一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法

摘要

本公开提供一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法，具体提供对含有毕赤酵母表达重组蛋白的发酵液采用多模式色谱树脂进行纯化的方法，其中在发酵液样品上样步骤和洗脱步骤之间包括乙醇淋洗的步骤，所述乙醇淋洗的步骤能够减少纯化产物中重组蛋白降解片段和聚集体。在对于重组人血清白蛋白‑人粒细胞集落刺激因子融合蛋白毕赤酵母发酵液采用Capto MMC层析纯化的方法中，洗脱前采用5‑20%的乙醇淋洗能降低产物中降解片段和聚集体的含量。与浓度为5%的乙醇相比，采用10‑20%的乙醇对降解和聚集体的去除效果有显著提高。

权利要求

1.一种去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于采用多模式色谱树脂对含有毕赤酵母表达重组蛋白的发酵液进行纯化，并且在发酵液上样步骤和洗脱步骤之间包括乙醇淋洗的步骤；所述多模式色谱树脂为Capto MMCTM，所述乙醇淋洗步骤的预洗液含有5-20%的乙醇，所述的毕赤酵母重组表达蛋白为SEQ ID NO:7所示人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白。

2.如权利要求1所述去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于还包括高盐缓冲液预洗步骤、高pH缓冲液预洗步骤。

3.如权利要求1-2任一所述去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其包括：（1）发酵液上样：层析柱用平衡缓冲液平衡后上样，上样结束后再平衡；

（2）乙醇淋洗液预洗：采用含5-20%的乙醇淋洗液预洗；

（3）高盐缓冲液预洗：采用含1M NaCl、pH5.5的预洗缓冲液预洗；

（4）高pH缓冲液预洗：采用pH6.8的缓冲液预洗；

（5）洗脱缓冲液洗脱。

4.如权利要求3所述去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其还包括对层析柱流出液进行SEC-HPLC和非还原SDS-PAGE检测。

5.如权利要求3所述去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液为20mM NaAc+5mM EDTA+0.15M NaCl，所述预洗液为含5%、10%、15%或20%乙醇（m/v）的5mM EDTA溶液，所述高盐缓冲液为40mM NaAc pH5.5+1M NaCl，所述pH缓冲液为40mM PB pH6.8+5mM EDTA-2Na，所述洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl+5mM EDTA-2Na+0.3M NaCl pH8.0。

6.权利要求1-5任一所述方法在纯化毕赤酵母重组表达蛋白、制备毕赤酵母重组表达蛋白单体、和/或提高毕赤酵母重组表达蛋白单体比例中的应用，所述的毕赤酵母重组表达蛋白为SEQ ID NO:7所示人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于所述重组表达蛋白的单体比例超过65%。

说明书

一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种毕赤酵母重组表达蛋白纯化方法，特别是涉及去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，以及所述方法在纯化毕赤酵母重组表达蛋白、制备毕赤酵母重组表达蛋白单体、和/或提高毕赤酵母重组表达蛋白单体比例中的应用。

背景技术

[0002] 人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增值和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还具有刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放出并激活中性粒细胞的功能。自1991年起，重组人粒细胞集落刺激因子(rG-CSF)已经广泛用于治疗癌症化疗导致的骨髓抑制，可以显著改善化疗所引起的中性粒细胞减少症的严重性和持续时间。目前，已经有多种商业化rG-CSF制® ®剂在销售，如非格司亭(filgrastim)(商品名为Gran 和Neupogen )，雷诺司亭(lenograstim)(商品名为Neutrogin®和Granocyte®)，那曲司亭(nartograstim)(商品名为Neu-up®)。但是，天然或重组的G-CSF由于分子量较小，极易被肾小球过滤，在人体内的循环半 衰期很短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(WelteK等，Proc Nat Acad Sci USA,82:1526-1530, 1985；FramptonJE等, Drugs, 48:731-760，
1994)。延长G-CSF制剂体内半衰期可以减少给药次数。

[0003] 人血清白蛋白(HSA)是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在 20天以上。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显 降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。通过基因工程方法将人白蛋白与G-CSF融合表达获得的rHSA/G-CSF,提高G-CSF在体内的半衰期(WendyHalpern等，Pharm Res,19:1720-1729，2002)；该融合蛋白结构中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连。
CN200910199337.9公开了G-CSF 融合蛋白突变体及其制备与应用，通过将人血清白蛋白的基因与人粒细胞集落刺激因子基因融合在一起，利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达获得了相应的融合蛋白。融合后形成的重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白克服了传统的人粒细胞集落刺激因子治疗过程中多次给药的缺点。此外，巴斯德毕赤酵母还具有高水平表达、成本低、以及具有真核表达系统的蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等优点。

[0004] 然而，与G-CSF相比，G-CSF/HSA融合蛋白分子较大，在重组表达、提取、纯化过程中容易被宿主蛋白酶降解产生无活性降解产物，并且重组G-CSF/HSA融合蛋白在宿主细胞中翻译后折叠、转运、分泌过程中易发生多聚化产生聚集体。降解产物、聚集体的存在不仅对G-CSF/HSA融合蛋白活性带来不期望的影响，而且由于其与G-CSF/HSA融合蛋白单体，序列结构、理化参数等方面高度相似，仅在长度、状态等方面存在差异，采用常规的蛋白质纯化手段往往难以达到理想的纯化效果。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明在对毕赤酵母重组表达的人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白进行提取纯化时，在利用乙醇去除毕赤酵母有机色素时，意外发现乙醇处理前后融合蛋白降解产物和聚集体发生改变，基于该发现提出了在色谱纯化过程中利用乙醇去除融合蛋白降解产物和聚集体、提高单体含量的技术方案。聚集体采用多模式色谱树脂对重组（酵母分泌型）人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白进行纯化。后续通过相关研究发现将一定浓度的乙醇用于Capto MMC层析中作为预洗步骤，对聚集体和降解产物的去除效果较为明显。

[0006] 具体而言：

[0007] 一方面，本发明提供一种去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于采用多模式色谱树脂对含有毕赤酵母表达重组蛋白的发酵液进行纯化，并且在发酵液上样步骤和洗脱步骤之间包括乙醇淋洗的步骤。

[0008] 进一步，本发明所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，TM TM其特征在于所述多模式色谱树脂选自以下树脂：HEP Hypercel 、PPA Hypercel 、Capto AdhereTM、Capto MMCTM、MEP HypercelTM，优选Capto MMCTM。

[0009] 进一步，本发明所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于所述乙醇淋洗步骤的预洗液含有5-20%的乙醇，优选10-20%的乙醇。

[0010] 进一步，本发明所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于还包括高盐缓冲液预洗步骤、高pH缓冲液预洗步骤。

[0011] 优选的，本发明前述任一所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其包括：

[0012] （1）发酵液上样：层析柱用平衡缓冲液平衡后上样，上样结束后再平衡；

[0013] （2）乙醇淋洗液预洗：采用含5-20%的乙醇淋洗液预洗；

[0014] （3）高盐缓冲液预洗：采用含1M NaCl、pH5.5的预洗缓冲液预洗；

[0015] （4）高pH缓冲液预洗：采用pH6.8的缓冲液预洗；

[0016] （5）洗脱缓冲液洗脱。

[0017] 进一步，本发明所述所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其还包括对层析柱流出液进行SEC-HPLC和非还原SDS-PAGE检测。

[0018] 进一步，本发明所述所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于：

[0019] 所述平衡缓冲液为20mM NaAc+5mM EDTA+0.15M NaCl，

[0020] 所述预洗液为含5%、10%、15%或20%乙醇（m/v）的5mM EDTA溶液，[0021] 所述高盐缓冲液为40mM NaAc pH5.5+1M NaCl，

[0022] 所述pH缓冲液为40mM PB pH6.8+5mM EDTA-2Na，

[0023] 所述洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl+5mM EDTA-2Na+0.3M NaCl pH8.0。

[0024] 优选的，本发明前述任一所述的去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于所述的毕赤酵母重组表达蛋白为毕赤酵母重组表达的人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白。

[0025] 进一步，本发明所述去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于所述人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的G-CSF部分的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或其突变体，所述SEQ ID NO：1的突变体是在SEQ ID NO:1的基础上进行K34H、L35I、K40H及L41I突变中的任一种单点突变，或者进行K34H与L35I组合突变、K34H与 K40H组合突变、K34H与L41I组合突变、L35I与K40H组合突变、L35I与L41I组合突变、K40H与L41I组合突变中任一种两点组合突变，或者进行K34H、L35I、K40H、L41I、T1A、L3T、G4Y 及P5R组合突变；优选，所述G-CSF融合蛋白突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

[0026] 进一步，本发明所述去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，其特征在于所述人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

[0027] 另一方面，本发明还提供前述任一方法在纯化毕赤酵母重组表达蛋白、制备毕赤酵母重组表达蛋白单体、和/或提高毕赤酵母重组表达蛋白单体比例中的应用。

[0028] 进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述单体比例超过65%，优选超过80%。

[0029] 进一步，本发明所述的应用，其中所述毕赤酵母重组表达蛋白为毕赤酵母重组分泌表达的人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白。

[0030] 第三方面，本发明还提供前述任一方法制备的毕赤酵母重组表达蛋白，其特征在于所述重组表达蛋白的单体含量超过65%，优选超过80%。

[0031] 进一步，本发明所述的毕赤酵母重组表达蛋白，其为人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白。

[0032] 为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

[0033] 术语“重组表达”，是利用重组DNA技术获得蛋白质的方法，重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达系统、哺乳动物细胞蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫蛋白表达系统。

[0034] 术语“融合蛋白”，fusion protein，通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。构建融合蛋白的基本方法是将具有特定功能的天然或人工编码的多肽序列模块化，使用基因编码的DNA序列模板合成，随后将第1个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第2个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。通过控制每一个功能肽模块在整体蛋白材料中的确切位置和拷贝数，能够根据需要改变融合蛋白的组成。

[0035] 术语“人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)”，是一种含有174个氨基酸的糖蛋白，分子量约为20,000Da，G-CSF分子上有5个Cys，Cys36与Cys42、Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cys17为游离半胱氨酸。G-CSF基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子。

[0036] G-CSF主要由单核细胞和巨噬细胞产生，可作用于造血干细胞促进其增殖和分化，还可刺激中性粒细胞、单核巨噬细胞成熟。G-CSF在临床上主要用于预防和治疗肿瘤放疗和/或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及促进感染引起的中性粒细胞减少的恢复。本发明中人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)还包括其功能变体，是在天然人G-CSF蛋白的一个或多个氨基酸位置处具有一个或多个氨基酸修饰、同时保持了天然的生物学活性的类似物或突变体。

[0037] 术语“人血清白蛋白(HSA)”是指人血浆中存在的白蛋白。人血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白质。其占到血清蛋白质的大约一半。在一些实施方式中，人血清白蛋白具有UniProt ID NO:P02768的氨基酸25-609的序列。在一些实施方式中，人血清白蛋白相对于UniProt ID NO:P02768的氨基酸25-609的序列进一步包含C34S。

[0038] 术语“纯化”以及其语法上的变化用于表示完全或部分地去除包含蛋白质和一种或多种杂质的混合物中的至少一种杂质，降低该组合物中杂质的含量，从而提高组合物中蛋白质的纯化水平。

[0039] 术语“层析”是指通过在该方法的特定缓冲液条件下使该混合物流经层析填料，从而将目的溶质即目的蛋白与其他溶质分离的方法，分离原理是由于溶质的各种性质例如等电点，大小，结构等不同，与填料的结合强弱不同，因此保留时间不同，从而从层析填料上洗脱时间不同。

[0040] 术语“多模式色谱载体”是指能够提供至少两个与待结合化合物相互作用的不同但合作位点者。举例来说，这些位点中的一者在配体与目标物质之间产生有吸引力类型的 电荷-电荷相互作用。另一位点可产生电子受体-供体相互作用和／或疏水性和／或亲水性相 互作用。电子供体-受体相互作用包括诸如氢键结、.pi.-.pi.、阳离子-.pi.、电荷转移、双极-双极、诱发的双极等相互作用。“多模式色谱载体”也称作“混合模型”分离基质。US 7,714,112涉及从液体试样中的另一或其它化合物分离抗体的方法，其中使包含所述试样的移动相与多模式分离基质接触以吸附非所需化合物，同时抗体保持游离于液体中，其中多模式分离基质包含能够与靶化合物的带负电位点相互作用的第一基团和能够与所述靶化合物进行至少一种除电荷-电荷相互作用以外的相互作用的第二基团。此先前技术参考文献并入本文中用于参照。

[0041] 多模式色谱载体优选地提供于色谱柱中。多模式色谱揭示于以下文献中：克杰尔.埃里克松(Kiell Eriksson)等人，BioProcess International 第7卷第(2)期2009年2月；Jie Chen等，2010，色谱期刊A，1217，第216-224页；美国专利US7,714,112，其全文都并入本文中作为参考文献。

[0042] 术语“聚集体”是指一个或多个目的蛋白的面条样块。“聚集体”是多个通过位阻相互作用或彼此之间相互作用而变成团的蛋白分子。

[0043] 与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

[0044] 第一，本发明在利用乙醇作为有机溶剂去除毕赤酵母重组表达蛋白中有机色素时，意外发现乙醇有助于除去重组蛋白降解产物和/或聚集体。在此基础上将乙醇淋洗引入色谱技术中，减少了降解产物和/或聚集体的含量、提高了单体的纯度。

[0045] 第二，在多模式色谱树脂Capto MMCTM上样后、常规预洗前进行乙醇淋洗不会损失目的蛋白。本发明选择了多模式色谱树脂Capto MMCTM对重组表达的人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白进行纯化，在上述色谱纯化方法中的高盐缓冲液、高pH缓冲液预洗步骤之前增加乙醇淋洗，不仅能提高产物纯度，而且即使在20%的乙醇浓度下也不会解离目的蛋白。

[0046] 第三，相对于采用其它浓度的乙醇，采用10-20%的乙醇淋洗对降解和聚集体的去除效果显著提高。本发明对色谱条件和参数进行了优化选择，特别是对乙醇淋洗的浓度进行了选择。乙醇淋洗步骤中5-20%的乙醇均对降解和聚集体的去除均有一定的作用，但与浓度为5%的乙醇相比，采用10-20%的乙醇对降解和聚集体的去除效果有显著提高。

附图说明

[0047] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

[0048] 图1A无乙醇淋洗的Capto MMC层析检测图谱。

[0049] 图1B 5%乙醇淋洗的Capto MMC层析检测图谱。

[0050] 图1C 10%乙醇淋洗的Capto MMC层析检测图谱。

[0051] 图1D 20%乙醇淋洗的Capto MMC层析检测图谱。

[0052] 图2：发酵液、预洗流出液、洗脱回收液SDS-PAGE检测图谱。

[0053] Lane1：发酵液。

[0054] Lane2：20%乙醇淋洗流出液。

[0055] Lane3：40mM NaAc pH5.5+1M NaCl预洗流出液。

[0056] Lane4：40mMPB pH6.8+5mM EDTA-2Na预洗流出液。

[0057] Lane5：50mM Tris-HCl+5mM EDTA+0.3M NaCl（pH8.0）洗脱回收液。

[0058] 图3：不同浓度乙醇淋洗后洗脱回收液非还原SDS-PAGE电泳图谱。

[0059] 泳道由左至右依次为：

[0060] Lane1：上样前发酵液。

[0061] Lane2：20%乙醇淋洗。

[0062] Lane3：10%乙醇淋洗。

[0063] Lane4：5%乙醇淋洗。

[0064] Lane5：无乙醇淋洗。

[0065] 图4：不同浓度乙醇淋洗后洗脱回收液非还原SEC-HPLC图。

具体实施方式

[0066] 下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

[0067] 实施例1. 发酵液的制备

[0068] 根据CN200910199337.9公开的方法制备含重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的毕赤酵母发酵液。具体而言，将编码HSA/G-CSF的DNA序列(SEQ ID NO：5)由上海 Invitrogen公司合成，并插入到pMD18-T(TaKaRa)中，构建成质粒HSA/G-CSF/pMD18-T。HSA带有其天然的信号肽序列，并在信号肽序列前加入BamHI位点， G-SCF的3’端加入EcoRI位点。

[0069] HSA/G-CSF/pMD18-T质粒用BamHI/EcoRI酶切，回收酶切片段，并连接到相同酶切的pPIC9质粒上，转化E.coli DH5a感受态细胞，最后涂布于含50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，直到长出单克隆菌斑。转化斑按 常规方法提取质粒，用BamHI/EcoRI酶切鉴定，选择有目的大小片段切下的质粒，测序。

[0070] 测序验证正确的质粒，经SalI酶切线性化后，用电转化转化至感受态GS115细胞中，涂布于RDB平板(不含组氨酸)上，于30℃培养3天，至单菌落出现。将重组酵母单菌落接种至10ml BMGY液体培养基中，30℃，250rpm 培养24小时后，静置过夜，弃上清，加入10ml含1％甲醇的BMMY液体培养基，30℃， 250rpm诱导，每24小时补加一次甲醇，共诱导72小时。

[0071] 发酵结束后，发酵液经过离心处理，测定上清液浊度，确保上清液的浊度控制在150NTU以内，离心收获的上清经过深层过滤后，浊度不高于80NTU，确认发酵液pH 5.5±
0.3，如超过用0.5mol/L氢氧化钠或浓盐酸调节，电导率15-25mS/cm，若超出则用纯化水稀释或添加固体氯化钠调节。通过SDS-PAGE对发酵液定量表达量为0.5-1.2mg/ml。

[0072] 实施例2. Capto MMC 层析

[0073] 1、常规层析：

[0074] 使用缓冲液为：

[0075] 平衡缓冲液Buffer A（20mM NaAc+5mM EDTA+0.15M NaCl）；

[0076] 预洗缓冲液BufferB1（40mM NaAc pH5.5+1M NaCl）；

[0077] 预洗缓冲液BufferB2（40mM PB pH6.8+5mM EDTA-2Na）；

[0078] 洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl+5mM EDTA-2Na+0.3M NaCl pH8.0）。

[0079] 保持层析柱装载高度约为15ml，保持较好的分辨率，对层析柱的柱效进行测定，较高的柱效会有更好的分离效果。使用0.5M NaOH对层析柱进行清洁消毒，层析柱完全在0.5MNaOH时间大于等于30min，使用平衡缓冲液Buffer A平衡层析柱约3-4CV至电导和pH和缓冲液保持一致后开始上样，上样前确定发酵液的电导15-25mS/cm和pH 5.5±0.3，保持载量约20mg/ml，保留时间大于等于5min；上样结束后，使用平衡缓冲液Buffer A进行再平衡至紫外将至100mAU以下，电导和pH和平衡液保持一致后换预洗缓冲液Buffer B1预洗2-
3CV，再使用预洗缓冲液Buffer B2进行预洗4-6CV，最后使用洗脱缓冲液B进行洗脱200mAU开始收集样品，下降至200mAU停止收集样品；层析结束后再次使用0.5MNaOH约2CV进行清洁消毒，最后使用20%乙醇将层析系统和层析柱保存。

[0080] 2、包含乙醇淋洗的层析

[0081] 乙醇淋洗液为：

[0082] 20%乙醇淋洗液：5mM EDTA+20%（m/v）乙醇；

[0083] 10%乙醇淋洗液：5mM EDTA+10%（m/v）乙醇；

[0084] 5%乙醇淋洗液：5mM EDTA+5%（m/v）乙醇。

[0085] 包含乙醇淋洗的层析过程参照常规层析过程，不同之处在于上样后利用平衡缓冲液Buffer A进行再平衡，至紫外将至100mAU以下、电导和pH和平衡液保持一致后，先利用相应浓度的乙醇淋洗液预洗2-3CV，然后再进行预洗缓冲液Buffer B1预洗、预洗缓冲液Buffer B2预洗、洗脱等步骤。即：

[0086] 平衡→上样→再平衡→乙醇淋洗→预洗缓冲液Buffer B1预洗→预洗缓冲液Buffer B2预洗→样品洗脱→清洁保存。

[0087] 监测不同预洗条件下的流出峰，对预洗流出液、洗脱回收液进行SDS-PAGE检测。结果如图1、2所示。

[0088] 图1中可以明显看到不同浓度的乙醇淋洗均有出峰的情况。无乙醇淋洗时，洗脱峰之前有两个预洗流出峰，其分别对应预洗缓冲液Buffer B1流穿液、预洗缓冲液Buffer B2流穿液；而在增加了5%、10%、20%乙醇淋洗步骤时，则有三个预洗流出峰，分别对应乙醇淋洗流穿液、预洗缓冲液Buffer B1流穿液、预洗缓冲液Buffer B2流穿液。图1的结果表明，乙醇淋洗步骤能够从Capto MMC 层析柱上去除部分蛋白。

[0089] 图2显示20%乙醇淋洗流穿液中含有杂蛋白、且不含有重组表达的目的蛋白。预洗缓冲液Buffer B1流穿液、预洗缓冲液Buffer B2流穿液也都含有杂蛋白、同时含有一定量的目的蛋白。洗脱回收液中含有大量目的蛋白。图2的结果表面，乙醇淋洗步骤从Capto MMC 层析柱上去除的蛋白并非目的蛋白。

[0090] 对采用不同预洗条件的洗脱回收液进行非还原SDS-PAGE电泳，结果如图3所示。从图3的非还原SDS-PAGE电泳图可以看到随着乙醇淋洗浓度的增加降解条带变得越来越浅。上述结果表明5-20%的乙醇淋洗对重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的降解产物具有一定的去除效果。

[0091] 实施例3 SEC-HPLC 检测过程

[0092] 高效液相色谱仪：Agilent 1260； 色谱柱：TSKgelG300SWXL；

[0093] 流动相：0.1mol/L PB+0.1mol/L Na2SO4 pH6.8；

[0094] 样品制备：将样品用流动相稀释至1.0mg/ml，12000rpm离心10min，取上清进样分析。

[0095] 分析条件：流速：0.6ml/min；柱温：25℃；检测波长：214nm；分析时间：25min。

[0096] 系统适用性测试：取工作参考品进样20微升按分析条件进行HPLC分析，单体峰理论塔板数为：7711；保留时间为13.954；单体和聚集体之间的分离度为3.4。

[0097] 将实施例2中的Capto MMC 层析洗脱样品进行非还原SEC-HPLC分析，结果如图4、表1所示。

[0098] 表1：不同浓度乙醇淋洗后洗脱回收液非还原SEC-HPLC结果

[0099]

[0100] 从图4、表1中可以明显看到，无乙醇淋洗、5%乙醇淋洗、10%乙醇淋洗、20%乙醇淋洗的目的产物峰差异不明显，且在目的产物峰之前均有一个聚集体峰。其中，无乙醇淋洗的洗脱产物与5%乙醇淋洗的洗脱产物聚集体峰下面积差异不明显，且大于10%乙醇淋洗的洗脱产物聚集体峰下面积；四组中20%乙醇淋洗的洗脱产物聚集体峰下面积最小。上述结果表明随着淋洗乙醇浓度的增加，样品的聚集体含量呈逐渐下降趋势，10-20%乙醇淋洗对重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白聚集体有显著去除作用，20%乙醇淋洗对聚集体的去除效果最佳。

[0101] 在Capto MMC中增加5-20%的乙醇淋洗从SEC-HPLC和非还原SDS-PAGE中均可以看到对洗脱产物中的降解产物和聚集体有不同程度的去除作用，在5-20%乙醇范围内，乙醇浓度越高对聚集体的去除效果越为明显。与采用5%乙醇淋洗的方案相比，采用10-20%的乙醇淋洗对降解产物和聚集体的去除效果显著提高，大大增加了洗脱产物中重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白单体的含量。

[0102] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。