神经母细胞瘤类器官的培养基、培养方法及移植体

摘要

本公开涉及一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，该培养基中含有α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子。利用本公开提供的用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，能够有效提升神经母细胞瘤类器官培养的成功率。

权利要求

1.一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，其特征在于，该培养基中含有α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子，以所述培养基为基准，所述α‑氨基异己酸的浓度为0.5～

1.5mmol/L，所述血小板衍生生长因子的浓度为5～15ng/mL；

所述培养基还含有DMEM/F 12培养基、FBS、EGF、bFGF和B27，以所述培养基为基准，所述FBS的含量为5～10体积％，所述EGF的浓度为15～20μM，所述bFGF的浓度为15～20μM，所述B27的含量为1～5体积％，余量为所述DMEM/F 12培养基。

2.一种培养神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于，该方法包括：将神经母细胞瘤组织细胞、培养基和温敏性水凝胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基为权利要求1所述的培养基；

对所述待培养物进行培养扩增，得到神经母细胞瘤类器官。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将神经母细胞瘤组织细胞、培养基和温敏性水凝胶混合，得到待培养物，包括：将所述神经母细胞瘤组织细胞与所述培养基混合，得到预混物，其中，所述预混物中，

5 5

所述神经母细胞瘤组织细胞的浓度为1×10～5×10个/mL；

将所述预混物与所述温敏性水凝胶混合，得到所述待培养物，其中，相对于1体积份的所述预混物，所述温敏性水凝胶的用量为1～4体积份。

说明书

神经母细胞瘤类器官的培养基、培养方法及移植体

技术领域

[0001] 本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基、一种培养神经母细胞瘤类器官的方法、一种用于构建神经母细胞瘤异种移植模型的
移植体及其用途。

背景技术

[0002] 神经母细胞瘤是一种常见的颅外肿瘤，其发病群体主要为1～5岁的婴幼，发病率为十万分之一左右。在神经母细胞瘤的发病群体中，2岁以下的婴幼儿约占60％，10岁以下
的婴幼儿约占96％。目前，对于神经母细胞瘤的治疗方法主要为手术、放疗、化疗及综合治
疗等，在一段时间内可缓解患者病痛，减缓肿瘤生长，但仍因肿瘤复发、转移导致患儿的最
终死亡。

[0003] 神经母细胞瘤的发病机制复杂，治疗难度较大。因此，需要真实性更强的体外生物模型以探索新的治疗方案。相关技术中，已有利用神经母细胞瘤细胞株作为神经母细胞瘤
研究用的生物模型。但是，已建立的人神经母细胞瘤细胞株多样性有限，且在体外培养困
难；神经母细胞瘤患者来源的异种移植瘤(PDX)小鼠模型构建成功率仅有30％。因此，建立
与人病理状态及遗传分子信息更接近的神经母细胞瘤类器官模型，可以为该肿瘤的机制研
究、药物开发及患者体外药敏测试提供理想工具。

发明内容

[0004] 本公开的目的是提供一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，以及利用该培养基培养神经母细胞瘤类器官的方法。

[0005] 为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，该培养基中含有α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子。

[0006] 可选地，以所述培养基为基准，所述α‑氨基异己酸的浓度为0.5～1.5mmol/L，所述血小板衍生生长因子的浓度为5～15ng/mL。

[0007] 可选地，所述培养基还含有DMEM/F 12培养基、FBS、EGF、bFGF和B27中的至少一种。

[0008] 可选地，以所述培养基为基准，所述FBS的含量为5～10体积％，所述EGF的浓度为15～20μM，所述bFGF的浓度为15～20μM，所述B27的含量为1～5体积％，余量为所述DMEM/F 
12培养基。

[0009] 第二方面，本公开提供一种培养神经母细胞瘤类器官的方法，该方法包括：

[0010] 将神经母细胞瘤组织细胞、培养基和温敏性水凝胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基为第一方面中任一项所述的培养基；

[0011] 对所述待培养物进行培养扩增，得到神经母细胞瘤类器官。

[0012] 可选地，所述将神经母细胞瘤组织细胞、培养基和温敏性水凝胶混合，得到待培养物，包括：

[0013] 将所述神经母细胞瘤组织细胞与所述培养基混合，得到预混物，其中，所述预混物5 5
中，所述神经母细胞瘤组织细胞的浓度为1×10～5×10个/mL；

[0014] 将所述预混物与所述温敏性水凝胶混合，得到所述待培养物，其中，相对于1体积份的所述预混物，所述温敏性水凝胶的用量为1～4体积份。

[0015] 第三方面，本公开提供一种用于构建神经母细胞瘤异种移植模型的移植体，所述移植体包括神经母细胞瘤类器官，以及包裹在所述神经母细胞瘤类器官表面的包裹层，其
中，所述神经母细胞瘤类器官由第二方面任一项所述的方法制备得到。

[0016] 可选地，所述神经母细胞瘤类器官的直径为1～5mm，所述包裹层的厚度为1～4mm；优选地，所述包裹层为温敏性水凝胶层。

[0017] 第四方面，本公开提供第三方面任一项所述的移植体在构建神经母细胞瘤异种移植模型中的用途。

[0018] 第五方面，本公开提供一种生产神经母细胞瘤异种移植小鼠模型的方法，该方法包括：

[0019] 将第三方面任一项所述的移植体植入免疫缺陷型小鼠的皮下和/或原位组织中，得到所述神经母细胞瘤异种移植小鼠模型。

[0020] 通过上述技术方案，利用本公开提供的用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，能够有效提升神经母细胞瘤类器官培养的成功率。

[0021] 本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

[0022] 以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

[0023] 本公开的第一方面提供一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，该培养基中含有α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子。

[0024] 本公开的发明人意外地发现，将α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子组合使用后，能够有效提升神经母细胞瘤类器官体外培养的成功率。

[0025] 本公开提供的上述培养基中含有α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子，利用该培养基进行神经母细胞瘤类器官的体外培养，能够有效提升培养成功率。

[0026] 根据本公开，上述培养基中，α‑氨基异己酸和血小板衍生生长因子的浓度可以在一定的范围内变化，例如，以所述培养基为基准，所述α‑氨基异己酸的浓度可以为0.5～
1.5mmol/L，所述血小板衍生生长因子的浓度可以为5～15ng/mL。

[0027] 根据本公开，为了进一步提升神经母细胞瘤类器官的培养成功率，优选情况下，所述培养基中还可以含有DMEM/F 12培养基、FBS、EGF、bFGF和B27中的至少一种。

[0028] 可选地，以所述培养基为基准，所述FBS的含量为5～10体积％，所述EGF的浓度为15～20μM，所述bFGF的浓度为15～20μM，所述B27的含量为1～5体积％，余量为所述DMEM/F 
12培养基。

[0029] 本公开的第二方面提供一种培养神经母细胞瘤类器官的方法，该方法包括：将神经母细胞瘤组织细胞、培养基和温敏性水凝胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基为第
一方面中任一项所述的培养基；对所述待培养物进行培养扩增，得到神经母细胞瘤类器官。

[0030] 根据本公开，具体地，神经母细胞瘤组织细胞为神经母细胞瘤原生组织经酶解处理后得到的细胞，其中包括神经母细胞瘤细胞和间质细胞。将神经母细胞瘤原生组织进行
酶解处理时，可以将神经母细胞瘤原生组织的组织块与酶解液进行常规的混合培养，然后
经过滤和离心等分离操作后，得到上述神经母细胞瘤组织细胞。其中，上述酶解处理过程中
涉及的酶解液可以在较大的范围内选择，例如可以是浓度为1～2mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液。

[0031] 根据本公开，温敏性水凝胶可以在较大的范围内选择，例如可以是2×的Mebio Gel温敏水凝胶。

[0032] 根据本公开，所述将神经母细胞瘤组织细胞、培养基和温敏性水凝胶混合，得到待培养物，可以包括：将所述神经母细胞瘤组织细胞与所述培养基混合，得到预混物，其中，所
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述预混物中，所述神经母细胞瘤组织细胞的浓度为1×10～5×10个/mL；将所述预混物与
所述温敏性水凝胶混合，得到所述待培养物，其中，相对于1体积份的所述预混物，所述温敏
性水凝胶的用量为1～4体积份。

[0033] 在将所述神经母细胞瘤组织细胞与所述培养基混合时，可以将所述神经母细胞瘤组织细胞加入至所述培养基中，也可以将所述培养基加入至装载有所述神经母细胞瘤组织
细胞的容器中。所述预混物中的细胞浓度可以采用已有技术进行检测，此处不再赘述。

[0034] 同理，在将所述预混物与所述温敏性水凝胶混合时，可以将所述预混物加入至所述温敏性水凝胶中，也可以将所述温敏性水凝胶加入至所述预混物中。

[0035] 根据本公开，对所述待培养物进行培养扩增，得到神经母细胞瘤类器官，可以包括：将所述待培养物加入至培养板的培养孔中，使得每个培养孔中含有100～300μL的所述
待培养物，然后针对每个培养孔中的所述待培养物进行换液传代培养，直至培养孔中的培
养物的直径不小于0.5mm，得到所述神经母细胞瘤类器官。

[0036] 根据本公开，神经母细胞瘤培养成功后，可以进行常规冷冻处理。

[0037] 在上述技术方案中，由于所采用的培养基为本公开第一方面中提供的培养基，因此利用上述方法培养神经母细胞瘤的成功率较高；此外，上述方法中采用神经母细胞瘤组
织细胞作为培养用的原代细胞，由于神经母细胞瘤组织细胞中除了含有神经母细胞瘤细胞
外，还含有间质细胞，因此利用上述方法培养得到的神经母细胞瘤类器官较好地保留了神
经母细胞瘤的异质性，其生物学特性与神经母细胞瘤原生组织的生物学特性相似，这有利
于神经母细胞瘤类器官在体外稳定传代，也有利于神经母细胞瘤的突变基因在神经母细胞
瘤类器官中稳定表达。

[0038] 本公开的第三方面提供一种用于构建神经母细胞瘤异种移植模型的移植体，所述移植体包括神经母细胞瘤类器官，以及包裹在所述神经母细胞瘤类器官表面的包裹层，其
中，所述神经母细胞瘤类器官由第二方面任一项所述的方法制备得到。

[0039] 可选地，所述神经母细胞瘤类器官的直径为1～5mm，所述包裹层的厚度为1～4mm；优选地，所述包裹层为温敏性水凝胶层。

[0040] 在上述技术方案中，本公开提供的移植体中含有神经母细胞瘤类器官，由于神经母细胞瘤类器官仅需少量的原生组织即可培养得到，且培养过程简单、快速、成功率高，因
此，利用该移植体进行异种移植模型构建时，能够有效增加最终构建得到的异种移植模型
的数量，能够为临床治疗或科学研究提供更多的资源。同时，上述移植体还含有包裹层，包
裹层包裹在类器官表面，能够保障移植体中的类器官的活性，有效提升构建异种移植模型
的成功率。

[0041] 本公开的第四方面提供第三方面任一项所述的移植体在构建神经母细胞瘤异种移植模型中的用途。

[0042] 本公开的第五方面提供一种生产神经母细胞瘤异种移植小鼠模型的方法，该方法包括：将第三方面任一项所述的移植体植入免疫缺陷型小鼠的皮下和/或原位组织中，得到
所述神经母细胞瘤异种移植小鼠模型。

[0043] 下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

[0044] 本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。

[0045] 在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温(20‑25℃)。本公开实施例中使用的试剂来源如下：

[0046] RS‑I Medium购自AQIX Liquid；DMEM‑F12、EGF、BioTrypsin‑EDTA(0.25％)购自Gibco；bFGF和B27购自invitrogen公司；Ⅰ型胶原酶购自sigma Invitroge；α‑
氨基异己酸购自hengdailao；PDGF购自北京中科物源物技术有限公司；Mebio Gel温敏水凝
胶购自Cosmo。

[0047] 本公开实施例中使用的实验动物和细胞来源如下：

[0048] 清洁级nu/nu成年裸鼠购自南京君科生物科技；SH‑SY5Y细胞株购自上海通蔚生物科技。

[0049] 本公开实施例中使用的培养基为自主配置的用于神经母细胞瘤类器官培养的专用培养基(以下统称为“专用培养基”)，包括：DMEM/F 12培养基，10体积％的FBS(胎牛血
清)、浓度为20μM的EGF(表皮细胞生长因子)、浓度为20μM的bFGF(碱性成纤维细胞生长因
子)、2体积％的B27、浓度为0.8mmol/L的α‑氨基异己酸和浓度为10ng/mL的PDGF(血小板衍
生生长因子)。

[0050] 实施例1

[0051] 本实施例用于说明神经母细胞瘤类器官的制备。

[0052] (1)神经母细胞瘤组织样本的保存与运输

[0053] 获取临床确诊的神经母细胞瘤患者的手术组织，作为神经母细胞瘤组织样本，然后保存在含 RS‑I Medium的保存液中，并于48小时内4度冷链运输至操作室。

[0054] (2)神经母细胞瘤组织细胞的获取

[0055] 将上述获取的神经母细胞瘤组织样本置于无菌培养皿中，预处理以除去血块、被膜及坏死组织，然后利用无菌PBS冲洗3次，冲洗结束后吸除PBS。之后在培养皿中加入浓度
为1.5mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液，其中，每1mg神经母细胞瘤组织样本对应加入10mL上述Ⅰ型胶
3
原酶溶液。将神经母细胞瘤组织样本切割成1mm 左右的小块，然后将培养皿置于30rpm转速
的摇床上，并于37℃培养箱中酶解1h。

[0056] 酶解结束后，将收集的酶解液利用100μm细胞筛进行过滤，收集滤液，得到细胞悬液。将收集的细胞悬液以1500rpm的条件离心5min，然后利用PBS漂洗3次。漂洗结束后，于
300g的条件下离心3min，弃上清，收集细胞沉淀，得到神经母细胞瘤组织细胞。必要时，可将
上述获取的神经母细胞瘤组织细胞保存于DMEM/F 12培养基中。

[0057] (3)神经母细胞瘤类器官的培养

[0058] 将步骤(2)获取的神经母细胞瘤组织细胞与专用培养基混合，使得神经母细胞瘤5
组织细胞的浓度为1×10个/mL，得到预混物。将上述预混物与2×的Mebio Gel温敏水凝胶
等体积混合，得到待培养物。将待培养物加入细胞培养板的培养孔中，每孔加入量为100μL，
然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养1h，之后每孔中加入150μL专用培养基，继续培
养。培养过程中，每3天更换一次专用培养基，每7天进行一次传代。培养过程中进行显微镜
检测，当单个培养孔中的培养物直径大于0.5mm时，培养成功，得到神经母细胞瘤类器官。

[0059] 实施例2

[0060] 本实施例用于说明本公开移植体的制备。

[0061] 将实施例1中培养的神经母细胞瘤类器官继续培养，直至单个神经母细胞瘤类器官的直径不小于1.0mm，然后将每个培养孔中的类器官连同其周围厚度不小于1.0mm的包覆
层一起取出，得到本实施例的移植体A。

[0062] 实施例3

[0063] 使用实施例1的方法培养神经母细胞瘤类器官，不同的是：所使用的专用培养基中，α‑氨基异己酸的浓度为0.5mmol/L，PDGF的浓度为15ng/mL。

[0064] 实施例4

[0065] 使用实施例1的方法培养神经母细胞瘤类器官，不同的是：所使用的专用培养基中，α‑氨基异己酸的浓度为1.5mmol/L，PDGF的浓度为5ng/mL。

[0066] 实施例5

[0067] 按照实施例1的方法培养神经母细胞瘤类器官，不同的是：所使用的专用培养基中，α‑氨基异己酸的浓度为0.3mmol/L，PDGF的浓度为18ng/mL。

[0068] 实施例6

[0069] 按照实施例1的方法培养神经母细胞瘤类器官，不同的是：所使用的专用培养基中，α‑氨基异己酸的浓度为1.8mmol/L，PDGF的浓度为3ng/mL。

[0070] 对比例1

[0071] 按照实施例1的方法培养神经母细胞瘤类器官，不同的是：步骤(3)中使用的培养基为第一培养基，与上述专用培养基相比，该第一培养基中不含有α‑氨基异己酸。

[0072] 对比例2

[0073] 按照实施例1的方法培养神经母细胞瘤类器官，不同的是：步骤(3)中使用的培养基为第二培养基，与上述专用培养基相比，该第二培养基中不含有PDGF。

[0074] 测试例1

[0075] 1、神经母细胞瘤类器官数量检测

[0076] 在开始培养后的第14天，使用倒置显微镜分别统计实施例1、实施例3～6和对比例1～2中培养的神经母细胞瘤类器官数量，其数值以“M±SD”表示，统计结果见表1。

[0077] 表1

[0078] 培养方法 神经母细胞瘤类器官数量(×103个/mL)实施例1 9.96±1.14
实施例3 8.73±1.03
实施例4 8.12±1.22
实施例5 6.11±0.94
实施例6 5.94±1.16
对比例1 0.91±2.32
对比例2 0.16±1.67

[0079] 由实施例1、实施例3～6、对比例1～2和表1可以看出，在所使用的培养基不同的情况下，开始培养14天后，实施例1、实施例3～6中培养成功的神经母细胞瘤类器官数量显著
高于对比例1～2，说明本公开提供的培养基能够有效提升神经母细胞瘤类器官培养的成功
率。

[0080] 2、神经母细胞瘤类器官细胞活力检测

[0081] 收集实施例1、实施例3～6、对比例1～2中培养的神经母细胞瘤类器官，分别制成4
细胞浓度为1×10个/mL的单细胞悬液。然后将各细胞悬液接种至96孔培养板中进行培养，
每孔接种量为180μL，每组细胞悬液重复接种5个孔。接种完成后，将接种有各细胞悬液的96
孔培养板置于37℃，5％CO2的培养箱中培养12h，然后向每孔中加入10μL浓度为5mg/mL的
MTT溶液，继续培养4h。培养结束后，以3000rpm的条件离心5min，去除上清液，然后加入150μ
L DMSO以溶解结晶体，溶解完全后，将溶解产物置于酶标仪下检测595nm时的吸光度值，计
算并统计各组的细胞活力，统计结果见表2。

[0082] 表2

[0083]培养方法 细胞活力(％)
实施例1 93.14±1.21
实施例3 90.59±0.86
实施例4 92.21±0.96
实施例5 79.54±1.04
实施例6 66.38±1.11
对比例1 36.32±2.14
对比例2 38.21±1.12

[0084] 由表2可以看出，在所使用的培养基不同的情况下，实施例1、实施例3～6中培养成功的神经母细胞瘤类器官的细胞活力显著高于对比例1～2，说明本公开提供的培养基能够
有效提升培养得到的神经母细胞瘤类器官的细胞活力。

[0085] 测试例2

[0086] 将人神经母细胞瘤细胞株SH‑SY5Y作为移植体B。然后利用实施例2制备得到的移植体A和上述移植体B构建神经母细胞瘤异种移植小鼠模型a和b。

[0087] 神经母细胞瘤异种移植小鼠模型的构建方法为：取清洁级nu/nu成年裸鼠，利用10mg/mL麻醉药(含2g/L甲苯噻嗪+5g/L氯胺酮)麻醉后，固定于无菌手术台上，使用75％的
酒精擦拭背部皮肤后，用消毒手术刀切开其背部右侧的肾部皮肤，切口为1cm，使小鼠右肾
暴露。然后使用套管针将备好的移植体快速植入肾内，并用消毒纱布处理窗口出血部位，之
后将植入有移植体的右肾复位，缝合。每天观察小鼠，待移植体成瘤，得到胆管癌异种移植
模型。

[0088] 建模结束后，利用IVIS Spectrum CT系统观测术后小鼠肾内成瘤情况，计算成功率，结果见表3。

[0089] 表3

[0090]

[0091] 由表3可以看出，利用实施例2制备的移植体构建神经母细胞瘤异种移植小鼠模型的成功率，显著高于利用人神经母细胞瘤细胞株SH‑SY5Y时的成功率，由此说明，本公开提
供的移植体有助于提升构建异种移植模型的成功率。

[0092] 以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这
些简单变型均属于本公开的保护范围。

[0093] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可
能的组合方式不再另行说明。

[0094] 此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。