等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒及其应用

摘要

本申请公开了一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒和检测方法。所述试剂包括用于检测田鼠巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组、用于检测分歧巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组、用于检测猎户巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组、用于检测邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组。所述试剂盒包括所述试剂。所述试剂和试剂盒用于检测4种巴贝虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高，还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断。

权利要求

1.一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂，其特征在于，所述试剂同时包括如下用于检测田鼠巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6；

用于检测分歧巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：第三外引物SEQ ID No.7、第四外引物SEQ ID No.8、第三内引物SEQ ID No.9、第四内引物SEQ ID No.10、第三环引物SEQ ID No.11、第四环引物SEQ ID No.12；

用于检测猎户巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：第五外引物SEQ ID No.13、第六外引物SEQ ID No.14、第五内引物SEQ ID No.15、第六内引物SEQ ID No.16、第五环引物SEQ ID No.17、第六环引物SEQ ID No.18；

用于检测邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：第七外引物SEQ ID No.19、第八外引物SEQ ID No.20、第七内引物SEQ ID No.21、第八内引物SEQ ID No.22、第七环引物SEQ ID No.23、第八环引物SEQ ID No.24。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：

聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述聚合酶为Bst聚合酶；所述pH染料为间甲酚紫；所述等温扩增缓冲液包括KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs和无核酸酶水。

4.一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一所述的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取耗材、阳性质控品和阴性质控品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸提取耗材包括核酸提取液和用于核酸提取的器件；其中，

所述核酸提取液包括样品处理液、裂解液、清洗液和洗脱液；

所述器件包括取液器、核酸裂解容器和核酸富集器；

所述阳性质控品为田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的核酸模板；

所述阴性质控品为无核酸酶水。

7.根据权利要求4‑6任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第三外引物SEQ ID No.7、第四外引物SEQ ID No.8、第五外引物SEQ ID No.13、第六外引物SEQ ID No.14、第七外引物SEQ ID No.19、第八外引物SEQ ID No.20的使用浓度均为1.8μM；

所述第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第三内引物SEQ ID No.9、第四内引物SEQ ID No.10、第五内引物SEQ ID No.15、第六内引物SEQ ID No.16、第七内引物SEQ ID No.21、第八内引物SEQ ID No.22的使用浓度均为57.6μM；

所述第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6、第三环引物SEQ ID No.11、第四环引物SEQ ID No.12、第五环引物SEQ ID No.17、第六环引物SEQ ID No.18、第七环引物SEQ ID No.23、第八环引物SEQ ID No.24的使用浓度均为20μM。

说明书

等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本申请属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 巴贝虫病是一种由真核寄生虫巴贝虫感染引起的疟疾样寄生虫病。人们可以通过被感染的蜱虫叮咬，从被感染的血液制品供体中输血或通过先天性传播(被感染的母亲到
婴儿)感染巴贝虫寄生虫。继锥虫病之后，巴贝虫病被认为是哺乳动物的第二常见血液寄生
虫，并且巴贝虫病可能对家畜的健康产生更重大的影响。人们对疟疾流行地区的巴贝虫种
的了解甚少，在那里巴贝虫很容易被误诊为疟原虫。

[0003] 目前只有专业实验室才能充分诊断出人类中的巴贝虫感染，因此，人们对巴贝虫感染的报道很少。通过血膜上的所谓“马耳他十字形状”来判断巴贝虫病的诊断(病理学)，
这是主要的鉴别诊断。并且，有可能需要仔细检查多个涂片，因为巴贝虫病可能感染不到
1％的循环红细胞，因此很容易被忽视。

[0004] 在临床高度怀疑，但血膜检查阴性的情况下，针对巴贝虫的抗体(IgG和IgM)进行血清学检测可以检测到低水平的感染。在人们有4种感染风险的情况下，血清学还可用于区
分巴贝虫病和疟疾。由于可检测到的抗体反应需要在感染后大约一周后开展，因此血清学
检测在疾病过程的早期可能会假阴性。

[0005] 已开发出一种聚合酶链反应(PCR)测试来检测外周血中的巴贝虫病。PCR在诊断巴贝斯病中可能至少与血膜检查一样灵敏和特异性，尽管它也要昂贵得多。最常见的是，PCR
检测与血膜检查或者其他可能的血清学检测方法进行结合使用。但目前PCR是荧光染料，其
检测的通病就是需要专业人员操作和专业昂贵仪器。

[0006] 另外，现有待测样品核酸的需要移液器、枪头、离心机、恒温金属浴和PCR仪等昂贵且不便于携带的仪器，且提取需要专业人士进行专业操作，这直接导致现有样本核酸提取
和PCR检测不方便，且需要专业人员操作，且成本高。

发明内容

[0007] 本申请的目的在于提供一种检测等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒以及其应用，旨在解决现有技术荧光PCR检测方法操作需要专业操作，而且成本高，检测不方便的
技术问题。

[0008] 为了实现本发明的发明目的，本发明的一方面，提供了一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂。所述等温扩增检测4种巴贝虫的试剂包括如下用于检测田鼠巴贝虫的环介导等
温核酸扩增引物组：

[0009] 第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6；

[0010] 用于检测分歧巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0011] 第三外引物SEQ ID No.7、第四外引物SEQ ID No.8、第三内引物SEQ ID No.9、第四内引物SEQ ID No.10、第三环引物SEQ ID No.11、第四环引物SEQ ID No.12；

[0012] 用于检测猎户巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0013] 第五外引物SEQ ID No.13、第六外引物SEQ ID No.14、第五内引物SEQ ID No.15、第六内引物SEQ ID No.16、第五环引物SEQ ID No.17、第六环引物SEQ ID No.18；

[0014] 用于检测邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0015] 第七外引物SEQ ID No.19、第八外引物SEQ ID No.20、第七内引物SEQ ID No.21、第八内引物SEQ ID No.22、第七环引物SEQ ID No.23、第八环引物SEQ ID No.24。

[0016] 优选地，所述等温扩增检测4种巴贝虫的试剂还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：

[0017] 聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。

[0018] 本发明的另一方面，提供了一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂盒。所述等温扩增检测4种巴贝虫的试剂盒包括本发明等温扩增检测4种巴贝虫的试剂。

[0019] 本发明的再一方面，提供了一种检测4种巴贝虫的方法。所述检测4种巴贝虫的方法包括如下步骤：

[0020] 获取待检测样品的核酸；

[0021] 将所述待测样本核酸与本发明试剂或本发明试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；

[0022] 根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。

[0023] 与现有技术相比，本发明等温扩增检测4种巴贝虫的试剂同时含有田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组，4种环介导等温
核酸扩增引物组之间不会产生非特异的扩增，特异性强，从而使得本发明试剂用于检测4种
巴贝虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，4种环介导等温核酸
扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩
增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，从而使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直
接进行结果判断以简易快速检测4种巴贝虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临
场检测能力。

[0024] 优选地，本发明试剂还包括聚合酶、pH染料等可视化恒温扩增试剂时，其与所述环介导等温核酸扩增引物组构成扩增反应体系，用于检测4种巴贝虫在具有灵敏度高，重复性
好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜色变化而直接进
行结果判断，使得检测4种巴贝虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得检测4种巴贝虫的
方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

[0025] 本发明等温扩增检测4种巴贝虫的试剂盒由于采用本发明等温扩增检测4种巴贝虫的试剂，因此，所述试剂盒用于检测4种巴贝虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，
检测准确率高。同时，4种环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，从而使得所
述试剂能够简易快速检测4种巴贝虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测
能力。当所述试剂盒含有本发明可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸眼
观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用所述试剂盒检测4种巴贝虫时不用依赖专业
人员、专业仪器，进一步使得所述试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能
力。

[0026] 本发明检测4种巴贝虫的方法由于是利用本发明试剂盒进行检测，因此，所述检测4种巴贝虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。优选的当本发明
试剂盒含有本发明可视化恒温扩增试剂时，所述检测4种巴贝虫的方法不需要依赖专业人
员、专业仪器，直接用裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得本
发明检测4种巴贝虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。

附图说明

[0027] 为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些
实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附
图获得其他的附图。

[0028] 图1为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫阳性质控品和无核酸酶水阴性质控品以田鼠巴贝虫的检测引物组的LAMP扩增扩增结果显色照片；其中，1‑6号孔为
田鼠巴贝虫阳性质控品扩增体系最终显色照片；7‑8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体
系最终显色照片；

[0029] 图2为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫的阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度和无核
酸酶水阴性质控品以田鼠巴贝虫检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；其中，1‑2号孔为
1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终显
色照片；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；7‑8号孔为无核酸酶水阴性质
控品扩增体系最终显色照片；

[0030] 图3为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的分歧巴贝虫的阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度和无核
酸酶水阴性质控品以分歧巴贝虫检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；其中，1‑2号孔为
1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终显
色照片；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；7‑8号孔为无核酸酶水阴性质
控品扩增体系最终显色照片；

[0031] 图4为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的猎户(维氏)巴贝虫的阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度
和无核酸酶水阴性质控品以猎户(维氏)巴贝虫检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；其
中，1‑2号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩
增体系最终显色照片；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；7‑8号孔为无核
酸酶水阴性质控品扩增体系最终显色照片；

[0032] 图5为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的邓氏巴贝虫的阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度和无核
酸酶水阴性质控品以邓氏巴贝虫检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；其中，1‑2号孔为
1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终显
色照片；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；7‑8号孔为无核酸酶水阴性质
控品扩增体系最终显色照片；

[0033] 图6为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“无核酸酶水”的结果显色照片；其中，1
号田鼠巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为分歧巴贝虫的LAMP引物
LAMP扩增体系最终显色照片；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显
色照片；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；

[0034] 图7为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“田鼠巴贝虫的阳性质控品”的结果显色
照片；其中，1号田鼠巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为分歧巴贝虫的
LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体
系最终显色照片；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；

[0035] 图8为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“分歧巴贝虫的阳性质控品”的结果显色
照片；其中，1号田鼠巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为分歧巴贝虫的
LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体
系最终显色照片；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；

[0036] 图9为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“猎户(维氏)巴贝虫的阳性质控品”的结
果显色照片；其中，1号田鼠巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为分歧巴
贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP
扩增体系最终显色照片；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；

[0037] 图10为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“邓氏巴贝虫的阳性质控品”的结果显色
照片；其中，1号田鼠巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为分歧巴贝虫的
LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体
系最终显色照片；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片。

具体实施方式

[0038] 为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释
本申请，并不用于限定本申请。

[0039] 本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数
或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

[0040] 本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任
意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表
示：a,b,c,a‑b(即a和b),a‑c,b‑c,或a‑b‑c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

[0041] 应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内
在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

[0042] 在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包
括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

[0043] 本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组
分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实
施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

[0044] 术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请
实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。
由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

[0045] 本发明涉及的专业名称说明：

[0046] 环介导等温核酸扩增技术：(loop‑mediated isotherm amplification，LAMP)是等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和多对特
异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。

[0047] 一方面，本发明实施例提供了一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂(下文均简称为试剂)。所述试剂包括根据4种巴贝虫靶基因设计的引物序列。4种所述利什曼原虫包括田鼠
巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫。因此，所述试剂包括分别用于田鼠
巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组。

[0048] 其中，所述试剂包括如下用于检测田鼠巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0049] 第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6；

[0050] 用于检测分歧巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0051] 第三外引物SEQ ID No.7、第四外引物SEQ ID No.8、第三内引物SEQ ID No.9、第四内引物SEQ ID No.10、第三环引物SEQ ID No.11、第四环引物SEQ ID No.12；

[0052] 用于检测猎户巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0053] 第五外引物SEQ ID No.13、第六外引物SEQ ID No.14、第五内引物SEQ ID No.15、第六内引物SEQ ID No.16、第五环引物SEQ ID No.17、第六环引物SEQ ID No.18；

[0054] 用于检测邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组：

[0055] 第七外引物SEQ ID No.19、第八外引物SEQ ID No.20、第七内引物SEQ ID No.21、第八内引物SEQ ID No.22、第七环引物SEQ ID No.23、第八环引物SEQ ID No.24。

[0056] 这样本发明实施例所述试剂同时含有田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组，4种环介导等温核酸扩增引物组之间不会
产生非特异的扩增，特异性强，从而使得本发明实施例所述试剂用于检测4种巴贝虫灵敏度
高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，4种环介导等温核酸扩增引物组具
有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环
介导等温核酸扩增体系，从而使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判
断以简易快速检测两种利什曼原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测
能力。

[0057] 另外，上述用于检测田鼠巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组是根据田鼠巴贝虫靶基因设计的，所述田鼠巴贝虫靶基因可以根据基因资源获得。同理，上述用于检测分歧巴
贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组是分别根据分歧巴贝
虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫靶基因分别设计的，所述分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝
虫和邓氏巴贝虫靶基因可以根据基因资源获得。如在一实施例中，所述田鼠巴贝虫、分歧巴
贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的靶基因可以均为18s基因，18s基因全长在1800bp
左右，具体可以从GenBank上直接获取。其中，田鼠巴贝虫引物设计区域在该基因的1201‑
1784bp之间；分歧巴贝虫引物设计区域在该基因的322‑1164bp之间；猎户(维氏)巴贝虫引
物设计区域在该基因的1‑675bp之间；邓氏巴贝虫引物设计区域在该基因的1‑900bp之间。

[0058] 因此，在一实施例中，所述田鼠巴贝虫的靶序列18s基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.25所示。用于检测田鼠巴贝虫的所述环介导等温核酸扩增引物组是以SEQ ID 
No.25所示序列区域内进行设计的；

[0059] 所述分歧巴贝虫的靶序列18s基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.26所示。用于检测分歧巴贝虫的所述环介导等温核酸扩增引物组是以SEQ ID No.26所示序列区域内
进行设计的；

[0060] 所述猎户(维氏)巴贝虫的靶序列18s基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.27所示。用于检测猎户(维氏)巴贝虫的所述环介导等温核酸扩增引物组是以SEQ ID No.27所示
序列区域内进行设计的；

[0061] 所述邓氏巴贝虫的靶序列18s基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.28所示。用于检测邓氏巴贝虫的所述环介导等温核酸扩增引物组是以SEQ ID No.28所示序列区域内
进行设计的；

[0062] 上文所述SEQ ID No.1至SEQ ID No.28的具体序列如下表1所示：

[0063] 表1

[0064]

[0065]

[0066]

[0067] 在进一步实施例中，本发明实施例所述试剂还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：

[0068] 聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。

[0069] 由于本发明实施例所述试剂含有上述环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.24。因此，当本发明实施例所述试剂采用LAMP进行扩增时，其LAMP扩增反应过程
+
中会释放出大量的H ，致使LAMP扩增反应体系的pH值发生变化。本发明实施例所述试剂所
含的pH染料会根据LAMP扩增反应体系的pH值发生颜色变化。因此，所述可视化恒温扩增试
剂与所述环介导等温核酸扩增引物组构成扩增反应体系，在实现检测4种巴贝虫在具有灵
敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜
色变化而直接进行结果判断，使得检测4种巴贝虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得
检测4种巴贝虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。从而避免传统的采用荧
光PCR检测需要专业的人员和专业仪器从而导致检测受条件限制而不便利和成本高的问
题。

[0070] 在具体实施例中，所述pH染料为间甲酚紫。这样，间甲酚紫作为结果显示剂能够根据PCR扩增反应体系的pH值的变化灵活发生颜色变化，提高检测的准确性和灵敏度，而且提
高结果判断的便捷性和快速性。

[0071] 在另具体实施例中，所述聚合酶为Bst聚合酶。该Bst聚合酶能够有效促进上文所述环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.24的LAMP扩增，并使得所述pH染
料快速灵活发生显色反应，以便于可以用裸眼直接判断结果。

[0072] 所述等温扩增缓冲液包括LAMP扩增所需的组分，所述一实施例中，所述等温扩增缓冲液包括KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs和无核酸酶水(如无菌水)等组分。该等温扩增缓冲液
与聚合酶、pH染料等组分构成可视化恒温扩增试剂，有效提高了本发明实施例试剂所含环
介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.11的LAMP扩增的稳定性。

[0073] 本发明实施例试剂同时含有田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组，4种环介导等温核酸扩增引物组之间不会产生非特
异的扩增，特异性强。当进一步含有可视化恒温扩增试剂时，实现检测4种巴贝虫在具有灵
敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜
色变化而直接进行结果判断，使得检测4种巴贝虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得
检测4种巴贝虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。有效避免传统PCR检测
需要荧光探针与荧光染料，而且还需专业人员、专业仪器进行而导致检测临场检测性差，而
且成本高的不足。

[0074] 另一方面，基于上文所述等温扩增检测4种巴贝虫的试剂，本发明实施例还提供了一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂盒(下文统称试剂盒)。本发明实施例试剂盒包括上文
所述的本发明实施例试剂。具体的如包括如上文所述的用于检测田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、
猎户巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组。

[0075] 进一步优选的还包括含有如上文所述聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液的可视化恒温扩增试剂。

[0076] 这样，本发明实施例试剂盒由于采用本发明等温扩增检测4种巴贝虫的试剂，因此，所述试剂盒用于检测4种巴贝虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率
高。优选当所述试剂盒含有本发明可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸
眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用所述试剂盒检测4种巴贝虫时不用依赖专
业人员、专业仪器，进一步使得所述试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能
力。

[0077] 在进一步实施例中，本发明实施例试剂盒还可以增设包括核酸提取耗材、阳性质控品，阴性质控品中的至少一种。

[0078] 其中，增设所述核酸提取耗材以配合本发明实施例试剂盒所含的环介导等温核酸扩增引物组或进一步所包含的可视化恒温扩增试剂，以提高本发明实施例试剂盒的操作的
便捷性。在一实施例中，所述核酸提取耗材包括核酸提取液和/或用于核酸提取的器件；其
中，所述核酸提取液包括处理液、裂解液、清洗液、洗脱液中的至少一种；所述器件包括取液
器、核酸裂解容器、核酸富集器中的至少一种。

[0079] 在具体实施例中，所述核酸富集器包括硅胶膜和富集器壳体，所述富集器壳体设有液体进入口，在所述富集器壳体内且在液体进入通道上开设有一凹槽，所述硅胶膜填设
于所述凹槽内。所述核酸富集器在使用时，将所述富集器壳体设有液体进入口连接所述取
液器的液体出口。

[0080] 在具体实施例中，洗脱液可以是无核酸酶水，核酸裂解容器可以是裂解管，取液器可以是螺旋口活塞注射器。

[0081] 通过在本发明实施例试剂盒中设置核酸提取耗材，从而降低核酸提取的专业要求，使得本发明实施例试剂盒操作的便利性，可在实现在无专业人员和无专业设备的情况
下，实现现场完成对样本的核酸提取。

[0082] 所述阳性质控品可以是4种巴贝虫核酸样本，其环介导等温扩增(LAMP)的模板。所述阴性质控品可以是无核酸酶水，当然也可以是无菌水，如DEPC水。所述清洗液可以是常用
的核酸清洗液。

[0083] 因此，在一实施例中，所述本发明实施例试剂盒可以按照如下表2中的规格进行配备个试剂：

[0084] 表2

[0085]

[0086]

[0087] 因此，上文本发明实施例试剂盒由于采用本发明实施例试剂或进一步配设可视化恒温扩增试剂，使得所述试剂盒用于检测4种巴贝虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性
低，检测准确率高。优选的当所述试剂盒含有可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实
现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，有效避免传统PCR检测需要荧光探针与荧
光染料，使得使用所述试剂盒检测4种巴贝虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得
所述试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

[0088] 基于上文所述本发明实施例试剂和本发明实施例试剂盒，本发明实施例还提供了一种本发明实施例还提供了一种检测4种巴贝虫的方法。所述检测4种巴贝虫的方法包括如
下步骤：

[0089] S01：提取待测样本核酸；

[0090] S02：将所述待测样本核酸与上文本发明实施例试剂盒提供的本发明实施例试剂进行混合并进行LAMP处理；

[0091] S03：根据所述LAMP处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。

[0092] 其中，上述步骤S01中用于提取待测样本核酸的待测样本可以是脱离人体物，如全血、血浆或血清等，还可以是食用原料、食品，还可以设计公共卫生安全的使用物品等。也即
是说，该步骤S01中待测样本还可以是为卫生安全为目的样品为来源，即非仅仅以疾病判断
为目标的来源。提取方式可以按照本领域核酸常规提取方式即可。

[0093] 在发明实施例中，可以直接用本发明实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取。具体的采用本发明实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取核酸的方法可以按照如
下步骤进行如下实施例中的核酸提取方法进行自行提取。这样可以实现在非专业人员和非
专业设备的条件下实现快速提取待测样本核酸。

[0094] 上述步骤S02中，将所述待测样本核酸与上文本发明实施例试剂盒提供的本发明实施例试剂混合处理后，形成LAMP扩增体系。具体可以按照上文表2中的LAMP扩增试剂来配
制LAMP扩增体系。在一实施例中，所述LAMP处理的温度优选设定为60℃‑70℃，具体如65℃，
时间应该是充分的，如为50min。由于所述LAMP处理是等温扩增，因此所述LAMP处理的温度
可以采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持一段时间的设备来提供，从而显著的
降低了检测4种巴贝虫的方法的非专业检测人员和非专业设备的要求。

[0095] 上述步骤S03中，由于在步骤S02中LAMP扩增体系含有可视化的pH染料，因此，待所述LAMP处理结束后，所述LAMP扩增体系的颜色会显示一定的颜色。从而根据取待测样本核
酸最终LAMP扩增体系显示的颜色，与含质控品核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色比较，从
而直接用裸眼判断待测样本中是否含有利什曼原虫。

[0096] 因此，所述检测4种巴贝虫的方法利用本发明试剂盒进行检测，使得所述检测4种巴贝虫的方法灵敏度高，重复性好，假阴性及假阳性低，检测准确率高。且所述检测4种巴贝
虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察LAMP扩增反应体系的颜色变化
而直接进行结果判断，使得所述检测4种巴贝虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检
测性。

[0097] 下面结合具体实施例进行说明。

[0098] 实施例

[0099] 本实施例提供了一种等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒和利用所述试剂盒检测4种巴贝虫的方法。

[0100] 试剂盒包括如下试剂和核酸提取耗材：

[0101] 试剂包括用于检测田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组以及可视化恒温扩增试剂，其中各所述环介导等温核酸扩增引
物组和可视化恒温扩增试剂的规格如上文表2中所示。

[0102] 所述核酸提取耗材：包括提取试剂、菌吸管、核酸富集器；其中，提取试剂包括样品处理液、核酸裂解液、清洗液、核酸洗脱液(无核酸酶水)；

[0103] 核酸富集器为自组装耗材，是用打孔器将硅胶膜进行剪裁成规则的圆形结构，装入富集器壳体内，该富集器壳体内中间位置为凹槽，将裁剪好的硅胶膜装入凹槽内，组成核
酸富集器。

[0104] 螺口活塞注射器：5ml、1ml的螺口活塞注射器。

[0105] 其中，所述检测4种巴贝虫的方法包括如下步骤：

[0106] S11.样品核酸的提取方法

[0107] 待检测样品：全血3份；血浆3份；血清3份；

[0108] 样本前处理：分别用1ml吸管吸取待检测样品200μL‑1000μL到处理管中(含有处理液)，充分混匀室温放置5min，进行第一次的裂解；

[0109] 样本裂解：将处理后的全血样本转入装有裂解液的裂解管中混匀(裂解液体积为0.6ml)，56℃孵育10‑15min充分裂解；

[0110] 核酸吸附及清洗：分别待经裂解处理后的待检测样品冷却至室温，分别加入1.4ml 95％乙醇混匀，用一次性核酸提取装置缓慢吸取裂解后的全血样本，全部吸入5ml注射器，
然后缓慢推弃(不反复推吸)；注意：使用前不可将核酸富集器从5ml注射器前端取下；取2ml
清洗液至2ml离心管中，用一次性核酸提取装置缓慢吸取全部液体，再缓慢推弃(不反复推
吸)；注意：操作前请确认清晰液已加入响应体己的95％乙醇；缓慢推戏注射器活塞5次，充
分去除残留的液体；

[0111] 核酸洗脱：取下与核酸富集器连接的5ml注射器，更换为1ml注射器。用1ml注射器缓慢吸取洗脱液；缓慢推吸1次，将1ml注射器静置1分钟，再推出洗脱的核酸到检测管中，或
推出洗脱的核酸到0.6ml离心管中保存，‑20℃保存，分别得到全血、血浆、血清核酸，用于后
续的检测。

[0112] S12.可视化检测体系的建立

[0113] (1)可视化LAMP扩增试剂的配制：

[0114] 1μl的8U/μl的Bst聚合酶；0.2μl的1M KCL；0.4μl的0.4M MgSO4；0.2μl的10％吐温20；1.12μl的25mM dNTPs；5.52μl的无菌水；0.16μl的50mM可视化pH染料，用无核酸酶水至
20μL体系。其中，pH染料为间甲酚紫。

[0115] (2)环介导等温核酸扩增引物组的建立

[0116] 根据GenBank上收录的田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫各自的18s靶基因序列，分别进行收集。筛选保守区域(能有效区分田鼠巴贝虫、分歧巴贝
虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫)，确定序列状态，并进行比较和筛选确定最终如上文
表1中的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24。具体的根据上文表1中SEQ ID NO:25设计上文用于
检测田鼠巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6；根据上文表1
中SEQ ID NO:26设计上文用于检测分歧巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID NO:7
至SEQ ID NO:12。根据上文表1中SEQ ID NO:27设计上文用于检测猎户(维氏)巴贝虫的环
介导等温核酸扩增引物组SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:18。根据上文表1中SEQ ID NO:28设
计上文用于检测邓氏巴贝虫的环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:24。

[0117] (3)可视化LAMP扩增体系的具体配制为：

[0118] 0.3mM的外引物F3和外引物B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和内引物BIP各0.48μL；1mM的环引物LF和环引物LB各0.4μL；步骤(1)中配制的可视化LAMP扩增试剂的配制10μL
(含染料与Bst酶)；加灭菌纯化水至20μL体系。

[0119] (4)LAMP扩增

[0120] 所述等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。

[0121] 待田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫核酸的阳性质控品、检测样品、无核酸酶水阴性质控品分别与(1)可视化LAMP扩增试剂按照(3)可视化LAMP扩增
体系构建方法分别构件可视化LAMP扩增体系并进行LAMP扩增。

[0122] 采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持1‑2h的设备进行LAMP扩增，反应时间为50min，结束后观察颜色变化。

[0123] (5)判定环介导等温扩增反应结果的原则：

[0124] a.若LAMP扩增体系最终出现黄绿色，判定测试结果为阳性；

[0125] b.若出现紫色(颜色不变)，判定测试结果为阴性。

[0126] c.对其他种类的巴贝斯虫或其他物种，在反应的50分钟(min)时间内未检测出(颜色不变)，显示为阴性反应。

[0127] (6)LAMP扩增结果

[0128] a.质控品的检测结果：

[0129] 田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的核酸阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如下表3所示。

[0130] 表3

[0131]

[0132] 其中，田鼠巴贝虫阳性质控品(浓度为100copies/μl)和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增(所用的LAMP引物为田鼠巴贝虫的检测引物组)结果如图1所示，图1中的1‑6号孔
为田鼠巴贝虫阳性质控品扩增体系最终颜色为黄绿色；7‑8号孔为无核酸酶水阴性质控品
扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0133] 田鼠巴贝虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为田鼠巴贝虫的检测引物
组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图2所示。图2中的1‑2号孔为1000拷
贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色
为黄绿色；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；7‑8号孔为无核酸酶
水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0134] 分歧巴贝虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时，其浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为分歧巴贝虫的检测
引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图3所示。图3中的1‑2号孔为1000
拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜
色为黄绿色；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色和淡洋紫色；7‑8号孔
为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0135] 猎户(维氏)巴贝虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时，其浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为猎户
(维氏)巴贝虫的检测引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图4所示。图
4中的1‑2号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；3‑4号孔为100拷贝/μL浓
度的扩增体系最终颜色为黄绿色；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫
色；7‑8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0136] 邓氏巴贝虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时，其浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为邓氏巴贝虫的检测
引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图5所示。图5中的1‑2号孔为1000
拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；3‑4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜
色为黄绿色；5‑6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；7‑8号孔为无核酸
酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色；

[0137] 田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“无核酸酶水”的结果如图6所示，图6中的1号田鼠巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最
终颜色为洋紫色；2号孔为分歧巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；3号孔
为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；4号孔为邓氏巴贝虫的
LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0138] 田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增“田鼠巴贝虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果如图7所示，图7中的1号田鼠巴贝虫的
LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色；2号孔为分歧巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系
最终颜色为洋紫色；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫
色；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0139] 田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增“分歧巴贝虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果如图8所示，图8中的1号田鼠巴贝虫的
LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；2号孔为分歧巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系
最终颜色为黄绿色；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫
色；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0140] 田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增“猎户(维氏)巴贝虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果如图9所示，图9中的1号田鼠巴
贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；2号孔为分歧巴贝虫的LAMP引物LAMP扩
增体系最终颜色为洋紫色；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色
为黄绿色；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。

[0141] 田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增“邓氏巴贝虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果如图10所示，图10中的1号田鼠巴贝虫
的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；2号孔为分歧巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体
系最终颜色为洋紫色；3号孔为猎户(维氏)巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋
紫色；4号孔为邓氏巴贝虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色。

[0142] 对于田鼠巴贝虫、分歧巴贝虫、猎户(维氏)巴贝虫和邓氏巴贝虫的LAMP引物分别LAMP扩增“全血、血浆、血清核酸待测样品”的结果如下表4所示。

[0143] 表4

[0144]

[0145] 以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。