检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂

摘要

本发明公开了检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂。本发明公开的检测生物膜蛋白质间相互作用的方法包括：连接蛋白质X与Y，得到X‑Y；连接蛋白质YL与R，得到YL‑R；Y与YL间具有相互作用，R能驱动相分离产生相变液滴；连接XL与报告基团J得到XL‑J；向生物细胞中导入X‑Y的编码基因，使X‑Y的编码基因得到表达，得到重组细胞，X‑Y定位于生物膜上；向重组细胞的培养体系中加入YL‑R和XL‑J，检测J的信号是否在R形成的相变液滴中聚集，确定X和XL间是否具有相互作用。本发明的方法操作简便、灵敏度高、成本低廉、适用性广。

权利要求

1.检测蛋白质间相互作用的方法，待测蛋白质名称为X和XL，所述X为生物膜蛋白质，所述方法包括U1）和U2）：

U1）连接所述X与名称为Y的蛋白质，将得到的重组蛋白记为X‑Y；连接名称分别为YL与R的蛋白质，将得到的重组蛋白记为YL‑R；所述Y与所述YL间具有相互作用，所述R能驱动相分离产生相变液滴；连接所述XL与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为XL‑J；

所述XL为非生物膜蛋白质，U2）包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因，使所述X‑Y的编码基因得到表达，得到重组细胞，所述X‑Y定位于所述重组细胞的生物膜上；向所述重组细胞的培养体系中加入所述YL‑R和所述XL‑J，检测所述J的信号是否在所述R形成的相变液滴中聚集，确定所述X和所述XL间是否具有相互作用：如所述J的信号在所述相变液滴中聚集，所述X和所述XL间具有或候选具有相互作用；如所述J的信号在所述相变液滴中没有聚集，所述X和所述XL间不具有或候选不具有相互作用；

所述XL为生物膜蛋白质，U2）包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因，使所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因得到表达，得到重组细胞，所述X‑Y和所述XL‑J定位于所述重组细胞的生物膜上；向所述重组细胞的培养体系中加入所述YL‑R，检测所述J的信号是否在所述R形成的相变液滴中聚集，确定所述X和所述XL间是否具有相互作用：如所述J的信号在所述相变液滴中聚集，所述X和所述XL间具有或候选具有相互作用；如所述J的信号在所述相变液滴中没有聚集，所述X和所述XL间不具有或候选不具有相互作用。

2.鉴定蛋白质间互作调控因子的方法，待测蛋白质名称为X和XL，所述X为生物膜蛋白质，所述X和所述XL间具有相互作用，所述方法包括V1）和V2）：V1）连接所述X与名称为Y的蛋白质，将得到的重组蛋白记为X‑Y；连接名称分别为YL与R的蛋白质，将得到的重组蛋白记为YL‑R；所述Y与所述YL间具有相互作用，所述R能驱动相分离产生相变液滴；连接所述XL与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为XL‑J；

所述XL为非生物膜蛋白质，V2）包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因，使所述X‑Y的编码基因得到表达，得到重组细胞，所述X‑Y定位于所述重组细胞的生物膜上；向所述重组细胞的培养体系中加入所述YL‑R和所述XL‑J，得到对照体系；向所述重组细胞的培养体系中加入待测调控因子、所述YL‑R和所述XL‑J，得到待测体系；然后检测所述待测体系和所述对照体系中所述J的信号在所述R形成的相变液滴中的强度，确定所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用是否具有调控作用：如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中高于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有促进作用；如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中等于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用不具有或候选不具有调控作用；如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中低于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有抑制作用；

所述XL为生物膜蛋白质，V2）包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因，使所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因得到表达，得到重组细胞，所述X‑Y和所述XL‑J定位于所述重组细胞的生物膜上；向所述重组细胞的培养体系中加入所述YL‑R，得到对照体系；向所述重组细胞的培养体系中加入待测调控因子和所述YL‑R，得到待测体系；然后检测所述待测体系和所述对照体系中所述J的信号在所述R形成的相变液滴中的强度，确定所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用是否具有调控作用：如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中高于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有促进作用；如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中等于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用不具有或候选不具有调控作用；如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中低于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有抑制作用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述YL‑R还带有名称为K的报告基团，所述K不同于所述J；

和/或，所述X‑Y还带有名称为L的报告基团，所述L不同于所述K与所述J。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述L、所述K与所述J为荧光报告基团。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述荧光报告基团为荧光蛋白质。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述X‑Y中的所述X与所述Y通过连接区或化学键相连；

所述YL‑R中的所述YL与所述R通过所述连接区或化学键相连；

所述XL‑J中的所述XL与所述J通过所述连接区或化学键相连。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述连接区为（Gly‑Gly‑Ser）n或含有（Gly‑Gly‑Ser）n的多肽，n为大于等于2的自然数。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述R为低复杂度结构域或含有所述低复杂度结构域的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述低复杂度结构域为A1）或A2）或A3）：A1）氨基酸序列是序列5的第273‑484位所示的蛋白质；

A2）将序列表中序列5的第273‑484位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3）在A1）或A2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Y为FKBP或含有所述FKBP的蛋白质，所述YL为FRB或含有所述FRB的蛋白质。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述FKBP为B1）或B2）或B3）：B1）氨基酸序列是序列9的第165‑205位所示的蛋白质；

B2）将序列表中序列9的第165‑205位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

B3）在B1）或B2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述FRB为C1）或C2）或C3）：C1）氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C2）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

C3）在C1）或C2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

和/或，所述YL‑R为D1）或D2）或D3）：D1）氨基酸序列是序列13的273‑592位所示的蛋白质；

D2）将序列表中序列13的273‑592位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

D3）在D1）或D2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Y为PDZ或含有所述PDZ的蛋白质，所述YL为KKETPV或含有所述KKETPV的蛋白质。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述PDZ为E1）或E2）或E3）：E1）氨基酸序列是序列9的第45‑150位所示的蛋白质；

E2）将序列表中序列9的第45‑150位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

E3）在E1）或E2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述KKETPV为序列7所示的蛋白质；

和/或，所述YL‑R为F1）或F2）或F3）：F1）氨基酸序列是序列11的273‑504位所示的蛋白质；

F2）将序列表中序列11的273‑504位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

F3）在F1）或F2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为动物细胞、植物细胞或微生物细胞；

和/或，所述生物膜为细胞膜或细胞器膜。

15.用于权利要求1‑13中任一所述方法的成套试剂，为下述M1）或M2）：M1）成套蛋白质，由权利要求1‑13中任一所述YL‑R与所述Y组成；

M2）成套生物材料，由生物材料1和生物材料2组成；

所述生物材料1为下述m1）至m4）中的任一种：m1）编码权利要求1‑13中任一所述YL‑R的核酸分子；

m2）含有m1）所述核酸分子的表达盒；

m3）含有m1）所述核酸分子的重组载体、或含有m2）所述表达盒的重组载体；

m4）含有m1）所述核酸分子的重组微生物、或含有m2）所述表达盒的重组微生物、或含有m3）所述重组载体的重组微生物；

所述生物材料2为下述n1）至n4）中的任一种：n1）编码权利要求1‑13中任一所述Y的核酸分子；

n2）含有n1）所述核酸分子的表达盒；

n3）含有n1）所述核酸分子的重组载体、或含有n2）所述表达盒的重组载体；

n4）含有n1）所述核酸分子的重组微生物、或含有n2）所述表达盒的重组微生物、或含有n3）所述重组载体的重组微生物。

16.根据权利要求15所述的成套试剂，其特征在于：编码权利要求1‑13中任一所述YL‑R的核酸分子为如下x11）或x12）：x11）编码序列是序列表中序列14的第819‑1778位的cDNA分子或DNA分子；

x12）编码序列是序列表中序列12的第819‑1517位的cDNA分子或DNA分子；

和/或，编码权利要求1‑13中任一所述Y的核酸分子为如下y11）或y12）：y11）编码序列是序列表中序列10的第501‑623位的cDNA分子或DNA分子；

y12）编码序列是序列表中序列10的第141‑458位的cDNA分子或DNA分子。

17.权利要求15或16所述成套试剂的下述任一应用：X1）检测生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用；

X2）检测生物膜蛋白质间的相互作用；

X3）鉴定生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子；

X4）鉴定生物膜蛋白质间互作调控因子；

X5）筛选生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子；

X6）筛选生物膜蛋白质间互作调控因子；

X7）检测物质对生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间相互作用的影响；

X8）检测物质对生物膜蛋白质间相互作用的影响；

X9）制备检测生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间相互作用的产品；

X10）制备检测生物膜蛋白质间相互作用的产品；

X11）制备鉴定生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子的产品；

X12）制备鉴定生物膜蛋白质间互作调控因子的产品；

X13）制备筛选生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子的产品；

X14）制备筛选生物膜蛋白质间互作调控因子的产品。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于：所述生物膜为细胞膜或细胞器膜。

说明书

检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中，检测生物膜蛋白质间相互作用的方法及所用成套试剂。

背景技术

[0002] “相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命活动中行使重要
的生物学功能。

[0003] 相关研究发现，具有特定结构的生物大分子在一定浓度下可因相互作用而高度聚集，从而从一般溶液相中分离出来，形成一个大分子富集的独立的相(称为第二相，以区别
于原溶液相)，这个现象被称为“相变”(或“相分离”)。在显微镜下可见第二相内含有大量聚
集产物(小液滴或固体颗粒或凝胶状物等)，其直径可达微米级甚至更大，具有较高的辨识
度。

[0004] 在生物细胞中，越来越多的研究发现含有低复杂度结构域(low‑complexity domain，简称LCD)的蛋白可驱动相分离的发生，产生相变液滴。低复杂性结构域是一种富含
或仅由少数类型氨基酸组成的蛋白质片段，这些片段的组合通常遵循简单模式，如串联重
复等。LCD蛋白在生物体中广泛存在，并在细胞信号转导、蛋白质互作网络中发挥重要作用。
研究发现，与神经退行性疾病密切相关的FUS(fused in sarcoma)蛋白的LCD结构域可介导
相变发生。

[0005] 蛋白质间的相互作用是一切生命活动的基础,研究蛋白互作及调控是了解蛋白质功能和解析相关信号通路的重要手段，也有助于潜在药物靶点的开发。相对于细胞质中蛋
白质的相互作用，检测位于细胞膜和细胞器膜上的蛋白质的相互作用面临着更大的挑战，
包括膜结构上的蛋白不易提取，相互作用时间短且作用力弱等，鉴定蛋白互作的传统方法
往往难以检测膜蛋白互作。如经典的免疫沉淀技术适用于非跨膜蛋白，跨膜蛋白表达纯化
后由于脱离了膜环境而使其空间结构发生改变，影响到其蛋白功能并进而影响免疫沉淀效
果。旨在研究膜蛋白互作的分离泛素酵母双杂交(DUALmembrane)系统则因过高的假阳性结
果而需要后续繁琐的鉴定工作。近年来发展起来的以BioID、APEX和PUP‑IT为代表的蛋白邻
近催化标记技术，通过在诱饵蛋白上融合具有邻近标记功能的酶可实现对膜蛋白间相互作
用的鉴定，然而这种技术存在的普遍问题是酶的自我修饰难以避免，且这种自我修饰可能
会因抑制酶的活性或耗尽底物而对实验结果造成影响。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何检测生物膜蛋白质间或生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用以及进一步如何鉴定或筛选这些蛋白质间互作的调控因子。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测蛋白质间相互作用的方法，待测蛋白质名称为X和XL，所述X为生物膜蛋白质，所述方法包括U1)和U2)：

[0008] U1)连接所述X与名称为Y的蛋白质，将得到的重组蛋白记为X‑Y；连接名称分别为YL与R的蛋白质，将得到的重组蛋白记为YL‑R；所述Y与所述YL间具有相互作用，所述R能驱动
相分离产生相变液滴；连接所述XL与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为XL‑J；

[0009] 所述XL为非生物膜蛋白质，U2)包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因，使所述X‑Y的编码基因得到表达，得到重组细胞，所述X‑Y定位于所述重组细胞的生物膜上；向所
述重组细胞的培养体系中加入所述YL‑R和所述XL‑J，检测所述J的信号是否在所述R形成的
相变液滴中聚集，确定所述X和所述XL间是否具有相互作用：如所述J的信号在所述相变液
滴中聚集，所述X和所述XL间具有或候选具有相互作用；如所述J的信号在所述相变液滴中
没有聚集，所述X和所述XL间不具有或候选不具有相互作用；

[0010] 所述XL为生物膜蛋白质，U2)包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因，使所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因得到表达，得到重组细胞，所
述X‑Y和所述XL‑J定位于所述重组细胞的生物膜上；向所述重组细胞的培养体系中加入所
述YL‑R，检测所述J的信号是否在所述R形成的相变液滴中聚集，确定所述X和所述XL间是否
具有相互作用：如所述J的信号在所述相变液滴中聚集，所述X和所述XL间具有或候选具有
相互作用；如所述J的信号在所述相变液滴中没有聚集，所述X和所述XL间不具有或候选不
具有相互作用。

[0011] 所述生物膜蛋白质为位于生物膜上的蛋白质。所述非生物膜蛋白质为不位于生物膜上的蛋白质。

[0012] 本发明还提供了鉴定蛋白质间互作调控因子的方法，待测蛋白质名称为X和XL，所述X为生物膜蛋白质，所述X和所述XL间具有相互作用，所述方法包括V1)和V2)：

[0013] V1)连接所述X与名称为Y的蛋白质，将得到的重组蛋白记为X‑Y；连接名称分别为YL与R的蛋白质，将得到的重组蛋白记为YL‑R；所述Y与所述YL间具有相互作用，所述R能驱动
相分离产生相变液滴；连接所述XL与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为XL‑J；

[0014] 所述XL为非生物膜蛋白质，V2)包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因，使所述X‑Y的编码基因得到表达，得到重组细胞，所述X‑Y定位于所述重组细胞的生物膜上；向所
述重组细胞的培养体系中加入所述YL‑R和所述XL‑J，得到对照体系；向所述重组细胞的培养
体系中加入待测调控因子、所述YL‑R和所述XL‑J，得到待测体系；然后检测所述待测体系和
所述对照体系中所述J的信号在所述R形成的相变液滴中的强度，确定所述待测调控因子对
所述X和所述XL间的相互作用是否具有调控作用：如所述J的信号强度在所述待测体系的相
变液滴中高于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候
选具有促进作用；如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中等于所述对照体系，所
述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用不具有或候选不具有调控作用；如所述J的
信号强度在所述待测体系的相变液滴中低于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和
所述XL间的相互作用具有或候选具有抑制作用；

[0015] 所述XL为生物膜蛋白质，V2)包括：向生物细胞中导入所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因，使所述X‑Y的编码基因和所述XL‑J的编码基因得到表达，得到重组细胞，所
述X‑Y和所述XL‑J定位于所述重组细胞的生物膜上；向所述重组细胞的培养体系中加入所
述YL‑R，得到对照体系；向所述重组细胞的培养体系中加入待测调控因子和所述YL‑R，得到
待测体系；然后检测所述待测体系和所述对照体系中所述J的信号在所述R形成的相变液滴
中的强度，确定所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用是否具有调控作用：如所
述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中高于所述对照体系，所述待测调控因子对所
述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有促进作用；如所述J的信号强度在所述待测体系
的相变液滴中等于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用不具
有或候选不具有调控作用；如所述J的信号强度在所述待测体系的相变液滴中低于所述对
照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有抑制作用。

[0016] 上文中，所述YL‑R的加入可直接向所述重组细胞的体系中加入所述YL‑R实现，也可通过向所述重组细胞中导入所述YL‑R的编码基因并使所述YL‑R的编码基因得到表达实现。

[0017] 所述XL‑J的加入可直接向所述重组细胞的体系中加入所述XL‑J实现，也可通过向所述重组细胞中导入所述XL‑J的编码基因并使所述XL‑J的的编码基因得到表达实现。

[0018] 上文中，所述YL‑R还可带有名称为K的报告基团，所述K不同于所述J。

[0019] 所述X‑Y还可带有名称为L的报告基团，所述L不同于所述K与所述J。

[0020] 所述L、所述K与所述J可为荧光报告基团。

[0021] 所述荧光报告基团可为荧光蛋白质。

[0022] 在本发明的一个实施例中，所述J为红色荧光蛋白质(mCherry)，所述K为绿色荧光蛋白质(GFP)，所述L为蓝色荧光蛋白质(BFP)。

[0023] 所述X‑Y中的所述X与所述Y可通过连接区或化学键相连；

[0024] 所述YL‑R中的所述YL与所述R可通过所述连接区或化学键相连；

[0025] 所述XL‑J中的所述XL与所述J可通过所述连接区或化学键相连。

[0026] 所述连接区可为(Gly‑Gly‑Ser)n或含有(Gly‑Gly‑Ser)n的多肽，n为大于等于2的自然数。

[0027] 所述R可为低复杂度结构域或含有所述低复杂度结构域的蛋白质。

[0028] 所述低复杂度结构域可为A1)或A2)或A3)：

[0029] A1)氨基酸序列是序列5的第273‑484位所示的蛋白质；

[0030] A2)将序列表中序列5的第273‑484位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0031] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

[0032] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在A1)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0033] 表1、标签的序列

[0034] 标签 残基 序列Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
Poly‑His 2‑10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL

[0035] 上述A2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0036] 上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0037] 上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将编码所述低复杂度结构域的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在
其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0038] 所述Y可为FKBP或含有所述FKBP的蛋白质，所述YL可为FRB或含有所述FRB的蛋白质。

[0039] 所述FKBP可为B1)或B2)或B3)：

[0040] B1)氨基酸序列是序列9的第165‑205位所示的蛋白质；

[0041] B2)将序列表中序列9的第165‑205位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0042] B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0043] 所述FRB可为C1)或C2)或C3)：

[0044] C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

[0045] C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0046] C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

[0047] 所述YL‑R可为D1)或D2)或D3)：

[0048] D1)氨基酸序列是序列13的273‑592位所示的蛋白质；

[0049] D2)将序列表中序列13的273‑592位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0050] D3)在D1)或D2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

[0051] 上述B2)或C2)或D2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0052] 上述B2)或C2)或D2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0053] 上述B2)或C2)或D2)中的蛋白质的编码基因可通过将编码所述R的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′
端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0054] 所述Y可为PDZ或含有所述PDZ的蛋白质，所述YL可为KKETPV或含有所述KKETPV的蛋白质。

[0055] 所述PDZ可为E1)或E2)或E3)：

[0056] E1)氨基酸序列是序列9的第45‑150位所示的蛋白质；

[0057] E2)将序列表中序列9的第45‑150位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0058] E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0059] 所述KKETPV可为序列7所示的蛋白质。

[0060] 所述YL‑R可为F1)或F2)或F3)：

[0061] F1)氨基酸序列是序列11的273‑504位所示的蛋白质；

[0062] F2)将序列表中序列11的273‑504位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0063] F3)在F1)或F2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

[0064] 上述E2)或F2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0065] 上述E2)或F2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0066] 上述E2)或F2)中的蛋白质的编码基因可通过将编码所述R的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/
或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0067] 所述生物细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为HEK293细胞。

[0068] 所述生物膜可为细胞膜或细胞器膜。

[0069] 所述重组细胞的培养体系可为能培养所述重组细胞或保存所述重组细胞的体系。

[0070] 本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂为下述M1)或M2)：

[0071] M1)成套蛋白质，由所述YL‑R与所述Y组成；

[0072] M2)成套生物材料，由生物材料1和生物材料2组成；

[0073] 所述生物材料1为下述m1)至m4)中的任一种：

[0074] m1)编码所述YL‑R的核酸分子；

[0075] m2)含有m1)所述核酸分子的表达盒；

[0076] m3)含有m1)所述核酸分子的重组载体、或含有m2)所述表达盒的重组载体；

[0077] m4)含有m1)所述核酸分子的重组微生物、或含有m2)所述表达盒的重组微生物、或含有m3)所述重组载体的重组微生物；

[0078] 所述生物材料2为下述n1)至n4)中的任一种：

[0079] n1)编码所述Y的核酸分子；

[0080] n2)含有n1)所述核酸分子的表达盒；

[0081] n3)含有n1)所述核酸分子的重组载体、或含有n2)所述表达盒的重组载体；

[0082] n4)含有n1)所述核酸分子的重组微生物、或含有n2)所述表达盒的重组微生物、或含有n3)所述重组载体的重组微生物。

[0083] 所述成套试剂具有如下任一功能：

[0084] X1)检测生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用；

[0085] X2)检测生物膜蛋白质间的相互作用；

[0086] X3)鉴定生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0087] X4)鉴定生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0088] X5)筛选生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0089] X6)筛选生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0090] X7)检测物质对生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间相互作用的影响；

[0091] X8)检测物质对生物膜蛋白质间相互作用的影响。

[0092] 编码所述YL‑R的核酸分子可为如下x11)或x12)或x13)或x14)：

[0093] x11)编码序列是序列表中序列14的第819‑1778位的cDNA分子或DNA分子；

[0094] x12)编码序列是序列表中序列12的第819‑1517位的cDNA分子或DNA分子；

[0095] x13)与x11)或x12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述YL‑R的cDNA分子或DNA分子；

[0096] x14)在严格条件下与x11)或x12)或x13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述YL‑R的cDNA分子或DNA分子。

[0097] 编码所述Y的核酸分子可为如下y11)或y12)或y13)或y14)：

[0098] y11)编码序列是序列表中序列10的第501‑623位的cDNA分子或DNA分子；

[0099] y12)编码序列是序列表中序列10的第141‑458位的cDNA分子或DNA分子；

[0100] y13)与y11)或y12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Y的cDNA分子或DNA分子；

[0101] y14)在严格条件下与y11)或y12)或y13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Y的cDNA分子或DNA分子。

[0102] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述YL‑R或所述Y的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，
或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算
机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列
之间的同一性。

[0103] 所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×
SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0104] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0105] m2)所述的含有编码所述YL‑R的核酸分子的表达盒(YL‑R基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述YL‑R的DNA，该DNA不但可包括启动所述YL‑R基因转录的启动子，还可包
括终止所述YL‑R基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

[0106] 可用现有的载体构建含有所述YL‑R基因表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pRSFDuet‑1载体。

[0107] m3)所述重组载体具体可为pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV或pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑FRB，所述pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV为将pRSFDuet‑1载体的NcoI和XhoI识别序列间的
DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列12所示的DNA分子得到的重组载体。所述
pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV含有序列表中序列12所示的DNA片段，能表达序列11所示的蛋
白质。

[0108] 序列11的第3‑9位为His‑tag的氨基酸序列，序列11的第18‑258位为GFP的氨基酸序列，序列11的第273‑484位为FUS蛋白的LCD结构域序列，序列11的第499‑504位为KKETPV
的序列。

[0109] 序列12的第9‑29位为His‑tag的编码序列，序列12的第54‑776位为GFP的编码序列，序列12的第819‑1454位为FUS蛋白的LCD结构域的编码序列，序列12的第1497‑1514位为
KKETPV的编码序列。

[0110] 所述pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑FRB为将pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到
的重组载体。所述pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑FRB含有序列表中序列14所示的DNA片段，能表达
GFP‑LCD与序列3所示的FRB的融合蛋白质(将该融合蛋白质记为GFP‑LCD‑FRB，含有His标
签)，GFP‑LCD‑FRB的氨基酸序列为序列表中序列13。所述pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD载体为将
pRSFDuet‑1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为
序列表中序列6所示的DNA分子得到的重组载体。

[0111] 序列13的第3‑9位为His‑tag的氨基酸序列，序列13的第18‑258位为GFP的氨基酸序列，序列13的第273‑484位为FUS蛋白的LCD结构域序列，序列13的第497‑592位为FRB的氨
基酸序列。

[0112] 序列14的第9‑29位为His‑tag的编码序列，序列14的第54‑776位为GFP的编码序列，序列14的第819‑1454位为FUS蛋白的LCD结构域的编码序列，序列14的第1491‑1778位为
FRB的编码序列。

[0113] 所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为大肠杆菌。

[0114] m4)所述重组微生物可为将所述pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV或所述pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑FRB导入大肠杆菌得到的重组菌。

[0115] n2)所述的含有编码所述Y的核酸分子的表达盒(Y基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述Y的DNA，该DNA不但可包括启动所述Y基因转录的启动子，还可包括终止所
述Y基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

[0116] 可用现有的载体构建含有所述Y基因表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pcDNA3.1载体。

[0117] n3)所述重组载体具体可为pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP，所述pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP为将pcDNA3.1载体的NotI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NotI和XhoI的识别序列)
替换为序列表中序列10所示的DNA分子，得到的重组载体。所述pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP能
表达序列9所示的蛋白质(将该蛋白质记为PDZ‑FKBP‑BFP)。

[0118] 其中，序列10的第9‑1721位所示的DNA分子编码序列9所示的PDZ‑FKBP‑BFP，序列10的第141‑458位编码PDZ，序列10的第501‑623位编码FKBP。序列9的第1‑30位为EGFR蛋白
的信号肽的氨基酸序列，序列9的第45‑150位为PDZ的氨基酸序列，序列9的第165‑205位为
FKBP的氨基酸序列，序列9的第218‑319位为EGFR蛋白的跨膜区的氨基酸序列，序列9的第
332‑570位为BFP的氨基酸序列，序列9的第31‑44位、第151‑164位、第206‑217位、第320‑331
位分别为四个GGS的连接肽的氨基酸序列。

[0119] 所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为大肠杆菌。

[0120] n4)所述重组微生物可为将所述pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP导入大肠杆菌得到的重组菌。

[0121] 所述成套试剂的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

[0122] X1)检测生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用；

[0123] X2)检测生物膜蛋白质间的相互作用；

[0124] X3)鉴定生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0125] X4)鉴定生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0126] X5)筛选生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0127] X6)筛选生物膜蛋白质间互作调控因子；

[0128] X7)检测物质对生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间相互作用的影响；

[0129] X8)检测物质对生物膜蛋白质间相互作用的影响；

[0130] X9)制备检测生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间相互作用的产品；

[0131] X10)制备检测生物膜蛋白质间相互作用的产品；

[0132] X11)制备鉴定生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子的产品；

[0133] X12)制备鉴定生物膜蛋白质间互作调控因子的产品；

[0134] X13)制备筛选生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作调控因子的产品；

[0135] X14)制备筛选生物膜蛋白质间互作调控因子的产品。

[0136] 上述应用中，所述细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为HEK293细胞。

[0137] 上述应用中，所述生物膜可为细胞膜或细胞器膜。

[0138] 上述应用中，所述产品可为试剂盒。

[0139] 上述应用中，筛选蛋白质间相互作用调控因子可进行高通量筛选，鉴定蛋白质间相互作用调控因子也可进行高通量鉴定。

[0140] 实验证明，本发明利用生物大分子相变对目标生物分子的富集作用，发展了一种简单易行的检测生物膜蛋白质间或生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用的方法，
该方法可用于检测生物膜蛋白质间或生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间的相互作用，并利
用该方法进一步筛选影响已知具有相互作用的蛋白质对间相互作用的调控因子。本发明的
方法操作简便、灵敏度高、成本低廉、适用性广，适用于进行信号通路调控物的筛选，并且也
可进行高通量筛选生物膜蛋白质间及生物膜蛋白质与非生物膜蛋白质间互作的调控因子。

附图说明

[0141] 图1为雷帕霉素促进FKBP与FRB间相互作用的检测。A为体系2产生的第二相形态观察，右图为左图框选区域的放大图像；B为体系1‑5的激光共聚焦扫描显微成像分析。标尺＝
20μm。

[0142] 图2为KKETAV抑制KKETPV与PDZ间相互作用的激光共聚焦扫描显微成像分析。标尺＝20μm。

具体实施方式

[0143] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为
常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊
说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应
DNA/RNA的3′末端核苷酸。

[0144] 下述实施例中的pcDNA3.1载体(Yoo et al.,A new strategy for assessing selenoprotein function:siRNA knockdown/knock‑in targeting the 3′‑UTR,RNA
(2007),13:921–929.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的
相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0145] 下述实施例中的HEK293细胞(SHIN et al.,Overexpression of PGC‑1αenhances cell proliferation and tumorigenesis of HEK293 cells through the upregulation 
of Sp1 and Acyl‑CoA binding protein,INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 46:
1328‑1342,2015)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关
实验所用，不可作为其它用途使用。

[0146] 实施例1、细胞膜蛋白互作促进因子的鉴定

[0147] 一、重组载体的制备

[0148] 1、表达mCherry与FRB的融合蛋白的重组载体

[0149] 将pRSFDuet‑1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2的第11‑831位所示的DNA分子，得
到重组载体pRSFDuet‑1‑mCherry，pRSFDuet‑1‑mCherry能表达序列1所示的蛋白质
(mCherry融合His‑tag，记为His‑mCherry)。

[0150] 其中，序列2的第13‑825位编码序列1所示的His‑mCherry，序列2的第815‑820位和第826‑831位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列1的第3‑8位为His‑tag的氨基酸序列，序
列1的第17‑254位为mCherry的氨基酸序列，序列1的第255‑268位为连接区的氨基酸序列。

[0151] 将pRSFDuet‑1‑mCherry的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列4所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet‑1‑mCherry‑FRB，
pRSFDuet‑1‑mCherry‑FRB表达His‑mCherry与序列3所示FRB的融合蛋白质(将该融合蛋白
质记为mCherry‑FRB，含有His标签)。

[0152] 其中，序列4的第3‑293位编码序列3所示的FRB。

[0153] 2、表达GFP‑LCD与KKETPV的融合蛋白的重组载体

[0154] 将pRSFDuet‑1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD，
pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD能表达序列5所示的蛋白质(GFP融合FUS蛋白的LCD结构域，记为GFP‑
LCD，含有His标签)。

[0155] 其中，序列6的第3‑1499位编码序列5所示的蛋白质，序列6的第1489‑1494位和第1500‑1505位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列5的第3‑9位为His‑tag的氨基酸序列，序
列5的第18‑258位为GFP的氨基酸序列，序列5的第273‑484位为FUS蛋白的LCD结构域序列，
序列5的第261‑272位和第485‑496位为连接区的氨基酸序列。

[0156] 将pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列8所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV，
pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV含有序列表中序列12所示的DNA片段，能表达GFP‑LCD与序列7
所示的KKETPV的融合蛋白质(记为GFP‑LCD‑KKETPV，含有His标签)，GFP‑LCD‑KKETPV的氨基
酸序列为序列表中序列11。

[0157] 其中，序列8的第9‑26位编码序列7所示的KKETPV。

[0158] 序列11的第3‑9位为His‑tag的氨基酸序列，序列11的第18‑258位为GFP的氨基酸序列，序列11的第273‑484位为FUS蛋白的LCD结构域序列，序列11的第499‑504位为KKETPV
的序列。

[0159] 序列12的第9‑29位为His‑tag的编码序列，序列12的第54‑776位为GFP的编码序列，序列12的第819‑1454位为FUS蛋白的LCD结构域的编码序列，序列12的第1497‑1514位为
KKETPV的编码序列。

[0160] 3、表达PDZ与FKBP与BFP的融合蛋白的重组载体

[0161] 将pcDNA3.1载体的NotI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NotI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列10所示的DNA分子，得到重组载体pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP，
pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP能表达序列9所示的蛋白质(将该蛋白质记为PDZ‑FKBP‑BFP)。

[0162] 其中，序列10的第9‑1721位所示的DNA分子编码序列9所示的PDZ‑FKBP‑BFP，序列10的第141‑458位编码PDZ，序列10的第501‑623位编码FKBP。序列9的第1‑30位为EGFR蛋白
的信号肽(含有膜定位信号，用于定位于细胞膜)的氨基酸序列，序列9的第45‑150位为PDZ
的氨基酸序列，序列9的第165‑205位为FKBP的氨基酸序列，序列9的第218‑319位为EGFR蛋
白的跨膜区的氨基酸序列，序列9的第332‑570位为BFP的氨基酸序列，序列9的第31‑44位、
第151‑164位、第206‑217位、第320‑331位分别为四个GGS的连接肽的氨基酸序列。

[0163] 二、融合蛋白表达与纯化

[0164] 1、mCherry‑FRB的表达与纯化

[0165] 将步骤一的pRSFDuet‑1‑mCherry‑FRB载体导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21‑pRSFDuet‑1‑mCherry‑FRB。

[0166] 按照下述方法，对重组菌株BL21‑pRSFDuet‑1‑mCherry‑FRB表达的含有His标签的融合蛋白(即mCherry‑FRB)进行纯化：

[0167] (1)细菌培养和蛋白诱导表达：将上述重组菌株接种到1L LB培养基中。37℃，200rpm培养至OD600约0.8‑1(约8‑9hr)。将菌液转移至18℃降温1hr，加IPTG至终浓度为
0.5mM诱导蛋白表达过夜(16hr左右)，得到培养液。

[0168] (2)菌体重悬与破碎：将步骤(1)得到的培养液离心，弃上清液，用40mL binding buffer1重悬菌体沉淀并进行超声破碎，将破碎产物超速离心20000rpm，1hr，收集上清液
(含有目的融合蛋白)。

[0169] binding buffer 1：40mM Tris‑HCl，500mM NaCl,pH＝7.4。

[0170] (3)Ni柱纯化：预先准备好Ni柱，并用binding buffer 1平衡。将步骤(2)得到的上清液倒入Ni柱。待液体快流干时，加入wash buffer 1洗2‑3个柱体积，然后加入elution 
buffer 1进行目的融合蛋白的洗脱，收集流出液。

[0171] wash buffer 1：40mM Tris‑HCl,500mM NaCl,40mM imidazole，pH＝7.4。

[0172] elution buffer 1：40mM Tris‑HCl,500mM NaCl,500mM imidazole，pH＝7.4。

[0173] (4)离子交换纯化：用40mM的Tris‑HCl缓冲液稀释步骤(3)的流出液以降低离子浓度，得到蛋白稀释液。安装阴离子交换柱至ATKA蛋白质纯化系统(GE公司)并完成蛋白稀释
液的上样。采用逐步提高盐离子浓度梯度的方式用洗脱液对结合在柱子上的蛋白进行洗脱
并收集目的融合蛋白。

[0174] 洗脱液由A液和B液组成，A液：40mM Tris‑HCl，pH＝7.4；B液：40mM Tris‑HCl，2M NaCl，pH＝7.4。

[0175] (5)凝胶过滤纯化：将步骤(4)得到的目的融合蛋白超滤浓缩后，用预设的分子筛程序对其进行分离纯化，得到进一步纯化的目的融合蛋白。

[0176] 柱平衡及洗脱所用KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl2,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7.0。

[0177] (6)检测并保存纯化的蛋白：利用SDS‑PAGE对上述步骤纯化得到的BL21‑pRSFDuet‑1‑mCherry‑FRB表达的mCherry‑FRB进行检测，在确定该融合蛋白(即mCherry‑
FRB)大小符合预期后将蛋白浓缩冻存于‑80℃备用。

[0178] 2、GFP‑LCD‑KKETPV的表达与纯化

[0179] 将步骤一的pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV载体导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21‑pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV。

[0180] 按照下述方法，对重组菌株BL21‑pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV表达的含有His标签的融合蛋白(即GFP‑LCD‑KKETPV)进行纯化：

[0181] (1)细菌培养和蛋白诱导表达：将上述重组菌株接种到1L LB培养基中。37℃，200rpm培养至OD600约0.8‑1(约8‑9hr)。将菌液转移至18℃降温1hr，加IPTG至终浓度为
0.5mM诱导蛋白表达过夜(18℃16hr左右)，得到培养液。

[0182] (2)菌体重悬与破碎：将步骤(1)得到的培养液离心，弃上清液，用40mL binding buffer2重悬菌体沉淀并进行超声破碎，将破碎产物超速离心20000rpm，1hr，收集上清液
(含有目的融合蛋白)。

[0183] binding buffer 2：1M KCl,1M urea,50mM Tris‑HCl,10mM imidazole,5％(v/v)glycerol，1.5mMβ‑mercaptoethanol，pH＝7.4。

[0184] (3)Ni柱纯化：预先准备好Ni柱，并用binding buffer 2平衡。将步骤(2)得到的上清液倒入Ni柱。待液体快流干时，加入wash buffer 2洗2‑3个柱体积，然后加入elution 
buffer 2进行目的融合蛋白的洗脱，收集流出液。

[0185] wash buffer 2：1M KCl,1M urea,50mM Tris‑HCl,40mM imidazole,5％(v/v)glycerol，1.5mMβ‑mercaptoethanol,pH＝7.4。

[0186] elution buffer 2：1M KCl,1M urea,50mM Tris‑HCl,500mM imidazole,5％(v/v)glycerol，1.5mMβ‑mercaptoethanol,pH＝7.4。

[0187] (4)凝胶过滤纯化：将步骤(3)得到的目的融合蛋白超滤浓缩后，用预设的分子筛程序对其进行分离纯化，得到进一步纯化的目的融合蛋白。

[0188] 柱平衡及洗脱所用buffer为binding buffer 2。

[0189] (5)检测并保存纯化的蛋白：利用SDS‑PAGE对上述步骤纯化得到的BL21‑pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑KKETPV表达的GFP‑LCD‑KKETPV进行检测，在确定该融合蛋白(即GFP‑
LCD‑KKETPV)大小符合预期后将蛋白浓缩冻存于‑80℃备用。

[0190] 三、转染HEK293细胞

[0191] 将步骤一所得重组载体pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP转染HEK293细胞(贴壁培养)，所5
用转染试剂Hifectin I(北京蒂诺奥生物科技有限公司)，并按照试剂说明书操作。每10 个
HEK293细胞所用重组载体量为1μg，得到转染细胞系。

[0192] 四、雷帕霉素促进FKBP与FRB蛋白间相互作用的验证

[0193] 将步骤三所得转染细胞系培养12‑18小时后，用激光共聚焦扫描显微镜进行图像采集，结果(图1体系1)显示，转染细胞的细胞膜上有蓝色荧光信号(BFP发出的荧光信号)聚
集，表明，PDZ‑FKBP‑BFP定位于细胞膜。

[0194] 向转染细胞系的培养基中加入步骤二所得GFP‑LCD‑KKETPV(终浓度为100nM)后(即得到体系2)进行图像采集，结果(图1体系2)显示这些细胞的细胞膜上发生了相变且相
变所产生第二相呈簇状分布，而绿色荧光信号(GFP发出的荧光信号)聚集于相变产生的第
二相中，表现为在细胞膜上的簇状分布。

[0195] 向体系2中加入FKBP与FRB互作的促进物雷帕霉素(终浓度为1μM)后(即得到体系3)进行图像采集，结果(图1体系3)与体系2结果一致。

[0196] 向体系2中加入步骤二所得mCherry‑FRB(终浓度为100nM)后(即得到体系4)进行图像采集，结果(图1体系4)与体系2结果一致。

[0197] 向体系4中加入雷帕霉素(终浓度为1μM)后(即得到体系5)用激光共聚焦扫描显微镜对体系4的相同视野进行图像采集，结果(图1体系5)显示，雷帕霉素处理后细胞膜上出现
了簇状分布的红色荧光信号(mCherry发出的荧光信号)，且与绿色荧光信号共定位，而细胞
膜上的相变及绿色荧光信号的分布与处理前(图1体系4)相比无明显变化。

[0198] 表2、雷帕霉素促进FKBP与FRB相互作用的检测体系

[0199]体系 PDZ‑FKBP‑BFP mCherry‑FRB GFP‑LCD‑KKETPV 雷帕霉素
1 + ‑ ‑ ‑
2 + ‑ + ‑
3 + ‑ + +
4 + + + ‑
5 + + + +

[0200] 以上结果说明，pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP载体转染细胞所表达的融合蛋白PDZ‑FKBP‑BFP因含有EGFR膜定位信号及其跨膜区而分布于细胞膜上，该定位可通过BFP发出的
荧光来标示。FUS蛋白的LCD结构域可在细胞中介导相变的发生，由该相变产生的第二相可
以用与LCD相连的GFP发出的荧光来标示。将LCD、GFP与KKETPV连接在一起时，KKETPV可通过
与PDZ的互作结合膜定位的PDZ‑FKBP‑BFP，实现自身(GFP‑LCD‑KKETPV)的细胞膜定位；继而
使GFP‑LCD‑KKETPV介导的相变所产生第二相呈簇状分布于细胞膜上，表现为绿色荧光信号
在细胞膜上的簇状分布。当表达PDZ‑FKBP‑BFP的转染细胞系的培养基中含有GFP‑LCD‑
KKETPV和mCherry‑FRB蛋白以及雷帕霉素时，通过雷帕霉素介导FRB与FKBP互作，将
mCherry‑FRB蛋白招募到细胞膜的第二相中，进而使红色荧光信号聚集于第二相中，呈簇状
分布且与绿色荧光蛋白共定位。而在雷帕霉素或FRB蛋白缺失的情况下，检测不到红色荧光
信号的聚集。表明，上述基于细胞膜的相变招募体系可用于鉴定膜蛋白互作促进物。

[0201] 实施例2、细胞膜蛋白互作抑制因子的验证

[0202] 一、重组载体的制备

[0203] 1、表达mCherry与KKETPV的融合蛋白的重组载体

[0204] 将实施例1的pRSFDuet‑1‑mCherry载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列8所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet‑1‑mCherry‑
KKETPV，pRSFDuet‑1‑mCherry‑KKETPV表达His‑mCherry与序列7所示的KKETPV的融合蛋白
质(将该融合蛋白记为mCherry‑KKETPV，含有His标签)。

[0205] 2、表达GFP‑LCD与FRB的融合蛋白的重组载体

[0206] 将实施例1的pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet‑1‑
GFP‑LCD‑FRB，pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑FRB含有序列表中序列14所示的DNA片段，能表达GFP‑
LCD与序列3所示的FRB的融合蛋白质(将该融合蛋白质记为GFP‑LCD‑FRB，含有His标签)，
GFP‑LCD‑FRB的氨基酸序列为序列表中序列13。

[0207] 序列13的第3‑9位为His‑tag的氨基酸序列，序列13的第18‑258位为GFP的氨基酸序列，序列13的第273‑484位为FUS蛋白的LCD结构域序列，序列13的第497‑592位为FRB的氨
基酸序列。

[0208] 序列14的第9‑29位为His‑tag的编码序列，序列14的第54‑776位为GFP的编码序列，序列14的第819‑1454位为FUS蛋白的LCD结构域的编码序列，序列14的第1491‑1778位为
FRB的编码序列。

[0209] 二、融合蛋白mCherry‑KKETPV和GFP‑LCD‑FRB表达与纯化

[0210] 按照实施例1步骤二的方法，将pRSFDuet‑1‑mCherry‑KKETPV和pRSFDuet‑1‑GFP‑LCD‑FRB分别导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后，进行mCherry‑KKETPV和GFP‑LCD‑FRB
的表达与纯化，其中mCherry‑KKETPV的表达与纯化按照实施例1步骤二中mCherry‑FRB的表
达与纯化步骤进行，GFP‑LCD‑FRB的表达与纯化按照实施例1步骤二中GFP‑LCD‑KKETPV的表
达与纯化步骤进行，最终分别得到处于KMEIbuffer中的mCherry‑KKETPV溶液和处于
binding buffer 2中的GFP‑LCD‑FRB溶液。

[0211] 三、转染HEK293细胞

[0212] 按照实施例1步骤三的方法，将实施例1步骤一所得重组载体pcDNA3.1‑PDZ‑FKBP‑BFP转染HEK293细胞(贴壁培养)，得到转染细胞系。

[0213] 四、KKETAV抑制KKETPV与PDZ间相互作用的验证

[0214] 将步骤三所得转染细胞系培养12‑18小时后，用激光共聚焦扫描显微镜进行图像采集，结果(图1体系1)显示，转染细胞的细胞膜上有蓝色荧光信号(BFP发出的荧光信号)聚
集，表明，PDZ‑FKBP‑BFP定位于细胞膜。

[0215] 向上述转染细胞系的培养基中加入步骤二所得GFP‑LCD‑FRB(终浓度为100nM)以及雷帕霉素(终浓度为1μM)后(即得到体系6)进行图像采集，结果(图2体系6)显示这些细胞
的细胞膜上发生了相变且相变所产生第二相呈簇状分布，而绿色荧光信号聚集于相变产生
的第二相中，表现为在细胞膜上的簇状分布。

[0216] 向体系6中加入mCherry‑KKETPV(终浓度为100nM)后(即得到体系7)进行图像采集，结果(图2体系7)显示这些细胞的细胞膜上发生了相变且相变呈簇状分布，而绿色荧光
信号也在细胞膜上呈簇状分布，并且细胞膜上出现了簇状分布的红色荧光信号，与绿色荧
光信号共定位。

[0217] 向体系7中加入KKETPV与PDZ的互作拮抗物KKETAV(即得到体系8，短肽KKETAV可与KKETPV竞争性结合PDZ，且前者与PDZ的亲和力更强，故可将KKETAV看作KKETPV与PDZ的竞争
性互作抑制剂，体系8中KKETAV终浓度为60μM)后用激光共聚焦扫描显微镜对体系7的相同
视野进行图像采集。结果(图2体系8)显示，与处理前(图2体系7)相比，红色荧光信号在细胞
膜上第二相中的聚集消失，而细胞膜上的相变及绿色荧光信号的分布均无明显变化。表明，
KKETAV可明显抑制KKETPV与PDZ间相互作用，验证了KKETAV对KKETPV与PDZ间相互作用的抑
制效果。以上结果表明，上述基于细胞膜的相变招募体系可用于鉴定膜蛋白互作抑制物。

[0218] 表3、KKETAV抑制KKETPV与PDZ相互作用的检测体系

[0219] 体系 PDZ‑FKBP‑BFP mCherry‑KKETPV GFP‑LCD‑FRB 雷帕霉素 KKETAV1 + ‑ ‑ ‑ ‑
6 + ‑ + + ‑
7 + + + + ‑
8 + + + + +