一种广谱型微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒转让专利
申请号 : CN202010823099.0
文献号 : CN111912986B
文献日 : 2021-11-09
发明人 : 周小红
申请人 : 清华大学
摘要 :
权利要求 :
1.微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒,包括包被抗原、微囊藻毒素单克隆抗体溶液以及酶标二抗;
所述包被抗原由下述12种抗原组成:NH2‑MC‑LR‑BSA、NH2‑MC‑RR‑BSA、NH2‑MC‑YR‑BSA、NH2‑MC‑LA‑BSA、NH2‑MC‑LF‑BSA、 NH2‑MC‑LW‑BSA、NH2‑MC‑LY‑BSA、NH2‑MC‑WR‑BSA、NH2‑MC‑HtyR‑BSA、NH2‑MC‑HilR‑BSA、NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA;其中所述NH2‑MC‑LR‑BSA为氨基修饰的MC‑LR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑RR‑BSA为氨基修饰的MC‑RR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑YR‑BSA为氨基修饰的MC‑YR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LA‑BSA为氨基修饰的MC‑LA与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LF‑BSA为氨基修饰的MC‑LF与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LW‑BSA为氨基修饰的MC‑LW与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LY‑BSA为氨基修饰的MC‑LY与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑WR‑BSA为氨基修饰的MC‑WR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑HtyR‑BSA为氨基修饰的MC‑HtyR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑HilR‑BSA为氨基修饰的MC‑HilR与BSA偶联物;所述NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑LR与BSA偶联物;所述NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑RR与BSA偶联物;
所述微囊藻毒素单克隆抗体是以抗原A为免疫原得到的抗体;所述抗原A由NH2‑MC‑LR‑KLH、NH2‑MC‑RR‑KLH、NH2‑MC‑YR‑KLH、NH2‑MC‑LA‑KLH、NH2‑MC‑LF‑KLH、 NH2‑MC‑LW‑KLH、NH2‑MC‑LY‑KLH、NH2‑MC‑WR‑KLH、NH2‑MC‑HtyR‑KLH、NH2‑MC‑HilR‑KLH、NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑KLH和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑KLH组成;其中所述NH2‑MC‑LR‑KLH为氨基修饰的MC‑LR与KLH偶联物;
所述NH2‑MC‑RR‑KLH为氨基修饰的MC‑RR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑YR‑KLH为氨基修饰的MC‑YR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LA‑KLH为氨基修饰的MC‑LA与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LF‑KLH为氨基修饰的MC‑LF与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LW‑KLH为氨基修饰的MC‑LW与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LY‑KLH为氨基修饰的MC‑LY与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑WR‑KLH为氨基修饰的MC‑WR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑HtyR‑KLH为氨基修饰的MC‑HtyR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑HilR‑KLH为氨基修饰的MC‑HilR与KLH偶联物;所述NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑KLH为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑LR与KLH偶联物;所述NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑KLH为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑RR与KLH偶联物;所述微囊藻毒素单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.19194的杂交瘤细胞株MCAB1产生的单克隆抗体,所述微囊藻毒素单克隆抗体溶液是将所述微囊藻毒素单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释,再加入牛血清白蛋白和硫柳汞得到的液体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述包被抗原由所述12种抗原等质量组合得到。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述微囊藻毒素单克隆抗体按照下述方法制备:用所述抗原A免疫小鼠,取免疫小鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性杂交瘤细胞株;培养所述阳性杂交瘤细胞株或将所述阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水,得到微囊藻毒素单克隆抗体。
4.根据权利要求1‑3任一所述的试剂盒,其特征在于:抗体溶液中,单克隆抗体的含量为0.0625μg/mL,BSA的质量百分含量为1%,硫柳汞的质量百分含量为0.1%。
5.根据权利要求4中所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括微囊藻毒素‑LR标准品溶液、显色剂、样品稀释液、终止液和洗涤液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:所述样品稀释液为含有吐温‑20和明胶的磷酸盐缓冲液,其中吐温‑20的体积百分含量为0.1%,明胶的质量百分含量为0.1%。
7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:所述洗涤液为含0.05%吐温‑20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。
8.权利要求1至7中任一所述的试剂盒在微囊藻毒素总量检测中的应用。
说明书 :
一种广谱型微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒
技术领域
背景技术
的小分子,由5个非蛋白原氨基酸(如脱氢丙氨酸衍生物和特殊的β‑氨基酸 Adda等)和2个
蛋白原氨基酸(第2位和第4位的可变氨基酸)组成,其化学结构式如式1所示。到目前为止已
有超过100个微囊藻毒素异构体被报道,自然界中分布较广的MC异构体为MC‑LR、MC‑RR和
MC‑YR(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。
十分迫切且重要。目前对水中微囊藻毒素的检测技术主要有高效液相色谱、高效液相色谱‑
串联质谱、酶联免疫吸附试验、免疫传感器检测以及蛋白磷酸酶抑制试验等。常规的仪器分
析技术具有准确性好、灵敏度高等优势,但依赖于价格昂贵、占地面积大的分析仪器,且检
测费用高、对技术人员的操作要求较高等不足;更为不足的是,仪器分析技术只能通过对单
个微囊藻毒素异构体进行检测和浓度加和获得微囊藻毒素总量浓度。由于微囊藻毒素异构
体众多,性质近似,目前尚没有针对所有异构体建立相应的检测条件和方法,且无法获得一
些尚未得到鉴定的微囊藻毒素浓度信息。
免疫检测(enzyme‑linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒具有检测广谱性强、灵敏
度高、分析通量大、检测速度快、费用低廉等优点,能适应大规模样品的微囊藻毒素总量快
速筛查和预警监测。目前已有的微囊藻毒素检测试剂盒大部分只能检测一种微囊藻毒素异
构体,无法直接检测微囊藻毒素总量。
发明内容
MC‑HtyR‑BSA、NH2‑MC‑HilR‑BSA、NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA和 NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA;其中
所述NH2‑MC‑LR‑BSA为氨基修饰的MC‑LR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑RR‑BSA为氨基修饰的MC‑
RR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑YR‑BSA为氨基修饰的MC‑YR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LA‑BSA
为氨基修饰的MC‑LA与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LF‑BSA为氨基修饰的MC‑LF与BSA偶联物;所
述NH2‑MC‑LW‑BSA为氨基修饰的MC‑LW与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LY‑BSA为氨基修饰的MC‑LY
与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑WR‑BSA为氨基修饰的MC‑WR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑HtyR‑BSA
为氨基修饰的MC‑HtyR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑HilR‑BSA为氨基修饰的MC‑HilR与 BSA偶
联物;所述NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑LR与BSA偶联物;所述NH2‑[D‑
Asp3]MC‑RR‑BSA为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑RR与BSA偶联物;
的MC‑YR为式2中R1为酪氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物;所述氨基修饰的MC‑LA为式
2中R1为亮氨酸、R2为丙氨酸和R3为甲基的化合物;所述氨基修饰的MC‑LF为式2中R1为亮氨
酸、R2为苯丙氨酸和R3为甲基的化合物;所述氨基修饰的MC‑LW为式2中R1为亮氨酸、R2为色
氨酸和R3为甲基的化合物;所述氨基修饰的MC‑LY为式2中R1为亮氨酸、R2为酪氨酸和R3为
甲基的化合物;所述氨基修饰的MC‑WR为式2中R1为色氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合
物;所述氨基修饰的MC‑HtyR为式2中R1为高酪氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物;所述
氨基修饰的MC‑HilR为式2中R1为同异亮氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物;所述氨基
修饰的[D‑Asp3]MC‑LR为式2中R1为亮氨酸、R2为精氨酸和R3为氢的化合物;所述氨基修饰
的[D‑Asp3]MC‑RR为式2中R1为精氨酸、R2为精氨酸和R3为氢的化合物。
LW‑KLH、NH2‑MC‑LY‑KLH、NH2‑MC‑WR‑KLH、NH2‑MC‑HtyR‑KLH、 NH2‑MC‑HilR‑KLH、NH2‑[D‑
Asp3]MC‑LR‑KLH和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑KLH组成;其中所述 NH2‑MC‑LR‑KLH为氨基修饰的
MC‑LR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑RR‑KLH为氨基修饰的MC‑RR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑YR‑
KLH为氨基修饰的MC‑YR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LA‑KLH为氨基修饰的MC‑LA与KLH偶联
物;所述NH2‑MC‑LF‑KLH为氨基修饰的MC‑LF与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LW‑KLH为氨基修饰的
MC‑LW与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑LY‑KLH为氨基修饰的MC‑LY与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑WR‑
KLH为氨基修饰的MC‑WR与KLH偶联物;所述NH2‑MC‑HtyR‑KLH为氨基修饰的MC‑HtyR与 KLH
偶联物;所述NH2‑MC‑HilR‑KLH为氨基修饰的MC‑HilR与KLH偶联物;所述 NH2‑[D‑Asp3]MC‑
LR‑KLH为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑LR与KLH偶联物;所述 NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑KLH为氨基修
饰的[D‑Asp3]MC‑RR与KLH偶联物。
胞株或将所述阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水,得到微囊藻毒素的单克隆抗
体。
间为2周,共加强免疫6次;所述小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。
联得到的完全抗原B;
海淀区中关村北一条13号),保藏编号为CGMCC No.19194。
为7.0‑7.2的PBS缓冲液,其配置方法如下:8.0g NaCl、0.2g KCl、 2.9g Na2HPO4·12H2O、
0.24g KH2PO4,1L去离子水。
溶液试剂瓶;终止液试剂瓶;酶标板和试剂盒盒体。
曲线的半抑制浓度(IC50)、低浓度和高浓度应分别接近试剂盒定量检测区间最低和最高检
测浓度。
化钠的0.01mol/L pH=7.5磷酸盐缓冲液。
℃温育0.5‑1h,倒出孔内液体,重复用洗涤液洗涤3‑5次,将酶标板倒置在吸水纸上排干;加
入适当稀释度的酶标二抗溶液于酶标板小孔中,或37℃温育0.5‑1h,用洗涤液重复洗3‑5
次,排干;加入显色剂溶液到酶标板小孔中,室温下反应10‑15min,颜色显蓝色,再加入终止
液,立即变成黄色;用酶标仪在波长450m处测定吸光度A,以不加抗体的小孔作为空白调零。
在标准曲线上查出相应的微囊藻毒素浓度,再换算出样品中微囊藻毒素的含量。
0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.0313μg/mL;抗体工作浓度分别为1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/
mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL。分别设置空白孔和抑制孔,抑制孔标准品浓
度为10ng/mL。分别计算各组抑制率,选择抑制率大,空白孔的吸光度值在1.0左右的组合。
溶液中的抗体结合,洗涤去除游离的抗原以及抗原抗体复合物,与固相载体上包被抗原结
合的抗体再与酶标二抗结合,用酶底物进行测定,结合的酶标记物将无色的显色剂转化为
有色的产物。加入反应终止液后用酶标仪测量吸光度,吸光度与样品中的微囊藻毒素浓度
成反比,绘制标准曲线,对样品浓度进行测定。
品(如鱼类、蚌壳类等)以及植物源淡水产品中微囊藻毒素总量的定量检测。例如实施例2中
的广谱型微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒,其对MC‑LR检出限为0.10μg/L,定量检测区间在
0.22μg/L‑2.25μg/L之间,可同时检测上百个样品,单次检测时间小于 3小时。例如实施例2
中的广谱型微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒,其对河水中12种 MCs异构体的回收率在
(54.6±2.5)%~(142.4±1.6)%,批内误差小于7%。例如实施例2中的广谱型微囊藻毒素
酶联免疫检测试剂盒,其对河水、湖水及自来水中MC‑LR, MC‑RR,MC‑YR异构体的回收率平
均值为(93.1±10.8)%,批内误差小于15%。本发明的广谱型微囊藻毒素酶联免疫检测试
剂盒对至少12种MCs具有广谱响应能力,准确度和精密度符合要求,能进行环境样品中微囊
藻毒素总量的大规模快速筛查和预警监测。
附图说明
具体实施方式
人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
说明,均可从商业途径得到。
(羊抗小鼠IgG/HRP)(北京中杉金桥生物技术有限公司);PEG 1500(Roche公司);HAT储液、
HT储液、石蜡油、BSA、KLH、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)、 2.2%甲基纤维素、2‑巯
基乙胺、戊二醛、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸盐缓冲液、四甲
基联苯胺(TMB)、过氧化氢合尿素(CO(NH2)2·H2O2)、吐温‑20、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐
剂(Sigma‑Aldrich公司);IMDM培养基(Invitrogen 公司);二甲基亚砜(DMSO)(Amresco公
司);BupH PBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific 公司);赖氨酸(上海源叶生物科技有限
公司);无水乙醚、乙酸、异丙醇、甲醇、盐酸、硫酸、氢氧化钠(北京化工厂);MC‑LR、MC‑RR、
MC‑YR、MC‑LA、MC‑LF、MC‑LW、 MC‑LY、MC‑WR、MC‑HtyR、MC‑HilR、[D‑Asp3]MC‑LR、[D‑Asp3]
MC‑RR(Enzo Life Sciences 公司)。
饰后的微囊藻毒素分子与KLH偶联,再经凝胶过滤层析后得到12种完全抗原,等量混合后得
到免疫原KLH‑MCs。具体方法如下:
中间产物采用固相萃取技术在SPE固相萃取C18小柱(500mg/6ml)(Agela Technologies)上
进行纯化,得到氨基修饰的MC‑LR,具体纯化步骤为:
层析,其中流动相为超纯水,得到活化后的KLH,并用PBS溶液稀释;0.5mg活化后的KLH与30μ
g氨基修饰的MC‑LR充分混合,室温下反应24h,得到氨基修饰的 MC‑LR与KLH偶联物,以下简
称为NH2‑MC‑LR‑KLH,将NH2‑MC‑LR‑KLH放置于‑20℃冰箱中备用。
备用。
用。
KLH放置于‑20℃冰箱中备用。
KLH放置于‑20℃冰箱中备用。
构变异体的R1、R2和R3的具体基团分别如表1所示。
MC‑LR 亮氨酸残基(Leu) 精氨酸残基(Arg) 甲基(Me)
MC‑RR 精氨酸残基(Arg) 精氨酸残基(Arg) 甲基(Me)
MC‑YR 酪氨酸残基(Tyr) 精氨酸残基(Arg) 甲基(Me)
MC‑LA 亮氨酸残基(Leu) 丙氨酸残基(Ala) 甲基(Me)
MC‑LF 亮氨酸残基(Leu) 苯丙氨酸残基(Phe) 甲基(Me)
MC‑LW 亮氨酸残基(Leu) 色氨酸残基(Trp) 甲基(Me)
MC‑LY 亮氨酸残基(Leu) 酪氨酸残基(Tyr) 甲基(Me)
MC‑WR 色氨酸残基(Trp) 精氨酸残基(Arg) 甲基(Me)
MC‑HtyR 高酪氨酸残基(Hty) 精氨酸残基(Arg) 甲基(Me)
MC‑HilR 同异亮氨酸残基(Hil) 精氨酸残基(Arg) 甲基(Me)
[D‑Asp3]MC‑LR 亮氨酸残基(Leu) 精氨酸残基(Arg) 氢(H)
[D‑Asp3]MC‑RR 精氨酸残基(Arg) 精氨酸残基(Arg) 氢(H)
HtyR‑KLH,NH2‑MC‑HilR‑KLH,NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑KLH和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑KLH 等质量混
合后,得到免疫原KLH‑MCs溶液。
免疫,每次每只小鼠注射0.1mL液体,其中,该0.1mL液体由0.05mL 免疫原KLH‑MCs溶液和
0.05mL弗氏完全佐剂组成;之后按照30μg KLH‑MCs/只小鼠的量对5只小鼠进行加强免疫,
免疫间隔时间为2周,共免疫6次,每次每只小鼠注射0.06mL液体,其中,该0.06mL液体由
0.03mL免疫原KLH‑MCs溶液和0.03mL弗氏不完全佐剂组成。在第6次加强免疫1周后,对小鼠
进行眼眶取血,用间接ELISA 法测定效价,其中,包被抗原为12种BSA‑MC的等量混合物,包
被浓度为2μg/mL。对抗血清效价达到要求的小鼠,按照50μg免疫原/只小鼠的量进行一次腹
腔注射冲击免疫,此次所用免疫原为12种BSA‑MC的等量混合物(BSA‑MCs),3天后再次测定
效价,选取血清效价最高的小鼠脾细胞进行细胞融合。
室温下反应1~4h,以阻断未反应的醛基,得到的包被抗原放置于‑20℃冰箱中备用。对12种
BSA‑MC分别用MALDI‑TOF/MS进行质谱鉴定,测定的12种微囊藻毒素小分子与BSA的偶联比
均为1:1。所述12种包被抗原BSA‑MC分别为 NH2‑MC‑LR‑BSA、NH2‑MC‑RR‑BSA、NH2‑MC‑YR‑
BSA、NH2‑MC‑LA‑BSA,NH2‑MC‑LF‑BSA、 NH2‑MC‑LW‑BSA、NH2‑MC‑LY‑BSA、NH2‑MC‑WR‑BSA、NH2‑
MC‑HtyR‑BSA、 NH2‑MC‑HilR‑BSA、NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA;其中
所述 NH2‑MC‑LR‑BSA为氨基修饰的MC‑LR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑RR‑BSA为氨基修饰的
MC‑RR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑YR‑BSA为氨基修饰的MC‑YR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LA‑
BSA为氨基修饰的MC‑LA与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LF‑BSA为氨基修饰的MC‑LF与BSA偶联
物;所述NH2‑MC‑LW‑BSA为氨基修饰的MC‑LW与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑LY‑BSA为氨基修饰的
MC‑LY与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑WR‑BSA为氨基修饰的MC‑WR与BSA偶联物;所述NH2‑MC‑
HtyR‑BSA为氨基修饰的MC‑HtyR与 BSA偶联物;所述NH2‑MC‑HilR‑BSA为氨基修饰的MC‑
HilR与BSA偶联物;所述 NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑LR与BSA偶联
物;所述 NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA为氨基修饰的[D‑Asp3]MC‑RR与BSA偶联物。
不含血清的IMDM培养基,接着在2min内缓慢加入8mL不含血清的IMDM培养基,室温1000r/
min下离心5min。
箱中(37℃,5%CO2)培养。
前挑克隆)。挑10板×93个细胞单克隆于96孔细胞培养板中培养(事先用含小鼠胸腺细胞的
20%IMDM+2%HT培养液铺板,120μL/孔),第3天换液一次,第5天细胞已铺满96孔板,此时采
用间接ELISA检测培养基上清液中的抗体。
洗液洗涤3次。
℃孵育1h后用洗液洗涤3次。
育1h。
瘤细胞株对12种微囊藻毒素均具有特异性响应。该株阳性杂交瘤细胞株名称命名为MCAB1,
于2019年12月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC,地址:北京市朝
阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),杂交瘤细胞株MCAB1的保藏编号分别
为CGMCC No.19194。
及小颗粒物质。
调整至7.0。
L、0.082μg/L、0.027μg/L、0μg/L的标准溶液,分别灌装入标准品试剂瓶中。
μg/mL,BSA的含量为1%(质量百分含量),硫柳汞的含量为0.01%(质量百分含量)。其中,磷
酸盐缓冲液是浓度为0.01M,pH值为7.0‑7.2的PBS缓冲液,其配置方法如下:8.0g NaCl、
0.2g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4,1L 去离子水。将抗体溶液灌装入试剂瓶中。
NaCl、2g KCl、29g Na2HPO4·12H2O、2.4g KH2PO4,1L去离子水。灌装入试剂瓶中。使用时,将
该溶液用纯水稀释10倍得到1×PBST再用。
BSA,NH2‑MC‑HilR‑BSA,NH2‑[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA 这12种BSA‑MC
的等质量混合后得到的混合物。
[D‑Asp3]MC‑LR‑BSA和NH2‑[D‑Asp3]MC‑RR‑BSA这12种BSA‑MC的合成方法具体为:合成方法
同实施例1的步骤1中所述的步骤,将实施例1的步骤1的中的KLH替换为 BSA,最后再加入20
μL浓度为0.2M的赖氨酸溶液于室温下反应1~4h,以阻断未反应的醛基,得到的产物放置
于‑20℃冰箱中备用。对12种BSA‑MC分别用MALDI‑TOF/MS 进行质谱鉴定,测定的12种微囊
藻毒素小分子与BSA的偶联比均为1:1。
箱中过夜,倒出孔内液体,用洗涤液1×PBST洗涤3‑5次,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,吸
干,在已包被抗原的酶标板小孔中加入200μL 1%(质量百分含量)的BSA溶液封闭,37℃温
育1h,用洗涤液1×PBST洗涤3‑5次,用吸水纸吸干,封装。
行试验(n=3)。采用MC‑LR、MC‑RR、MC‑YR三种微囊藻毒素异构体,分别测量标准曲线,进行
对比。
YR,其它一致),37℃温育0.5h,倒出孔内液体,重复用洗涤液洗涤3‑5次,将酶标板在吸水纸
上排干;加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中,37℃温育0.5h,用洗涤液重复洗3‑5次,吸干;
加入显色溶液到酶标板小孔中,室温下反应10‑15min,用酶标仪在波长450m处测定吸光度
A,以不加抗体的小孔作为空白调零。以各浓度吸光度与阴性对照孔吸光度的比值(即结合
率B/B0)为纵坐标,以对应MC‑LR、MC‑RR或 MC‑YR浓度的1og值为横坐标,绘制半对数标准曲
线图。结果如图1所示,表明标准曲线具有完整的反S形状,并具有上平台和下平台,标准曲
线的平行测定次数3次,误差线为n=3次平行实验的标准偏差,实验重复性良好,相对标准
偏差(变异系数)均在15%以内,表明精密度良好。
据分析和评价的基础,模型如下:
0.80μg/L;检测限为0.10μg/L、0.08μg/L、0.06μg/L;定量检测区间分别为 0.22μg/L‑2.25μ
g/L、0.17μg/L‑2.69μg/L、0.22μg/L‑2.93μg/L。以此证明,该试剂盒中的广谱型抗体对MC‑
LR、MC‑RR、MC‑YR三种微囊藻毒素的异构体的检测能力接近,能够完成样品中微囊藻毒素总
量测定。最终以MC‑LR作为标准品,绘制标准曲线,来检测下述步骤3和步骤4的样品中的微
囊藻毒素总量浓度。
下:样品添加浓度(最终浓度)用X表示,未添加异构体的样品测定平均值为x1,添加了异构
体的样品测定平均值为x2,每个样品平行测定4次,则回收率计算如下式。
高于50%。结果表明本发明的广谱型微囊藻毒素免疫检测试剂盒对12种微囊藻毒素分子均
具有响应,其良好的广谱性可适用于实际样品中的微囊藻毒素总量检测。
计算变异系数,用变异系数确认本试剂盒的稳定性;将MC‑LR、MC‑RR、 MC‑YR异构体分别按
照50%、25%、25%的比例样品加标,使得加标的微囊藻毒素总量浓度为2μg/L;将MC‑LR、
MC‑RR、MC‑YR异构体分别按照33.3%、33.3%、33.3%的比例样品加标,使得加标的微囊藻
毒素总量浓度为3μg/L。然后用本试剂盒进行测定,得到测定结果,并计算回收率,用回收率
确认本试剂盒的准确度。
满足实际水样检测的需要。
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。
总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申
请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,
可以进行一些基本特征的应用。