抗CREG单克隆抗体及应用转让专利
申请号 : CN202010813169.4
文献号 : CN111875702B
文献日 : 2021-12-28
发明人 : 韩雅玲 , 闫承慧 , 田孝祥 , 刘丹 , 张效林 , 赵新燕 , 赵晓峰 , 高珍娜 , 罗安德
申请人 : 中国人民解放军北部战区总医院
摘要 :
权利要求 :
1.抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的组合物,其特征在于,其中包括重链可变区和轻链可变区:
(I)所述SIM156‑10的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示;
(II)所述SIM156‑35的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.如权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的组合物,其特征在于,所述的单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35还包括恒定区,所述的恒定区为人IgG1和小鼠IgG1。
3.一种表达载体,其特征在于,包含编码权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑
10和SIM156‑35的组合物。
4.一种宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞经由权利要求3所述的表达载体转化或转染而来,为原核细胞或真核细胞。
5.一种结合物,其特征在于,包括与化学标记物标记供价连接的权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的组合物。
6.一种偶联物,其特征在于,其由权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的组合物和/或权利要求5所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
7.一种药物组合物,其特征在于包括权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的组合物和/或权利要求5所述的结合物和/或权利要求6所述的偶联物。
8.如权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的组合物和/或权利要求5所述的结合物和/或权利要求6所述的偶联物和/或权利要求7所述的药物组合物在制备用于检测血清样本CREG蛋白 ELISA检测试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的制备方法是基于所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35的不同配对方式产生的ELISA检测方法,分别以所述的CREG单克隆抗体SIM156‑10为包被抗体,SIM156‑35为检测抗体;或者以SIM156‑35为包被抗体,以SIM156‑10为检测抗体,制备ELISA检测试剂盒,进行血清样本的检测。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述用于检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的检测范围:以抗体SIM156‑35作为包被抗体、抗体SIM156‑10作为检测抗体的方式,可准确定量的范围为16.2 2000ng/ml;以抗体SIM156‑10作为包被抗体、抗体SIM156‑35作~
为检测抗体,可准确定量的范围为0.438 54ng/ml;所述的血清样本为人、小鼠和食蟹猴的~
血清样本。
说明书 :
抗CREG单克隆抗体及应用
技术领域
背景技术
心血管稳态及代谢稳态的关键基因。在血管疾病中,CREG可以通过调控血管平滑肌细胞的
表型转化参与血管损伤后再狭窄的发生,还可以通过抑制巨噬细胞炎症反应参与血管动脉
粥样硬化的发生发展。在心脏疾病中,CREG可以通过多种机制参与急性心肌梗死、心肌缺血
再灌注损伤、心室重构等多个心脏病理生理过程。在代谢性疾病中,白色脂肪组织或肝细胞
中CREG的表达减低导致小鼠发生明显的肥胖、胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝。由此可见,
CREG在心血管系统及代谢器官的表达变化与心血管疾病及代谢疾病的发生发展密切相关。
CREG蛋白的表达。根据已有的研究证据推测,如果能检测人血清中CREG蛋白的表达水平,将
对心血管及代谢性疾病的诊断、进展及预后判断都可能具有重要意义。发明人所在实验室
曾筛选市售抗体包被CREG ELISA检测试剂盒,但灵敏性过低(检测下限390ng/ml)。目前也
有市售人CREG ELISA检测试剂盒,检测范围在0.45ng/ml‑100ng/ml。由于CREG表达降低和
表达升高都具有重要意义,发明人在既往的结果发现人血清中的CREG可高达1200ng/ml,因
此市售试剂盒存在检测范围过窄的缺陷。而且市售试剂盒提供的抗体大多为免疫动物分离
的多抗,无法进行产,也无法对产品的均一性进行有效的控制,因此难以满足未来的临床需
求。因此,研究和开发检测人血清CREG蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒的制备方法是亟待
解决的问题。
发明内容
细胞方法,得到CREG单克隆抗体;进一步应用BIAcore方法,获得结合CREG蛋白不同表位的
两个抗体。最后采用两种抗体配对方法,制备成功CREGELISA检测试剂盒。所述试剂盒提及
的编码单克隆抗体的氨基酸序列可以通过基因工程技术克隆至表达载体中,并转染至哺乳
动物细胞进行大规模表达,从而实现工业化量产以及质量控制,以满足未来的临床需求。
基酸序列;和/或
氨基酸序列。
的应用。
CREG单克隆抗体SIM156‑10(人Fc)为包被抗体,SIM156‑35(小鼠Fc)为检测抗体;或者以
SIM156‑35(小鼠Fc)为包被抗体,以SIM156‑10(人Fc)为检测抗体,制备ELISA检测试剂盒,
进行血清样本的检测。
ml;以抗体SIM156‑10作为包被抗体、抗体SIM156‑35作为检测抗体,可准确定量的范围为
0.438~54ng/ml。
单克隆抗体;进一步应用BIAcore方法,获得结合CREG蛋白不同表位的两个抗体。最后采用
两种抗体配对方法,制备成功CREGELISA检测试剂盒。所述用于检测血清样本CREG蛋白
ELISA检测试剂盒的检测范围:以抗体SIM156‑35作为包被抗体、抗体SIM156‑10作为检测抗
体的方式,可准确定量的范围为16.2~2000ng/ml;以抗体SIM156‑10作为包被抗体、抗体
SIM156‑35作为检测抗体,可准确定量的范围为0.438~54ng/ml。所述试剂盒提及的编码单
克隆抗体的氨基酸序列可以通过基因工程技术克隆至表达载体中,并转染至哺乳动物细胞
进行大规模表达,从而实现工业化量产以及质量控制,以满足未来的临床需求。
附图说明
具体实施方式
提取出并转染CHO细胞,通过MSX加压筛选,得到稳定表达重组蛋白的Bulk Pool,制备方法
参考专利CN 109053903 A,一种重组人CREG‑Fc融合蛋白的制备及其应用。之后进行表达并
利用Ni Sepharose HP及ProteinG层析柱对上清进行一步纯化,得到人CREG‑His、CREG‑mFc
重组蛋白。
全佐剂(complete freund's adjuvant,CFA,购自SIGMA,货号:F5881)混合人CREG‑His重组
蛋白,后三次免疫注射的佐剂则采用弗氏不完全佐剂(incomplete freund's adjuvant,
IFA,购自SIGMA,货号:F5506)和CpGODN1826(合成自上海生工生物),分别与CREG‑mFc、
CREG‑His混合,交替免疫。特别地,第一次和第二次免疫注射后足垫和背部,第三次和第四
次免疫注射尾部皮下及背部,以获得高滴度的抗血清。在末次免疫(第四次免疫)后的第7
天,安乐死小鼠并无菌取出脾脏,无菌分离提取小鼠脾脏淋巴细胞,分装冻存于液氮中。如
图1所示,经CREG‑mFc/His蛋白免疫后获得了高滴度高特异性的抗CREG血清。将免疫后小鼠
的脾脏或淋巴结中的CREG特异的单个B细胞用BD AriaIII流式分选仪分选至96孔板中,将
单细胞的mRNA反转录成cDNA。然后以cDNA为模板进行巢式PCR,分别进行抗体重链和轻链扩
增。扩增得到抗体重链可变区和轻链可变区,分别通过同源重组方法克隆到重链表达载体
和轻链表达载体。重链表达载体的恒定区来源于人IgG1和小鼠IgG1。
所需要的时间,以使得能饱和结合抗原Rmax为50RU。将人CREG‑His梯度稀释至32、16、8、4、
2nM。采用多循环动力学测得抗体与抗原的亲和力。在每一个循环中,注射抗体后再注入梯
度浓度的CREG蛋白,使抗原与抗体发生结合与解离过程。每个循环后用Glycine‑HCl pH1.5
进行ProteinA芯片的再生。应用BIAcore T200分析软件拟合抗体抗原的亲和力KD。BIAcore
检测结果见表1,实施例2获得的10个抗CREG抗体与人CREG‑His蛋白之间存在特异性结合,
且亲和力水平较高。
Ab和其他抗体的注射顺序。通过对比分析base Ab和其他抗体在两种情况下与人CREG‑His
的结合信号是否存在差别,判断抗体之间在人CREG蛋白上的binding epitope的关系。具体
在每个循环中,所有抗体均采用300nM的浓度,注射180s,使用650mM HCl溶液进行再生。
信息见表3及4。其中表3为候选抗体分子的VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)序列,表4为
侯选抗体分子的IMGT分析结果。
体SIM156‑35作为包被抗体,抗体SIM156‑10作为检测抗体。
稀释至2μg/ml,后续3.33倍梯度,共11个浓度点;封闭后的酶标板洗板后,按50μl/孔加入稀
释后的人CREG‑His,50μl/孔2μg/ml的抗体SIM156‑35,400rpm室温共孵育2h。洗板后加入羊
抗鼠(goat anti mouse)IgG Fc‑HRP工作液(1:10000稀释),100μl/孔,400rpm室温孵育1h;
再次洗板,加入HRP的底物TMB进行显色,加入终止液终止反应后用酶标仪读取吸光值。图4
为11个浓度点的标准曲线拟合图,图5为可准确定量的标准曲线拟合图。表5数据表明,抗体
SIM156‑10作为包被抗体、抗体SIM156‑35作为检测抗体,可准确定量的范围为0.438~
54ng/ml。
稀释至2μg/ml,后续3.33倍梯度,共10个浓度点;封闭后的酶标板洗板后,按50μl/孔加入稀
释后的人CREG‑His,50μl/孔2μg/ml的抗体SIM156‑10,400rpm室温共孵育2h。洗板后加入鼠
抗人(mouse anti human)IgG Fc‑HRP工作液(1:10000稀释),100μl/孔,400rpm室温孵育
1h;再次洗板,加入HRP的底物TMB进行显色,加入终止液终止反应后用酶标仪读取吸光值。
图7为10个浓度点的标准曲线拟合图,图8为可准确定量的标准曲线拟合图。表6数据表明,
抗体SIM156‑35作为包被抗体、抗体SIM156‑10作为检测抗体的方式,可准确定量的范围为
16.2~2000ng/ml。
体、抗体SIM156‑10作为检测抗体的配对方式,检测的范围更宽,检测的上限可达到2000ng/
ml。
质背景的标准曲线,测定10个健康个体的血清CREG本底值,测定结果见表7,10个个体血清
稀释10倍后,除M17本底值低于定量下限0.438ng/ml外,其余均落在标曲可定量范围内。后
续选用M17作为血清基质,用于配制标准曲线,血清含量为10%。
景的标准曲线,并确定其可准确定量的线性范围。基质:含10%M17血清的稀释液。采用实施
例5中的方式(1)。具体实验步骤同实施例5方式(1)。标准曲线拟合如图8所示,其可准确定
量的线性范围为0.438~54ng/ml,见表8和表9。
2 SIM156‑10 SIM156‑35 0.438~54.02ng/ml 1 ≤±15%
CREG本底值均较高,且高于健康人的本底值。提示该试剂盒抗体可能与小鼠及食蟹猴种属
的CREG有交叉反应,其应用范围可能扩展至小鼠及食蟹猴的动物实验中。
浓度(ng/ml) 1.3 7.6 18.6