置细胞培养参数：温度37.0℃、pH 7.20、溶氧60％、转速100rpm；不灌流。

[0037] 4)细胞接种完成后18h开始灌流，灌流体积为每天1.5倍培养体积，即每天向生物反应器输入1.5倍培养体积的培养基，输出相等体积的培养后溶液，灌流培养期间，维持步
骤3)的培养参数

[0038] 上述各步骤中均使用如下配方的无血清培养基：

[0039]

[0040] 在灌流时，保证培养基内葡萄糖的浓度不低于1.0g/L。

[0041] 3.结果

[0042] 无血清Vero细胞(Vero‑SF‑ACF)在固定床生物反应器中细胞密度能达到3.0×7
10cells/ml高于现有文献报道100％以上，细胞生长趋势图如图2所示。

[0043] 实施例2无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养

[0044] 1.生产用细胞

[0045] 生产用细胞为适应无血清培养的Vero细胞Vero‑SF‑ACF，购自美国ATCC(American type culture collection，美国标准菌种保藏中心)，ATCC编号为CCL‑81.5。

[0046] 2.方法

[0047] 1)在固定床生物反应器的载体填充区域按60g/L填装片状载体(如图1的紫色区域)。

[0048] 2)将工作细胞库无血清Vero细胞置于T75方瓶中，用无血清培养基培养，长成致密单层时，使用重组细胞消化酶(代替动物源性胰酶)消化细胞，按1:3扩增传代，重组细胞消
5
化酶消化细胞，再接种到固定床生物反应器，接种时反应器内细胞密度为5×10cells/ml。

[0049] 3)细胞悬液完全进入反应器60min后细胞吸附完成，溶液变的清澈后设置细胞培养参数：温度36.8℃、pH 7.3、溶氧40％、转速90rpm；不灌流。

[0050] 4)细胞接种完成后12h开始灌流，灌流体积为每天1.0倍培养体积，即每天向生物反应器输入1.0倍培养体积的培养基，输出相等体积的培养后溶液，灌流培养期间，维持步
骤3)的培养参数

[0051] 上述各步骤中均使用如下配方的无血清培养基：

[0052]

[0053]

[0054] 在灌流时，保证培养基内葡萄糖的浓度不低于1.0g/L。

[0055] 3.结果

[0056] 无血清Vero细胞(Vero‑SF‑ACF)在固定床生物反应器中细胞密度能达到2.5×7
10cells/ml，高于现有文献报道100％以上。

[0057] 实施例3无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养

[0058] 1.生产用细胞

[0059] 生产用细胞为适应无血清培养的Vero细胞Vero‑SF‑ACF，购自美国ATCC(American type culture collection，美国标准菌种保藏中心)，ATCC编号为CCL‑81.5。

[0060] 2.方法

[0061] 1)在固定床生物反应器的载体填充区域按70g/L填装片状载体(如图1的紫色区域)。

[0062] 2)将工作细胞库无血清Vero细胞置于T75方瓶中，用无血清培养基培养，长成致密单层时，使用重组细胞消化酶(代替动物源性胰酶)消化细胞，按1:6扩增传代，重组细胞消
5
化酶消化细胞，再接种到固定床生物反应器，接种时反应器内细胞密度为8×10cells/ml。

[0063] 3)细胞悬液完全进入反应器60min后细胞吸附完成，溶液变的清澈后设置细胞培养参数：温度37.2℃、pH 7.3、溶氧80％、转速110rpm；不灌流。

[0064] 4)细胞接种完成后24h开始灌流，灌流体积为每天2.0倍培养体积，即每天向生物反应器输入2.0倍培养体积的培养基，输出相等体积的培养后溶液，灌流培养期间，维持步
骤3)的培养参数

[0065] 上述各步骤中均使用如下配方的无血清培养基：

[0066]

[0067] 在灌流时，保证培养基内葡萄糖的浓度不低于1.0g/L。

[0068] 3.结果

[0069] 无血清Vero细胞(Vero‑SF‑ACF)在固定床生物反应器中细胞密度能达到2.8×7
10cells/ml，高于现有文献报道100％以上。

[0070] 以下用实验例的形式进一步说明。

[0071] 实验例1无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养生产狂犬病疫苗

[0072] 1.生产用细胞

[0073] 生产用细胞为适应无血清培养的Vero细胞Vero‑SF‑ACF，购自美国ATCC(American type culture collection，美国标准菌种保藏中心)，ATCC编号为CCL‑81.5。

[0074] 2.毒种

[0075] 生产用毒种为狂犬病病毒固定毒rPV‑2061株，从美国CDC引进。

[0076] 3.疫苗制备

[0077] (1)细胞培养：同实施例1。

[0078] (2)接种、培养病毒：当生物反应器内细胞密度达到0.7×107cells/ml时接种狂犬病病毒(rPV‑2061株)，MOI为0.005；培养6～8h，开始灌流细胞维持液。

[0079] 维持液配方：

[0080]

[0081] 培养参数为：34℃、pH7.50、溶氧60％、转速100rpm灌流培养。

[0082] (3)收毒：病毒连续收获15天(种毒后第3天至第17天)。单次病毒收获液(病毒滴度为6.5～7.5lgLD50/ml)，经0.65μm滤芯粗滤，通过300kD膜包进行20～30倍浓缩。

[0083] (4)灭活：于浓缩后的病毒收获液中按1:4000的比例加入β‑丙内酯，置4℃，24小时灭活狂犬病病毒；于37℃下放置2小时，以水解β‑丙内酯。

[0084] (5)纯化：加入140U/ml的核酸酶(非限制性核酸内切酶)，于37℃消化24小时。选择琼脂糖4FF作为填料进行分子筛层析纯化，以pH 7.6的磷酸盐缓冲液作为流动相，上样体积
不超过柱体积的5％。

[0085] (6)配制原液：纯化后加入终浓度3％(m/v)人血白蛋白和终浓度5％(m/v)的麦芽糖作为稳定剂，配制成原液。

[0086] (7)配制制剂：将原液加上冻干保护剂(含终浓度3％(m/v)人血白蛋白和终浓度5％(m/v)麦芽糖的磷酸盐缓冲液)得半成品半成品中抗原含量为30IU/剂，每剂1mL；将半成
品冻干制备得到疫苗制剂。

[0087] 4.疫苗生产效率比较

[0088] 对市售狂犬疫苗(来自厂家A、B、C、D)进行检测，并与本实施例工艺所制备产品相比较。检测方法如下：

[0089] 4.1.效价测定

[0090] 按《中华人民共和国药典》2015年版通则3503人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)：

[0091] (1)稀释参考疫苗、供试品

[0092] 将参考疫苗、供试品分别用无菌PBS稀释成1：25、1：125、1：625等稀释度(冻干制品复溶后再稀释)。

[0093] (2)初免小鼠

[0094] 用上述不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12～14g小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml。

[0095] (3)二免小鼠

[0096] 初免7天后同法再免疫一次小鼠。

[0097] (4)CVS攻击小鼠

[0098] (5)攻击毒的计算

[0099] 假设用每0.03ml含31LD50的病毒量进行脑内攻击，所用CVS的病毒滴度为CC‑1.50
(lgLD50/0.03ml)，lg31≈1.50，则将CVS稀释10 倍即为每0.03ml含31LD50病毒量的病毒
悬液。

[0100] (6)注射小鼠

[0101] 小鼠初免后第14天，用病毒稀释液将预先滴定的CVS稀释为每0.03ml含5～100LD50病毒量的悬液，作为攻击毒。用攻击毒进行脑内攻击，每只小鼠0.03ml；同时将攻击毒稀释
0 ‑1 ‑2 ‑3
至10 、10 、10 和10 进行毒力滴定，每个稀释度均不少于8只小鼠，注射完后将装有小鼠
的笼具置于笼架上逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型狂犬病脑症
状的小鼠数。

[0102] (7)效价P公式：

[0103]

[0104] dT为供试品的1次人用剂量，ml；dS为参考疫苗的1次人用剂量，ml；D为参考疫苗的效价，IU/ml。

[0105] 4.2.热稳定性试验

[0106] 在37℃放置28天后，检测效价。

[0107] 4.3.Vero细胞蛋白质残留检测

[0108] 依法(《中华人民共和国药典》2020年版，酶联免疫法)，使用Cygnus试剂盒“Vero Cell Host Cell Proteins”对Vero细胞蛋白质残留量进行检测。

[0109] 4.4.Vero细胞DNA残留检测

[0110] (1)药典法

[0111] 取培养细胞上清不少于1ml，按中华人民共和国药典三部(2015年版)外源性DNA残留量测定(通则3407)外源性DNA残留量测定法‑DNA探针杂交法进行。

[0112] (2)qPCR法(已纳入2020版药典)

[0113] 试验分2步进行，第一步提取宿主细胞DNA，第二步将DNA荧光定量PCR。取100μl培养细胞上清，加入裂解液裂解释放宿主细胞DNA；用磁珠吸附释放的DNA，保留磁珠，弃去裂
解液；洗涤磁珠；使用洗脱液将吸附于磁珠上的宿主细胞DNA洗脱下来，转移洗脱液，进行荧
光定量PCR。整个试验设置阴性对照、空白提取对照、提取回收率控制对照、标准曲线，以确
保结果的准确可靠。

[0114] 另外，发明人还通过询问厂家A、B、C、D，以及通过中国食品药品检定研究院官网查阅其每批上市产品数量进行核实，得到其单罐产量信息。

[0115] 结果如下：

[0116] 单罐产量及效价如表2所示。借助本发明培养工艺生产制剂数远高于厂家A、C、D，厂家B的培养器体积是本发明的8倍，但单罐产量不到本发明的2倍。本发明所得制剂效价也
远高于厂家A、B、C。

[0117] 表2生产效率比较

[0118]

[0119] 注：ND，未检测。

[0120] 可见，借助本发明的细胞高密度培养工艺，生产的疫苗制剂数量大，单位制剂的效价高，总体生产效率远高于本领域的普通水平。

[0121] 综上，通过本发明的细胞高密度培养工艺，一方面能提高细胞密度，有利于提高相关生物制品的产出；另一方面能降低外源因子的污染(细胞传代未使用动物源性胰酶，培养
基无牛血清白蛋白，培养方式能减少Vero蛋白质残留)，有利于提高相关生物制品的安全
性。