一种树突状细胞制剂及其应用转让专利
申请号 : CN202010517018.4
文献号 : CN111926042B
文献日 : 2021-12-07
发明人 : 谭晓华 , 刘春蕙
申请人 : 深圳豪石生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了一种治疗性树突状细胞癌症疫苗及其应用，属于生物技术领域。本发明构建了一种能够同时表达肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL及重组腺病毒，并将该重组腺病毒感染人外周血来源的单核细胞获得治疗性树突状细胞癌症疫苗。该癌症疫苗可以通过诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞而发挥抗肿瘤作用，从而用于治疗各种血液系统肿瘤和实体肿瘤。
权利要求 :
1.一种携带有多种目的基因的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，其特征在于，所述穿梭质粒命名为pGBC‑IRES‑WSL，其出发载体为pDC511穿梭质粒，所述多种目的基因包括肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子GM‑CSF、CD40L和4‑1BBL的表达基因，且其中所述粒‑巨核细胞集落刺激因子GM‑CSF、CD40L和4‑1BBL的表达基因通过两个2A肽序列串联形成一个开放读框，并在所述肿瘤相关抗原的表达序列5’端连接有内部核酸进入位点IRES序列；
所述肿瘤相关抗原的表达基因为核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示的融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1。
2.根据权利要求1所述的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，其特征在于，所述GM‑CSF表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述CD40L表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述4‑1BBL表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
3.根据权利要求1所述的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，其特征在于，所述2A肽序列选自E2A、F2A、T2A和P2A中的任一种或两种的组合，由两个2A肽序列串联形成的开放读框中GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因的连接位置可以互换。
4.根据权利要求1‑3中任一项所述穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，其特征在于，所述穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。
5.权利要求1‑4中任一项所述的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL的构建方法，其包括以下步骤：
5.1）将CMVp‑pA表达盒序列插入pDC511穿梭质粒的多克隆位点中，获得质粒pDC523；
5.2）合成一段寡核苷酸片段，其包含两个2A肽序列和多克隆位点；
5.3）将步骤5.2）合成的寡核苷酸片段插入5.1）的质粒pDC523的CMVp‑pA表达盒多克隆位点中，获得命名为pDC523 2´2A的穿梭质粒；
5.4）将GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因顺序插入步骤5.3）获得的pDC523 2´2A穿梭质粒中，获得包含有GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L表达基因的质粒，命名为pDC523 GM‑CSF/4‑
1BBL/CD40L质粒，且其中GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因由两个2A肽序列串联形成一个开放读框；
5.5）将肿瘤相关抗原的表达基因插入步骤5.4）的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒中获得pGBC‑IRES‑WSL穿梭质粒，在所述肿瘤相关抗原的表达基因的5’端已连接有内部核酸进入位点IRES序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5.2）中所述寡核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5.3）中所述pDC523 2´2A穿梭质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5.5）中所述肿瘤相关抗原的表达基因为融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1，该融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1插入步骤5.4）的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒中的具体操作为：
5.5.1）将人LAMP‑1基因的信号肽和信号分类序列插入pmRNA IRES‑EGFP质粒中替换EGFP序列，获得pmRNA IRES‑LAMP‑1质粒；
5.5.2）将tWT1和Survivin的表达基因顺序插入pmRNA IRES‑LAMP‑1质粒中，获得pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1质粒；
5.5.3）从步骤5.5.2）的pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1质粒中PCR扩增获得5’端已连接有IRES序列的肿瘤相关抗原表达基因，命名为IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1序列；
5.5.4）将步骤5.5.3）扩增获得的IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1序列插入步骤5.4）获得的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒中，获得pGBC‑IRES‑WSL穿梭质粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤5.5.3）中所述扩增用的引物对为如SEQ ID NO:31所示的上游引物和如SEQ ID NO:32所示的下游引物。
10.一种重组腺病毒，其通过将权利要求1‑4中任一项所述或权利要求5步骤5.5）获得的pGBC‑IRES‑WSL穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染HEK 293T细胞获得。
11.一种树突状细胞制剂，其通过将权利要求10所述的重组腺病毒感染人外周来源的血单核细胞获得，其能够同时表达肿瘤相关抗原tWT1/Survivin/LAMP‑1、GM‑CSF、CD40L和
4‑1BBL。
12.根据权利要求11所述的树突状细胞制剂，所述重组腺病毒的感染剂量为10 100 ~
pfu/cell，感染时间为36～48小时。
13.权利要求1‑4中任一项所述的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL或权利要求10所述的重组腺病毒在制备用于诱导人外周来源的血单核细胞分化为树突状细胞并诱导该树突状细胞成熟的药物中的用途。
说明书 :
一种树突状细胞制剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域中的治疗性癌症疫苗的制备，具体涉及一种治疗性树突状细胞癌症疫苗及其应用。
背景技术
[0002] 癌症是全球持续关注的重大健康问题。目前免疫治疗已成为癌症治疗最具前景的方法，包括免疫检查点阻断剂PD‑1/PD‑L1、CAR‑T技术、溶瘤病毒和治疗性癌症疫苗成为免
疫治疗开发的重点和热点领域，至今美国FDA已批准了一款治疗性癌症疫苗[Provenge
(Sipuleucel‑T)]、六款免疫检查点阻断剂[包括CTLA‑4抑制剂Ipilimumab(Yervoy)；PD‑1
抑制剂Nivolumab(Opdivo)、Pembrolizumab(Keytruda)；PD‑L1抑制剂Atezolizumab
(Tecentriq)、Durvalumab(Imfinzi)和Avelumab(Bavencio)]、二款CAR‑T技术产品
[Yescarta 和Kymriah]和一款溶瘤病毒[talimogene laherparepvec(Imlygic)，T‑Vec]用
于临床，取得了良好的临床效果。然而，上述免疫治疗仅对少部分肿瘤有显著疗效，而在大
多数肿瘤中并未显示明显优势，这显然与不同肿瘤生物学多样性和机体免疫系统的复杂性
相关。
疫治疗开发的重点和热点领域，至今美国FDA已批准了一款治疗性癌症疫苗[Provenge
(Sipuleucel‑T)]、六款免疫检查点阻断剂[包括CTLA‑4抑制剂Ipilimumab(Yervoy)；PD‑1
抑制剂Nivolumab(Opdivo)、Pembrolizumab(Keytruda)；PD‑L1抑制剂Atezolizumab
(Tecentriq)、Durvalumab(Imfinzi)和Avelumab(Bavencio)]、二款CAR‑T技术产品
[Yescarta 和Kymriah]和一款溶瘤病毒[talimogene laherparepvec(Imlygic)，T‑Vec]用
于临床，取得了良好的临床效果。然而，上述免疫治疗仅对少部分肿瘤有显著疗效，而在大
多数肿瘤中并未显示明显优势，这显然与不同肿瘤生物学多样性和机体免疫系统的复杂性
相关。
[0003] 其中治疗性癌症疫苗一直是肿瘤免疫治疗领域研究的重点和热点之一。所谓治疗性癌症疫苗是指以治疗为目的的癌症疫苗，通常是通过诱导机体产生肿瘤特异性的主动性
免疫反应来实现抗肿瘤效应。可通过多种手段或策略来达到目的，如各种肽疫苗、各种载体
疫苗和以树突状细胞(Dendritic cells,DCs)为基础的瘤苗以及各种疫苗组件有机组合的
瘤苗，如肽包被DCs、各类载体(RNA、DNA以及病毒载体)转染或感染DCs等，特别是其中的新
抗原瘤苗，即利用肿瘤内突变基因编码的突变蛋白产生的多种抗原肽制备的治疗性瘤苗用
于肿瘤患者的治疗，即便是个案或小样本的临床研究也呈现难以置信的临床治疗效果。然
而，要诱导产生肿瘤特异性的主动性免疫反应，一个关键性环节就是体内的抗原递呈细胞
(Antigen presenting cells，APCs)将肿瘤抗原肽递呈给T细胞识别。而DCs是目前已知的
体内最强的 APCs，因此治疗性DC瘤苗在治疗性癌症疫苗中占有举足轻重的地位。
免疫反应来实现抗肿瘤效应。可通过多种手段或策略来达到目的，如各种肽疫苗、各种载体
疫苗和以树突状细胞(Dendritic cells,DCs)为基础的瘤苗以及各种疫苗组件有机组合的
瘤苗，如肽包被DCs、各类载体(RNA、DNA以及病毒载体)转染或感染DCs等，特别是其中的新
抗原瘤苗，即利用肿瘤内突变基因编码的突变蛋白产生的多种抗原肽制备的治疗性瘤苗用
于肿瘤患者的治疗，即便是个案或小样本的临床研究也呈现难以置信的临床治疗效果。然
而，要诱导产生肿瘤特异性的主动性免疫反应，一个关键性环节就是体内的抗原递呈细胞
(Antigen presenting cells，APCs)将肿瘤抗原肽递呈给T细胞识别。而DCs是目前已知的
体内最强的 APCs，因此治疗性DC瘤苗在治疗性癌症疫苗中占有举足轻重的地位。
[0004] DCs的主要功能是摄取、加工、处理和呈递抗原，并将抗原信息传递给初始型T细胞，促使T细胞增殖、分化和激活成为能识别和杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，
可见抗肿瘤免疫效应最重要的还是T细胞反应，而DCs则成为诱导这种肿瘤特异性T淋巴细
胞反应最为关键的一环。例如2010年美国FDA批准的世界上第一个治疗性DCs瘤苗
[Sipuleucel‑T(Provenge)]，是一种前列腺癌疫苗，用于无症状或微小症状、去势抗性的转
移性晚期前列腺癌的治疗，预示癌症免疫治疗时代的到来。继Sipuleucel‑T获批后，近十年
FDA 相继批准了近十款肿瘤免疫治疗相关的产品应用于临床。然而，也有失败的案例，如葛
兰素史克(GSK)的MAGE‑A3治疗性瘤苗(重组MAGE‑A3蛋白加AS15免疫刺激剂，多次肌肉注
射)在治疗非小细胞肺癌的III期临床研究(MAGRIT研究)并没有获得预期的效果而提前终
止。尽管失败的原因不明，但治疗性DCs瘤苗的设计方面应该值得考虑，以期获得具有更好
的临床治疗效果的治疗性癌症疫苗。
可见抗肿瘤免疫效应最重要的还是T细胞反应，而DCs则成为诱导这种肿瘤特异性T淋巴细
胞反应最为关键的一环。例如2010年美国FDA批准的世界上第一个治疗性DCs瘤苗
[Sipuleucel‑T(Provenge)]，是一种前列腺癌疫苗，用于无症状或微小症状、去势抗性的转
移性晚期前列腺癌的治疗，预示癌症免疫治疗时代的到来。继Sipuleucel‑T获批后，近十年
FDA 相继批准了近十款肿瘤免疫治疗相关的产品应用于临床。然而，也有失败的案例，如葛
兰素史克(GSK)的MAGE‑A3治疗性瘤苗(重组MAGE‑A3蛋白加AS15免疫刺激剂，多次肌肉注
射)在治疗非小细胞肺癌的III期临床研究(MAGRIT研究)并没有获得预期的效果而提前终
止。尽管失败的原因不明，但治疗性DCs瘤苗的设计方面应该值得考虑，以期获得具有更好
的临床治疗效果的治疗性癌症疫苗。
[0005] 现有的制备DC瘤苗的培养体系为首先获取患者的外周血单个核细胞(PBMCs)并通+
过塑料粘附贴壁或CD14的免疫磁珠分选获得单核细胞后，加入GM‑CSF和IL‑4，2～3天更换
培养基并添加新的细胞因子，大致5天左右单核细胞可分化为不成熟的DCs，此时给予靶抗
原刺激，再加入成熟诱导因子(鸡尾酒式细胞因子组合TNF‑α、IL‑1β、IL‑6和PGE2)1～2 天，
才能获得抗原刺激的成熟DCs，整个制备时间大约7～9天，其操作步骤较多、繁琐，容易出现
污染等情况，并且需要多种细胞因子，制备成本较高。虽然经探索已经获得了一种快速获取
DCs的方法(FastDC)，即单核细胞在GM‑CSF和IL‑4的存在下，2～3天即可分化成为DCs，用这
种DCs同样也可诱导产生肿瘤特异性的CTL反应，缩短了培养时间。但仍然需要多步骤的实
验室操作、添加抗原、补充细胞因子等过程，而且其T细胞的刺激效果并没有得到普遍的认
可。
过塑料粘附贴壁或CD14的免疫磁珠分选获得单核细胞后，加入GM‑CSF和IL‑4，2～3天更换
培养基并添加新的细胞因子，大致5天左右单核细胞可分化为不成熟的DCs，此时给予靶抗
原刺激，再加入成熟诱导因子(鸡尾酒式细胞因子组合TNF‑α、IL‑1β、IL‑6和PGE2)1～2 天，
才能获得抗原刺激的成熟DCs，整个制备时间大约7～9天，其操作步骤较多、繁琐，容易出现
污染等情况，并且需要多种细胞因子，制备成本较高。虽然经探索已经获得了一种快速获取
DCs的方法(FastDC)，即单核细胞在GM‑CSF和IL‑4的存在下，2～3天即可分化成为DCs，用这
种DCs同样也可诱导产生肿瘤特异性的CTL反应，缩短了培养时间。但仍然需要多步骤的实
验室操作、添加抗原、补充细胞因子等过程，而且其T细胞的刺激效果并没有得到普遍的认
可。
[0006] 通过对共刺激分子和/或具有佐剂功能的生物活性分子的优化组合以期提供复合的刺激信号常常是一种提高治疗性瘤苗功效的合理性设计手段。例如一种针对前列腺癌的
PSA‑TRICOM疫苗 的设计采用了分别用两种病毒载体表达前列腺特异抗原
(PSA)和三个共刺激分子或粘附分子组成的免疫佐剂TRICOM(B7.1、ICAM‑1和LFA‑3)，其中
第一种病毒为重组痘苗病毒(vaccinia)，而第二种为重组鸡痘病毒(Fowlpox)，两种病毒分
别表达抗原和共刺激分子后联用构成PSA‑TRICOM疫苗体系。在临床试验研究中，采用
Prime‑Boost策略对晚期前列腺癌进行免疫，即先用编码PSA‑TRICOM的重组痘苗病毒 (rV‑
PSA‑TRICOM)Prime皮下给药两次，每次间隔2周，再用编码PSA‑TRICOM的重组鸡痘病毒(rF‑
PSATRICOM)Boost皮下给药四次，每次间隔4周，并在顺序给药后当日连续3 天皮下给予GM‑
CSF至所有注射疫苗的部位。在一个多中心随机对照双盲II期临床试验研究中，125名去势
抗性(castration‑resistant)转移性前列腺癌患者被纳入该临床研究，患者按2:1 的比例
随机分至治疗组(rV‑PSA‑TRICOM Prime两次加rF‑PSATRICOM Boost四次并每次连续3天给
予GM‑CSF)84名患者，而对照组(空rV两次加空rF四次皮下注射，GM‑CSF则用生理盐水替代)
41名。研究的主要终点为无进展生存期(PSF)，尽管两组无明显差异，但随访至研究后的第
三年，治疗组仍然有30％的患者仍然活着，而对照组只有17％的患者存活，总体生存期治疗
组为25.1个月，长出对照组(16.6个月)8.5个月；且治疗组毒副反应轻微，患者均能较好耐
受，具有较好的治疗效果。然而，此类治疗性瘤苗需要三种制剂的序贯使用(rV‑PSA‑
TRICOM、rF‑PSATRICOM和GM‑CSF)，给药方式相对复杂，且是两种病毒体内的直接应用，存在
一定的安全性隐患。
PSA‑TRICOM疫苗 的设计采用了分别用两种病毒载体表达前列腺特异抗原
(PSA)和三个共刺激分子或粘附分子组成的免疫佐剂TRICOM(B7.1、ICAM‑1和LFA‑3)，其中
第一种病毒为重组痘苗病毒(vaccinia)，而第二种为重组鸡痘病毒(Fowlpox)，两种病毒分
别表达抗原和共刺激分子后联用构成PSA‑TRICOM疫苗体系。在临床试验研究中，采用
Prime‑Boost策略对晚期前列腺癌进行免疫，即先用编码PSA‑TRICOM的重组痘苗病毒 (rV‑
PSA‑TRICOM)Prime皮下给药两次，每次间隔2周，再用编码PSA‑TRICOM的重组鸡痘病毒(rF‑
PSATRICOM)Boost皮下给药四次，每次间隔4周，并在顺序给药后当日连续3 天皮下给予GM‑
CSF至所有注射疫苗的部位。在一个多中心随机对照双盲II期临床试验研究中，125名去势
抗性(castration‑resistant)转移性前列腺癌患者被纳入该临床研究，患者按2:1 的比例
随机分至治疗组(rV‑PSA‑TRICOM Prime两次加rF‑PSATRICOM Boost四次并每次连续3天给
予GM‑CSF)84名患者，而对照组(空rV两次加空rF四次皮下注射，GM‑CSF则用生理盐水替代)
41名。研究的主要终点为无进展生存期(PSF)，尽管两组无明显差异，但随访至研究后的第
三年，治疗组仍然有30％的患者仍然活着，而对照组只有17％的患者存活，总体生存期治疗
组为25.1个月，长出对照组(16.6个月)8.5个月；且治疗组毒副反应轻微，患者均能较好耐
受，具有较好的治疗效果。然而，此类治疗性瘤苗需要三种制剂的序贯使用(rV‑PSA‑
TRICOM、rF‑PSATRICOM和GM‑CSF)，给药方式相对复杂，且是两种病毒体内的直接应用，存在
一定的安全性隐患。
发明内容
[0007] 针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种携带有多种目的基因的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，该穿梭质粒的出发载体为pDC511穿梭质粒，所述多种
目的基因包括肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的表达
基因，且其中所述粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的表达基因通过两
个2A肽序列串联形成一个开放读框，并在所述肿瘤相关抗原的表达序列5’端连接有内部核
酸进入位点IRES序列。
目的基因包括肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的表达
基因，且其中所述粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的表达基因通过两
个2A肽序列串联形成一个开放读框，并在所述肿瘤相关抗原的表达序列5’端连接有内部核
酸进入位点IRES序列。
[0008] 上述肿瘤相关抗原的表达基因包括但不限于以下基因中的任一种：tWT1、Survivin、融合基因tWT1/Survivin、融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1、MUC1、LMP、HPV E6
E7、EGFRvIII、 HER‑2/neu、MAGE A3、p53(nonmutant和mutant)、NY‑ESO‑1、PSMA、GD2、CEA、
MelanA/MART1、Ras mutant、gp100、Proteinase3(PR1)、bcr‑abl、Tyrosinase、PSA、hTERT、
Sarcoma translocation breakpoints、EphA2、PAP、ML‑IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS
融合基因)、NA17、PAX3、ALK、Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、
RhoC、TRP‑2、GD3、Fucosyl GM1、Mesothelin、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1 和GM3；
优选地，所述肿瘤相关抗原的表达基因为tWT1(其核苷酸序列可如SEQ ID NO:22 所示)、
Survivin(其核苷酸序列可如SEQ ID NO:26所示)、融合基因tWT1/Survivin(其核苷酸序列
可如SEQ ID NO:34所示)或融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1(其核苷酸序列可如 SEQ ID
NO:29所示)。
E7、EGFRvIII、 HER‑2/neu、MAGE A3、p53(nonmutant和mutant)、NY‑ESO‑1、PSMA、GD2、CEA、
MelanA/MART1、Ras mutant、gp100、Proteinase3(PR1)、bcr‑abl、Tyrosinase、PSA、hTERT、
Sarcoma translocation breakpoints、EphA2、PAP、ML‑IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS
融合基因)、NA17、PAX3、ALK、Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、
RhoC、TRP‑2、GD3、Fucosyl GM1、Mesothelin、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1 和GM3；
优选地，所述肿瘤相关抗原的表达基因为tWT1(其核苷酸序列可如SEQ ID NO:22 所示)、
Survivin(其核苷酸序列可如SEQ ID NO:26所示)、融合基因tWT1/Survivin(其核苷酸序列
可如SEQ ID NO:34所示)或融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1(其核苷酸序列可如 SEQ ID
NO:29所示)。
[0009] 上述GM‑CSF表达基因的核苷酸序列可如SEQ ID NO:7所示；所述CD40L表达基因的核苷酸序列可如SEQ ID NO:15所示；所述4‑1BBL表达基因的核苷酸序列可如SEQ ID NO:11
所示。
所示。
[0010] 上述2A肽序列选自E2A、F2A、T2A和P2A中的任一种或两种的组合，由两个2A肽序列串联形成的开放读框中GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因的连接位置可以互换。
[0011] 上述穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。
[0012] 本发明另一方面提供了上述的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL的构建方法，其包括以下步骤：
[0013] 6.1)将CMVp‑pA表达盒序列插入pDC511穿梭质粒的多克隆位点中，获得质粒pDC523；
[0014] 6.2)合成一段寡核苷酸片段，其包含两个2A肽序列和多克隆位点；任选地，选用T2A 和P2A时所述寡核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的片段；
[0015] 6.3)将步骤6.2)合成的寡核苷酸片段插入6.1)的质粒pDC523的CMVp‑pA表达盒多克隆位点中，获得命名为pDC523 2×2A的穿梭质粒；任选地，插入SEQ ID NO:3的pDC523 2
×2A穿梭质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
×2A穿梭质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0016] 6.4)将GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因顺序插入步骤6.3)获得的pDC523 2×2A 穿梭质粒中，获得包含有GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L表达基因的质粒，命名为pDC523 GM‑
CSF/4‑1BBL/CD40L质粒，且其中GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因由两个2A肽序列串联形
成一个开放读框；
CSF/4‑1BBL/CD40L质粒，且其中GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的表达基因由两个2A肽序列串联形
成一个开放读框；
[0017] 6.5)将肿瘤相关抗原的表达基因插入步骤6.4)的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒中获得pGBC‑IRES‑WSL穿梭质粒，在所述肿瘤相关抗原的表达基因的5’端已连接有内
部核酸进入位点IRES序列。
部核酸进入位点IRES序列。
[0018] 上述方法中，步骤6.5)中所述肿瘤相关抗原的表达基因为融合基因 tWT1/Survivin/LAMP‑1，该融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1插入步骤6.4)的pDC523 GM‑CSF/4‑
1BBL/CD40L质粒中的具体操作为：
1BBL/CD40L质粒中的具体操作为：
[0019] 6.5.1)将人LAMP‑1基因的信号肽和信号分类序列插入pmRNA IRES‑EGFP质粒中替换 EGFP序列，获得pmRNA IRES‑LAMP‑1质粒；
[0020] 6.5.2)将tWT1和Survivin的表达基因顺序插入pmRNA IRES‑LAMP‑1质粒中，获得 pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1质粒；
[0021] 6.5.3)从步骤6.5.2)的pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1质粒中PCR扩增获得5’端已连接有IRES序列的肿瘤相关抗原表达基因，命名为IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1序
列，任选地，扩增用的引物对为如SEQ ID NO:31所示的上游引物和如SEQ ID NO:32所示的
下游引物；
列，任选地，扩增用的引物对为如SEQ ID NO:31所示的上游引物和如SEQ ID NO:32所示的
下游引物；
[0022] 6.5.4)将步骤6.5.3)扩增获得的IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1序列插入步骤6.4)获得的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒中，获得pGBC‑IRES‑WSL穿梭质粒。
[0023] 本发明再一方面还提供一种重组腺病毒，其为将上述的pGBC‑IRES‑WSL穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染HEK 293T细胞获得；任选地，所述腺病毒骨架质粒为pBGHfrt△
E1,3Cre 或pBGHfrt△E1,3Cre(5/F35)骨架质粒。
E1,3Cre 或pBGHfrt△E1,3Cre(5/F35)骨架质粒。
[0024] 本发明又一方面还提供一种治疗性树突状细胞癌症疫苗，其为将上述的重组腺病毒感染人外周来源的血单核细胞或树突状细胞获得，其能够同时表达肿瘤相关抗原、GM‑
CSF、 CD40L和4‑1BBL；任选地，所述重组腺病毒的感染剂量为10～100pfu/cell，感染时间
为36～ 48小时。
CSF、 CD40L和4‑1BBL；任选地，所述重组腺病毒的感染剂量为10～100pfu/cell，感染时间
为36～ 48小时。
[0025] 上述的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL或重组腺病毒或治疗性树突状细胞癌症疫苗在制备用于治疗血液系统肿瘤和实体肿瘤的药物中的用途也属于本发明的内容；其中所述血液
系统肿瘤和实体肿瘤为WT1和/或Survivin阳性的血液系统肿瘤和实体肿瘤；任选地，所述
WT1和 /或Survivin阳性的血液系统肿瘤包括但不限于急性髓系白血病、慢性髓系白血病
和高危型骨髓增生异常综合征(MDS)；所述WT1和/或Survivin阳性的实体肿瘤包括但不限
于肺癌、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤、前列腺
癌、肾癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、各类恶性肉瘤。
系统肿瘤和实体肿瘤为WT1和/或Survivin阳性的血液系统肿瘤和实体肿瘤；任选地，所述
WT1和 /或Survivin阳性的血液系统肿瘤包括但不限于急性髓系白血病、慢性髓系白血病
和高危型骨髓增生异常综合征(MDS)；所述WT1和/或Survivin阳性的实体肿瘤包括但不限
于肺癌、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤、前列腺
癌、肾癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、各类恶性肉瘤。
[0026] 基于以上技术方案提供的重组腺病毒通过在腺病毒载体中插入肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的表达基因，可以在一次表达时同时
获得肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL，将该重组腺病毒
感染人外周血来源的单核细胞获得治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗时，即可利用重组腺
病毒载体表达的GM‑CSF诱导单核细胞向树突状细胞分化，并且诱导分化产生的树突状细胞
可加工、处理表达的肿瘤相关抗原，并把抗原信息递呈给T细胞；而表达的CD40L诱导 DCs成
熟以及表达的4‑1BBL有助于刺激T细胞的活化，实现最佳的T细胞激活效果。整个过程中不
需要额外地添加共刺激因子或者联用两种或两个以上的表达体系，因此癌症疫苗制备更加
简单、耗时短，且使用更加方便。该治疗性DCs癌症疫苗能够通过诱导机体产生抗原特异性T
淋巴细胞而发挥抗肿瘤作用，达到治疗各种血液系统肿瘤和实体肿瘤的目的，因此具有广
谱的抗癌活性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
获得肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL，将该重组腺病毒
感染人外周血来源的单核细胞获得治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗时，即可利用重组腺
病毒载体表达的GM‑CSF诱导单核细胞向树突状细胞分化，并且诱导分化产生的树突状细胞
可加工、处理表达的肿瘤相关抗原，并把抗原信息递呈给T细胞；而表达的CD40L诱导 DCs成
熟以及表达的4‑1BBL有助于刺激T细胞的活化，实现最佳的T细胞激活效果。整个过程中不
需要额外地添加共刺激因子或者联用两种或两个以上的表达体系，因此癌症疫苗制备更加
简单、耗时短，且使用更加方便。该治疗性DCs癌症疫苗能够通过诱导机体产生抗原特异性T
淋巴细胞而发挥抗肿瘤作用，达到治疗各种血液系统肿瘤和实体肿瘤的目的，因此具有广
谱的抗癌活性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027] 1)本发明利用5/F35嵌合型腺病毒作为基因表达载体，能高效感染造血系统来源的细胞，包括单核细胞和树突状细胞；
[0028] 2)在本发明构建的重组腺病毒载体中含有肿瘤相关抗原tWT1/Survivin融合基因，当编码tWT/Survivin融合基因的重组腺病毒载体感染单核细胞后，能有效地表达tWT1/
Survivin 融合基因编码的蛋白产物，从而能提供这两种肿瘤相关抗原给树突状细胞加工
提呈成肿瘤抗原肽，刺激T细胞产生WT1和Survivin特异性CTL反应；
Survivin 融合基因编码的蛋白产物，从而能提供这两种肿瘤相关抗原给树突状细胞加工
提呈成肿瘤抗原肽，刺激T细胞产生WT1和Survivin特异性CTL反应；
[0029] 3)在本发明构建的重组腺病毒载体中，tWT1/Survivin融合基因进一步融合了溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal‑associated membrane protein,LAMP‑1)分类信号，在树突
+
状细胞加工处理该融合基因蛋白成为抗原肽后能通过内质网途径提呈抗原肽，刺激CD4 T
细胞的活化，有助于增强特异性CTL的功能；
+
状细胞加工处理该融合基因蛋白成为抗原肽后能通过内质网途径提呈抗原肽，刺激CD4 T
细胞的活化，有助于增强特异性CTL的功能；
[0030] 4)本发明构建的重组腺病毒载体还能够同时表达GM‑CSF，其为一种树突状细胞分化因子，能将树突状细胞前体细胞(如单核细胞)分化成树突状细胞，当编码GM‑CSF的腺病
毒载体感染单核细胞后能自分泌GM‑CSF，而不需要添加外源GM‑CSF即可以使单核细胞分化
成树突状细胞，大大简化实验操作和培养时间，36～48小时即可获得治疗性树突状细胞癌
症疫苗，因此耗时较短，成本十分低廉，适合推广应用；
毒载体感染单核细胞后能自分泌GM‑CSF，而不需要添加外源GM‑CSF即可以使单核细胞分化
成树突状细胞，大大简化实验操作和培养时间，36～48小时即可获得治疗性树突状细胞癌
症疫苗，因此耗时较短，成本十分低廉，适合推广应用；
[0031] 5)本发明构建的重组腺病毒载体还编码CD40L基因，CD40L是树突状细胞成熟的强烈诱导剂，能促使树突状细胞的成熟，上调树突状细胞的共刺激分子的表达，为T细胞提供
第二信号，促进和增强特异性CTL的功能；
第二信号，促进和增强特异性CTL的功能；
[0032] 6.本发明构建的重组腺病毒载体还编码4‑1BBL，在感染单核细胞后能表达4‑1BBL，与 T细胞的4‑1BB相互作用，促进T细胞的功能。
附图说明
[0033] 图1为pDC523 2×2A质粒的谱图；
[0034] 图2为pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒中由三个基因GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L 序列和2A肽序列串联形成的开放读框的结构示意图；
[0035] 图3为融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1的结构示意图；
[0036] 图4为pGBC‑IRES‑WSL质粒的谱图；
[0037] 图5为Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞后的基因表达和功能鉴定图，其中A幅为 Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞24小时后上清中GM‑CSF的ELISA染色图；B幅为 Ad5F35
GBC/WSL感染HEK 293T细胞24小时后流式细胞仪检测峰图；
GBC/WSL感染HEK 293T细胞24小时后流式细胞仪检测峰图；
[0038] 图6为Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞后tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的凝胶鉴定图，其中A幅为用WT1抗体检测的凝胶鉴定图；B幅为用Survivin抗体检测的凝胶鉴定
图；
图；
[0039] 图7为Ad5F35 GBC/WSL感染人外周血单核细胞后诱导其向树突状细胞分化的鉴定效果图，其中A幅为Ad5F35 GBC/WSL感染人外周血单核细胞后上清中GM‑CSF的ELISA染色
图；B幅为Ad5F35 GBC/WSL感染人外周血单核细胞后的显微镜观察照片；
图；B幅为Ad5F35 GBC/WSL感染人外周血单核细胞后的显微镜观察照片；
[0040] 图8为Ad5F35 GBC/WSL诱导树突状细胞的成熟的鉴定效果图，其中A幅为流式细胞仪检测细胞基因表达峰图；B幅为流式细胞仪检测细胞共刺激分子表达峰图。
具体实施方式
[0041] 本发明旨在提供一种治疗性癌症疫苗中的治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗及其制备方法，提供的治疗性树突状细胞癌症疫苗在感染人外周血来源的单核细胞后能够诱导
机体产生抗原特异性T淋巴细胞反应而发挥抗肿瘤作用，从而可以用于各种血液系统肿瘤
和实体肿瘤的治疗。
机体产生抗原特异性T淋巴细胞反应而发挥抗肿瘤作用，从而可以用于各种血液系统肿瘤
和实体肿瘤的治疗。
[0042] 为了实现上述目的，本发明人在充分考虑一种治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗必须能够同时提供T细胞活化的三类信号(肿瘤抗原、诱导DC成熟和激活的共刺激分子、诱
导抗肿瘤免疫反应的细胞因子)，又能够诱导高效的抗肿瘤免疫细胞反应，且操作简单、快
速，制备成本低的基础上，首先提供一种能够同时表达多种目的基因的重组质粒，其中该重
TM
组质粒以穿梭质粒pDC511为基础，从pcDNA3.1(‑)‑myc‑His B质粒(购自美国Invitrogen
公司) 中扩增人CMVp‑pA表达盒插入pDC511穿梭质粒中，并合成含2个2A肽和酶切位点的多
肽序列取代hCMVp‑pA表达盒中的多克隆位点，构建获得优化的穿梭质粒(pDC523 2×2A)。
随后将多种目的基因插入该优化的穿梭质粒中，不同的目的基因分别由2A肽序列间隔串联
起来，多个目的基因将由多个2A肽间隔串联形成一个开放读框，获得含目的基因的重组质
粒，进一步插入连接了核酸进入位点(IRES)的肿瘤相关抗原基因序列即为能够同时表达多
种目的基因和肿瘤相关抗原基因的穿梭质粒。随后将该含目的基因的穿梭质粒与骨架质粒
pBHGfrt(del)E1,3Cre或由该骨架质粒衍生而来的另一个骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3Cre
(5/F35)(购自北京本元正阳基因有限公司)通过磷酸钙转染法共转染至HEK 293T细胞，含
目的基因的穿梭质粒和骨架质粒会在HEK 293T细胞中通过Cre重组酶介导的同源重组，将
穿梭质粒的目的基因表达盒重组到骨架质粒的E1删除区，即可形成一个含有目的基因的完
整腺病毒载体，HEK 293T细胞会发生病理病变，形成空斑(Plague)，此过程通常10～14天。
细胞形成空斑后挑选出来，进一步感染HEK 293T细胞，几轮后即可挑选和扩增所需的溶瘤
腺病毒(即重组腺病毒)，将该重组腺病毒感染单核细胞即可获得本发明的治疗性DCs癌症
疫苗。
导抗肿瘤免疫反应的细胞因子)，又能够诱导高效的抗肿瘤免疫细胞反应，且操作简单、快
速，制备成本低的基础上，首先提供一种能够同时表达多种目的基因的重组质粒，其中该重
TM
组质粒以穿梭质粒pDC511为基础，从pcDNA3.1(‑)‑myc‑His B质粒(购自美国Invitrogen
公司) 中扩增人CMVp‑pA表达盒插入pDC511穿梭质粒中，并合成含2个2A肽和酶切位点的多
肽序列取代hCMVp‑pA表达盒中的多克隆位点，构建获得优化的穿梭质粒(pDC523 2×2A)。
随后将多种目的基因插入该优化的穿梭质粒中，不同的目的基因分别由2A肽序列间隔串联
起来，多个目的基因将由多个2A肽间隔串联形成一个开放读框，获得含目的基因的重组质
粒，进一步插入连接了核酸进入位点(IRES)的肿瘤相关抗原基因序列即为能够同时表达多
种目的基因和肿瘤相关抗原基因的穿梭质粒。随后将该含目的基因的穿梭质粒与骨架质粒
pBHGfrt(del)E1,3Cre或由该骨架质粒衍生而来的另一个骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3Cre
(5/F35)(购自北京本元正阳基因有限公司)通过磷酸钙转染法共转染至HEK 293T细胞，含
目的基因的穿梭质粒和骨架质粒会在HEK 293T细胞中通过Cre重组酶介导的同源重组，将
穿梭质粒的目的基因表达盒重组到骨架质粒的E1删除区，即可形成一个含有目的基因的完
整腺病毒载体，HEK 293T细胞会发生病理病变，形成空斑(Plague)，此过程通常10～14天。
细胞形成空斑后挑选出来，进一步感染HEK 293T细胞，几轮后即可挑选和扩增所需的溶瘤
腺病毒(即重组腺病毒)，将该重组腺病毒感染单核细胞即可获得本发明的治疗性DCs癌症
疫苗。
[0043] 以下通过具体实施例详细说明本发明。
[0044] 下述实施例中所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0045] 所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由生工生物工程有限公司完成。
[0046] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的
来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提
示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞均为离体的，
并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可
以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。
来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提
示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞均为离体的，
并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可
以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。
[0047] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明涉及的内容不限于下述的实施例。
[0048] 实施例1、穿梭质粒的改造
[0049] 该实施例为构建适合于编码多基因的腺病毒穿梭质粒，以AdMAXTM体系中的pDC511穿梭质粒(购自加拿大MicroBix公司)为基础，构建另一个穿梭质粒pDC523 2×2A，具体包
括以下步骤：
括以下步骤：
[0050] 1.1、合成一对引物，上游引物为5'‑gcg cta gct agctca ata ttg gcc att agc c‑3'(SEQ ID NO:1， 5′端引入Nhe I位点)、下游引物为5'‑gaa gat cta taa ctt cgt ata
atg tat gct ata cga agt tat cga tcg agc cat aga gcc c‑3'(SEQ ID NO:2，5′端引入
TM
BglII位点和LoxP序列)，以pcDNA3.1(‑)‑myc‑His B 质粒(Invitrogen )为模板，行PCR扩
增，扩增用高保真Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为98℃ 10s、72℃20s、72℃60s，30个循环，扩增
获得一1180bp大小的PCR片段(即CMVp‑pA表达盒)，该片段用Nhe I和BglII双酶切后胶回收
酶切片段(酶切片段1)，pDC511穿梭质粒用Xba I和BamH I双酶切后胶回收酶切大片段(酶
切片段2)，在连接酶存在下连接酶切片段1和酶切片段2，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶
切鉴定PCR片段插入pDC511质粒后测序，证实PCR 获得的CMVp表达盒序列正确，将获得的质
粒命名为pDC523。
atg tat gct ata cga agt tat cga tcg agc cat aga gcc c‑3'(SEQ ID NO:2，5′端引入
TM
BglII位点和LoxP序列)，以pcDNA3.1(‑)‑myc‑His B 质粒(Invitrogen )为模板，行PCR扩
增，扩增用高保真Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为98℃ 10s、72℃20s、72℃60s，30个循环，扩增
获得一1180bp大小的PCR片段(即CMVp‑pA表达盒)，该片段用Nhe I和BglII双酶切后胶回收
酶切片段(酶切片段1)，pDC511穿梭质粒用Xba I和BamH I双酶切后胶回收酶切大片段(酶
切片段2)，在连接酶存在下连接酶切片段1和酶切片段2，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶
切鉴定PCR片段插入pDC511质粒后测序，证实PCR 获得的CMVp表达盒序列正确，将获得的质
粒命名为pDC523。
[0051] 1.2、合成一段寡核苷酸片段，其包含两个2A肽序列(其中2A肽序列可为E2A、F2A、T2A 和P2A中的任一种或两种的组合，该实施例使用的是T2A和P2A肽序列)和多克隆位点
(该寡核苷酸片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示)，将该寡核苷酸片段用Nhe I
和Hind III双酶切后胶回收小片段(酶切片段3)，上述步骤1.1获得的pDC523质粒亦用Nhe
I和Hind III 双酶切后胶回收大片段(酶切片段4)，在连接酶存在下将酶切片段3和酶切片
段4连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定该寡核苷酸片段插入pDC523质粒后测
序，将序列正确的穿梭质粒命名为pDC523 2×2A质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，
如图1所示，示出了该pDC523 2×2A质粒的谱图，该pDC523 2×2A质粒用于以下实施例2中
用于插入目的基因。
(该寡核苷酸片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示)，将该寡核苷酸片段用Nhe I
和Hind III双酶切后胶回收小片段(酶切片段3)，上述步骤1.1获得的pDC523质粒亦用Nhe
I和Hind III 双酶切后胶回收大片段(酶切片段4)，在连接酶存在下将酶切片段3和酶切片
段4连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定该寡核苷酸片段插入pDC523质粒后测
序，将序列正确的穿梭质粒命名为pDC523 2×2A质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，
如图1所示，示出了该pDC523 2×2A质粒的谱图，该pDC523 2×2A质粒用于以下实施例2中
用于插入目的基因。
[0052] 实施例2、WT1、Survivin、GM‑CSF、CD40L和4‑1BBL基因的克隆
[0053] 该实施例为将目的基因WT1、Survivin、GM‑CSF、CD40L和4‑1BBL插入上述实施例1获得的pDC523 2×2A质粒中，具体包括以下步骤：
[0054] 2.1、抽取健康人外周血5ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs)，用 LPS(10ng/ml)刺激12小时后用RNA提取试剂盒(Qiagen)提取细胞总RNA，以此RNA为模
板，用逆转录试剂盒(Takara)合成cDNA，命名为PBMCs cDNA；用RNA提取试剂盒(Qiagen) 提
6
取1×10 个人K562白血病细胞的总RNA，以此RNA为模板，用逆转录试剂盒(Takara)合成
cDNA，命名为K562 cDNA。
板，用逆转录试剂盒(Takara)合成cDNA，命名为PBMCs cDNA；用RNA提取试剂盒(Qiagen) 提
6
取1×10 个人K562白血病细胞的总RNA，以此RNA为模板，用逆转录试剂盒(Takara)合成
cDNA，命名为K562 cDNA。
[0055] 2.2、该步骤共设计6对引物用于扩增目的基因和构建相关质粒，具体包括以下步骤：
[0056] 2.2.1、设计用于扩增GM‑CSF基因的引物，上游引物为5'‑cta gct agc atg tgg ctg cag agc ctg ctg‑3'(SEQ ID NO:5，5′端引入Nhe I位点)、下游引物为5'‑gga att
cct cct gga ctg gct ccc agc ag‑3' (SEQ ID NO:6，5′端引入EcoR I位点)，以上述步骤
2.1获得的PBMCs cDNA为模板，进行PCR 扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为
98℃10s、72℃20s、72℃20s，30 个循环，扩增获得一450bp大小的PCR片段，用Nhe I和EcoR
I双酶切后胶回收酶切片段， pDC523 2×2A质粒亦用Nhe I和EcoR I双酶切后胶回收大片
段，连接PCR片段和pDC523 2×2A 穿梭质粒片段，转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR
片段插入pDC523 2×2A质粒后测序，证实PCR获得的片段与人GM‑CSF序列(GenBank:NM_
000758，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)
完全一致，将获得的质粒命名为pDC523 GM‑CSF；
cct cct gga ctg gct ccc agc ag‑3' (SEQ ID NO:6，5′端引入EcoR I位点)，以上述步骤
2.1获得的PBMCs cDNA为模板，进行PCR 扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为
98℃10s、72℃20s、72℃20s，30 个循环，扩增获得一450bp大小的PCR片段，用Nhe I和EcoR
I双酶切后胶回收酶切片段， pDC523 2×2A质粒亦用Nhe I和EcoR I双酶切后胶回收大片
段，连接PCR片段和pDC523 2×2A 穿梭质粒片段，转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR
片段插入pDC523 2×2A质粒后测序，证实PCR获得的片段与人GM‑CSF序列(GenBank:NM_
000758，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)
完全一致，将获得的质粒命名为pDC523 GM‑CSF；
[0057] 2.2.2、设计用于扩增4‑1BBL基因的引物，上游引物为5'‑gcg cga aga tct atg gaa tac gcc tct gac gc‑3'(SEQ ID NO:9，5′端引入BglII位点)、下游引物为5'‑cgg gat
cct tcc gac ctc ggt gaa gg‑3' (SEQ ID NO:10，5′端引入BamH I位点)，以上述步骤2.1
的PBMCs cDNA为模板，进行PCR 扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为98℃
10s、72℃20s、72℃30s，30 个循环，扩增获得一770bp大小的PCR片段，该片段用Bgl II和
BamH I双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段7)，将上述步骤2.2.1获得的pDC523 GM‑CSF质
粒用BamH I位点酶切并去磷酸化处理后胶回收大片段(酶切片段8)，在连接酶存在下将酶
切片段7和酶切片段8连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pDC523
GM‑CSF质粒后测序，证实PCR 获得的片段与人4‑1BBL序列(GenBank:NM_003811，其核苷酸
序列如SEQ ID NO:11所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)完全一致，将获得的质
粒命名为pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL。
cct tcc gac ctc ggt gaa gg‑3' (SEQ ID NO:10，5′端引入BamH I位点)，以上述步骤2.1
的PBMCs cDNA为模板，进行PCR 扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为98℃
10s、72℃20s、72℃30s，30 个循环，扩增获得一770bp大小的PCR片段，该片段用Bgl II和
BamH I双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段7)，将上述步骤2.2.1获得的pDC523 GM‑CSF质
粒用BamH I位点酶切并去磷酸化处理后胶回收大片段(酶切片段8)，在连接酶存在下将酶
切片段7和酶切片段8连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pDC523
GM‑CSF质粒后测序，证实PCR 获得的片段与人4‑1BBL序列(GenBank:NM_003811，其核苷酸
序列如SEQ ID NO:11所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)完全一致，将获得的质
粒命名为pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL。
[0058] 2.2.3、设计用于扩增CD40L基因的引物，上游引物为5'‑cgc gga tcc atg atc gaa aca tac aac c‑3'(SEQ ID NO:13，5′端引入BamH I位点)、下游引物为5'‑ccg ctc
gag tca gag ttt gag taa gcc‑3' (SEQ ID NO:14，5′端引入Xho I位点)，以上述步骤2.1
的PBMCs cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为98℃10s、
72℃20s、72℃30s，30个循环，扩增获得一790bp大小的PCR片段，将该片段用BamH I和Xho I
双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段9)；将上述步骤2.2.2获得的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL质
粒用Bgl II和Xho I双酶切后胶回收大片段(酶切片段10)，在连接酶存在下将酶切片段9和
酶切片段10连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pDC523 GM‑CSF/4‑
1BBL质粒后测序，证实 PCR获得的片段与人CD40L序列(GenBank:NM_000074，其核苷酸序列
如SEQ ID NO:15所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)完全一致，将获得的质粒命
名为pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L，该质粒三个基因GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的序列分别由
两个2A 肽序列串联形成一个开放读框，其中三个基因GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的连接位置
可以互换(该实施例采用的连接顺序是GM‑CSF/T2A/4‑1BBL/P2A/CD40L，其核苷酸序列如
SEQ ID NO:17所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)，如图2所示，示出了该开放读
框的结构示意图。
gag tca gag ttt gag taa gcc‑3' (SEQ ID NO:14，5′端引入Xho I位点)，以上述步骤2.1
的PBMCs cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为98℃10s、
72℃20s、72℃30s，30个循环，扩增获得一790bp大小的PCR片段，将该片段用BamH I和Xho I
双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段9)；将上述步骤2.2.2获得的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL质
粒用Bgl II和Xho I双酶切后胶回收大片段(酶切片段10)，在连接酶存在下将酶切片段9和
酶切片段10连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pDC523 GM‑CSF/4‑
1BBL质粒后测序，证实 PCR获得的片段与人CD40L序列(GenBank:NM_000074，其核苷酸序列
如SEQ ID NO:15所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)完全一致，将获得的质粒命
名为pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L，该质粒三个基因GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的序列分别由
两个2A 肽序列串联形成一个开放读框，其中三个基因GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L的连接位置
可以互换(该实施例采用的连接顺序是GM‑CSF/T2A/4‑1BBL/P2A/CD40L，其核苷酸序列如
SEQ ID NO:17所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)，如图2所示，示出了该开放读
框的结构示意图。
[0059] 2.2.4、合成一段寡核苷酸片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示)，序列包含人LAMP‑1 基因的信号肽序列和溶酶体靶向序列，将该寡核苷酸片段用Nco I和Hind III酶切
后胶回收小片段(酶切片段11)，将pmRNA IRES‑EGFP质粒(Tan X,Wan Y.Enhanced protein
expression by internal ribosomal entry site‑driven mRNA translation as a
novel approach for in vitro loading of dendritic cells with antigens.Hum
Immunol.2008Jan；69(1):32‑40.)亦用Nco I和Hind III酶切后胶回收大片段(酶切片段
12)，将酶切片段11和酶切片段12连接，将酶切鉴定正确者命名为 pmRNA IRES‑LAMP‑1质
粒。
后胶回收小片段(酶切片段11)，将pmRNA IRES‑EGFP质粒(Tan X,Wan Y.Enhanced protein
expression by internal ribosomal entry site‑driven mRNA translation as a
novel approach for in vitro loading of dendritic cells with antigens.Hum
Immunol.2008Jan；69(1):32‑40.)亦用Nco I和Hind III酶切后胶回收大片段(酶切片段
12)，将酶切片段11和酶切片段12连接，将酶切鉴定正确者命名为 pmRNA IRES‑LAMP‑1质
粒。
[0060] 2.2.5、设计用于扩增tWT1基因的引物，上游引物为5'‑acg cgt cga cgg ctc cga cgt gcg gga cc‑3'(SEQ ID NO:20，5′端引入Sal I位点)、下游引物为5'‑gcg cgc gcg
cgc tct aga ctg aat gcc tct gaa gac acc g‑3'(SEQ ID NO:21，5′端引入Xba I位点)，
以上述步骤2.1获得的K562 cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩
增条件为98℃10s、72℃20s、72℃30s，30个循环，扩增获得一900bp大小的PCR片段，将该片
段用Sal I和Xba I双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段13)，将上述2.2.4获得的pmRNA
IRES‑LAMP‑1质粒亦用Sal I和Xba I双酶切后胶回收大片段(酶切片段14)，将酶切片段13
和酶切片段14连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pmRNA IRES‑
LAMP‑1质粒后测序，证实PCR获得的片段与人WT1氨基酸序列70～366(GenBank:NM_024426，
其核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)完全一致，是
一种截短的WT1基因(tWT1)，删除了WT1基因中的潜在致癌位点序列，将获得的质粒命名为
pmRNA IRES‑tWT1/LAMP‑1。
cgc tct aga ctg aat gcc tct gaa gac acc g‑3'(SEQ ID NO:21，5′端引入Xba I位点)，
以上述步骤2.1获得的K562 cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩
增条件为98℃10s、72℃20s、72℃30s，30个循环，扩增获得一900bp大小的PCR片段，将该片
段用Sal I和Xba I双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段13)，将上述2.2.4获得的pmRNA
IRES‑LAMP‑1质粒亦用Sal I和Xba I双酶切后胶回收大片段(酶切片段14)，将酶切片段13
和酶切片段14连接，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pmRNA IRES‑
LAMP‑1质粒后测序，证实PCR获得的片段与人WT1氨基酸序列70～366(GenBank:NM_024426，
其核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)完全一致，是
一种截短的WT1基因(tWT1)，删除了WT1基因中的潜在致癌位点序列，将获得的质粒命名为
pmRNA IRES‑tWT1/LAMP‑1。
[0061] 2.2.6、设计用于扩增Survivin基因的引物，上游引物为5'‑gga cta gtg gtg ccc cga cgt tgc ccc‑3'(SEQ ID NO:24，5′端引入Spe I位点)、下游引物为5'‑gcg cga aga
tct atc cat ggc agc cag ctg ctc g‑3'(SEQ ID NO:25，5′端引入BglII位点)，以上述步
骤2.1获得的K562 cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为
98℃10s、72℃20s、72℃20s， 30个循环，扩增获得一440bp大小的PCR片段，将该片段用Spe
I和BglII双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段15)，将上述步骤2.2.5获得的pmRNA IRES‑
tWT1/LAMP‑1质粒用Xba I和BglII 双酶切后胶回收大片段(酶切片段16)，连接酶切片段15
和酶切片段16，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pmRNA IRES‑tWT/
LAMP‑1质粒后测序，证实PCR获得的片段与人Survivin氨基酸全长序列(GenBank:NM_
001168，其核苷酸序列如SEQ ID NO:26 所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)完
全一致，将获得的质粒命名为pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1，该质粒含内部核酸进入
位点IRES序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示，其为mRNA翻译成蛋白质的引导序列)以
及靶向溶酶体途径的融合基因 tWT1/Survivin/LAMP‑1序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:
29所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，其中IRES序列的引入有助于重组腺病毒
在共表达GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L 同时有效地表达肿瘤相关抗原，从而使重组腺病毒编码
的四种目的基因获得充分的表达。如图3示出了该融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1序列的
结构示意图。
tct atc cat ggc agc cag ctg ctc g‑3'(SEQ ID NO:25，5′端引入BglII位点)，以上述步
骤2.1获得的K562 cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR酶(NEB)，扩增条件为
98℃10s、72℃20s、72℃20s， 30个循环，扩增获得一440bp大小的PCR片段，将该片段用Spe
I和BglII双酶切后胶回收酶切片段(酶切片段15)，将上述步骤2.2.5获得的pmRNA IRES‑
tWT1/LAMP‑1质粒用Xba I和BglII 双酶切后胶回收大片段(酶切片段16)，连接酶切片段15
和酶切片段16，随后转化至DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pmRNA IRES‑tWT/
LAMP‑1质粒后测序，证实PCR获得的片段与人Survivin氨基酸全长序列(GenBank:NM_
001168，其核苷酸序列如SEQ ID NO:26 所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)完
全一致，将获得的质粒命名为pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1，该质粒含内部核酸进入
位点IRES序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示，其为mRNA翻译成蛋白质的引导序列)以
及靶向溶酶体途径的融合基因 tWT1/Survivin/LAMP‑1序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:
29所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，其中IRES序列的引入有助于重组腺病毒
在共表达GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L 同时有效地表达肿瘤相关抗原，从而使重组腺病毒编码
的四种目的基因获得充分的表达。如图3示出了该融合基因tWT1/Survivin/LAMP‑1序列的
结构示意图。
[0062] 2.2.7、设计用于扩增IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1序列，上游引物为5'‑ccg ctc gag att ccg ccc ccc ccc ccc‑3'(SEQ ID NO:31，5′端引入XhoI位点)、下游引物为5'‑
gcg cgc gcc cgg ggt taa ctt aga tag tct ggt agc ctg cg‑3'(SEQ ID NO:32，5′端引
入Hpa I位点)，以上述步骤2.2.6获得的pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1为模板，进行
PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR 酶(NEB)，扩增条件为98℃10s、72℃20s、72℃60s，30个循
环，扩增获得一2130bp 大小的PCR片段，将该片段用Xho I和Hpa I双酶切后胶回收酶切片
段(酶切片段17)，将上述步骤2.2.3获得的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒亦用Xho I和
Hpa I双酶切后胶回收大片段(酶切片段18)，连接酶切片段17和酶切片段18，随后转化至
DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒后测序，将测
序正确的重组质粒命名为穿梭质粒pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L‑IRES‑tWT1/Survivin/
LAMP‑1，简称为穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，其核苷酸序列为SEQ ID NO:33所示，用于以下实
施例中重组腺病毒的构建以及治疗性DCs癌症疫苗的制备，如图4所示，示出了该重组质粒
pGBC‑IRES‑WSL的谱图。
gcg cgc gcc cgg ggt taa ctt aga tag tct ggt agc ctg cg‑3'(SEQ ID NO:32，5′端引
入Hpa I位点)，以上述步骤2.2.6获得的pmRNA IRES‑tWT1/Survivin/LAMP‑1为模板，进行
PCR扩增，扩增用高保真的Q5 PCR 酶(NEB)，扩增条件为98℃10s、72℃20s、72℃60s，30个循
环，扩增获得一2130bp 大小的PCR片段，将该片段用Xho I和Hpa I双酶切后胶回收酶切片
段(酶切片段17)，将上述步骤2.2.3获得的pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒亦用Xho I和
Hpa I双酶切后胶回收大片段(酶切片段18)，连接酶切片段17和酶切片段18，随后转化至
DH5α感受态，挑克隆酶切鉴定PCR片段插入pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L质粒后测序，将测
序正确的重组质粒命名为穿梭质粒pDC523 GM‑CSF/4‑1BBL/CD40L‑IRES‑tWT1/Survivin/
LAMP‑1，简称为穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL，其核苷酸序列为SEQ ID NO:33所示，用于以下实
施例中重组腺病毒的构建以及治疗性DCs癌症疫苗的制备，如图4所示，示出了该重组质粒
pGBC‑IRES‑WSL的谱图。
[0063] 该实施例中构建获得的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL中插入的是tWT1/Survivin/LAMP‑1融合基因作为肿瘤相关抗原，本领域技术人员应当理解，该实施例构建的穿梭质粒
pGBC‑IRES‑WSL中插入的肿瘤相关抗原的表达基因还可以为以下基因中的任一种tWT1、
Survivin、融合基因tWT1/Survivin(其核苷酸序列为SEQ ID NO:34所示，对应的氨基酸序
列如SEQ ID NO:35所示)、MUC1、LMP、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER‑2/neu、MAGE A3、 p53
(nonmutant和mutant)、NY‑ESO‑1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras mutant、 gp100、
Proteinase3(PR1)、bcr‑abl、Tyrosinase、PSA、hTERT、Sarcoma translocation
breakpoints、 EphA2、PAP、ML‑IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS fusion gene)、NA17、
PAX3、 ALK、Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP‑2、GD3、
Fucosyl GM1、Mesothelin、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1和GM3。
pGBC‑IRES‑WSL中插入的肿瘤相关抗原的表达基因还可以为以下基因中的任一种tWT1、
Survivin、融合基因tWT1/Survivin(其核苷酸序列为SEQ ID NO:34所示，对应的氨基酸序
列如SEQ ID NO:35所示)、MUC1、LMP、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER‑2/neu、MAGE A3、 p53
(nonmutant和mutant)、NY‑ESO‑1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras mutant、 gp100、
Proteinase3(PR1)、bcr‑abl、Tyrosinase、PSA、hTERT、Sarcoma translocation
breakpoints、 EphA2、PAP、ML‑IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS fusion gene)、NA17、
PAX3、 ALK、Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP‑2、GD3、
Fucosyl GM1、Mesothelin、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1和GM3。
[0064] 实施例3、能够同时表达多基因的重组腺病毒载体的构建
[0065] 该实施例按AdMaxTMCre重组腺病毒系统说明书进行表达编码多基因的重组腺病毒的构建。将上述实施例2获得的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL用质粒中提试剂盒(EndoFree
Plasmid Midi Kit,QIAGEN)提取质粒，测定260/280比值在1.9左右，将质粒浓度调整至1μ
g/μl； pBGHfrt△E1,3Cre(用于构建5型腺病毒载体)(购自加拿大Microbix公司)和
pBGHfrt△E1, 3Cre(5/F35)(用于构建5/F35型腺病毒载体，北京本元正阳基因有限公司购
买)腺病毒骨架质粒用质粒大提试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit,QIAGEN)提取质粒，
测定260/280比值在1.9左右，将质粒浓度调整至1μg/μl。将低代数(小于10代)的HEK 293T
3
细胞(购自加拿大Microbix公司)传代至60mm的培养皿中，至细胞融合至60‑70％时将穿梭
质粒 pGBC‑IRES‑WSL和骨架质粒pBGHfrt△E1,3Cre或pBGHfrt△E1,3Cre(5/F35)通过磷酸
TM
钙沉淀法(CalPhos Mammalian Transfection Kit,ClonTech)进行转染。转染体系如下表1
所示，转染体系配制完毕后，共孵育10分钟后加入HEK 293T细胞中进行转染。
Plasmid Midi Kit,QIAGEN)提取质粒，测定260/280比值在1.9左右，将质粒浓度调整至1μ
g/μl； pBGHfrt△E1,3Cre(用于构建5型腺病毒载体)(购自加拿大Microbix公司)和
pBGHfrt△E1, 3Cre(5/F35)(用于构建5/F35型腺病毒载体，北京本元正阳基因有限公司购
买)腺病毒骨架质粒用质粒大提试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit,QIAGEN)提取质粒，
测定260/280比值在1.9左右，将质粒浓度调整至1μg/μl。将低代数(小于10代)的HEK 293T
3
细胞(购自加拿大Microbix公司)传代至60mm的培养皿中，至细胞融合至60‑70％时将穿梭
质粒 pGBC‑IRES‑WSL和骨架质粒pBGHfrt△E1,3Cre或pBGHfrt△E1,3Cre(5/F35)通过磷酸
TM
钙沉淀法(CalPhos Mammalian Transfection Kit,ClonTech)进行转染。转染体系如下表1
所示，转染体系配制完毕后，共孵育10分钟后加入HEK 293T细胞中进行转染。
[0066] 表1：转染体系
[0067]
[0068] 转染结束后，按下表2所示体系配制含琼酯糖的培养液。
[0069] 表2：含琼酯糖的培养液体系
[0070]
[0071] 上表2中A液用微波炉煮沸溶解后，放至44℃的水浴中，待温度降至44℃后，取30ml 与放置在44℃的B液混合；吸取上述转染质粒后各培养皿中的培养液，将15ml的A/B混合液
加入各培养皿中。
加入各培养皿中。
[0072] 将各培养皿放置在37℃、5％CO2培养箱中培养，含琼酯糖的培养基将形成固态状，定期观察培养皿中细胞的状况，大约在10～14天左右形成空斑(plagues)，挑出空斑，在HEK
293T 细胞中进一步扩增，取部分细胞提取病毒DNA进行PCR鉴定，正确克隆命名为Ad5 GBC/
WSL(5型)或Ad5F35 GBC/WSL(5/F35型)，经2轮或3轮扩增后，收集HEK 293T细胞冻溶裂解，
TM
用腺病毒纯化试剂盒(ViraBind Adenovirus Purification Kit，Cell Biolabs，Inc) 纯
化腺病毒后分别获得两种类型的重组腺病毒[即Ad5GBC/WSL(5型)或Ad5F35 GBC/WSL(5/
F35型)两种类型]，将该重组腺病毒感染人外周来源的血单核细胞即可获得治疗性DCs癌症
疫苗。以下实施例对这两种类型的重组腺病毒进行表达和功能鉴定。
293T 细胞中进一步扩增，取部分细胞提取病毒DNA进行PCR鉴定，正确克隆命名为Ad5 GBC/
WSL(5型)或Ad5F35 GBC/WSL(5/F35型)，经2轮或3轮扩增后，收集HEK 293T细胞冻溶裂解，
TM
用腺病毒纯化试剂盒(ViraBind Adenovirus Purification Kit，Cell Biolabs，Inc) 纯
化腺病毒后分别获得两种类型的重组腺病毒[即Ad5GBC/WSL(5型)或Ad5F35 GBC/WSL(5/
F35型)两种类型]，将该重组腺病毒感染人外周来源的血单核细胞即可获得治疗性DCs癌症
疫苗。以下实施例对这两种类型的重组腺病毒进行表达和功能鉴定。
[0073] 实施例4、Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L表达鉴定
[0074] 该实施例利用上述实施例3获得的纯化后的腺病毒Ad5F35 GBC/WSL感染HEK293T细胞，以进行表达和功能鉴定，具体包括以下步骤：
[0075] 4.1、将HEK 293T细胞传至6孔板中(两个复孔)，细胞密度为1×106/3ml/孔，等细胞贴壁后，按100pfu/cell的病毒滴度加入Ad5F35 GBC/WSL，继续培养24小时后，收集上清
用ELISA检测GM‑CSF的表达，收集细胞进行流式细胞仪检测4‑1BBL和CD40L。
用ELISA检测GM‑CSF的表达，收集细胞进行流式细胞仪检测4‑1BBL和CD40L。
[0076] 4.2、将步骤4.1收集的上清按原液、10倍稀释和100倍稀释后行ELISA(深圳达科为) 检测，结果如图5中A幅所示，可见Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞24小时后，HEK
6
293T细胞能分泌大量的GM‑CSF，分泌量可达10～15ng/1×10cells/ml/24h。
6
293T细胞能分泌大量的GM‑CSF，分泌量可达10～15ng/1×10cells/ml/24h。
[0077] 4.3、将步骤4.1收集的细胞用0.25％胰酶+0.01％EDTA消化，使其成为单细胞悬液，用 PBS洗两次，用人4‑1BBL‑PE(BD)和CD40L‑PE(BD)染色后进行流式细胞仪检测，结果
如图5中B幅所示，可见Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞24小时后能有效地表达人 4‑
1BBL和CD40L。
如图5中B幅所示，可见Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞24小时后能有效地表达人 4‑
1BBL和CD40L。
[0078] 按照以上方法，使用上述实施例3获得的纯化后的Ad5GBC/WSL感染HEK 293T细胞后对GM‑CSF、4‑1BBL和CD40L表达情况进行鉴定，获得同上述Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T
细胞类似的结果。
细胞类似的结果。
[0079] 实施例5、Ad5F35 GBC/WSL感染HEK 293T细胞后检测tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的表达
[0080] 该实施例利用上述实施例3获得的纯化后的腺病毒Ad5F35 GBC/WSL感染HEK293T细胞，随后利用Western blot检测tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的表达情况，具体包括
以下步骤：
以下步骤：
[0081] 5.1、将1×106个HEK 293T细胞传至6孔板中，将Ad5F35 GBC/WSL按100pfu/cell的病毒滴度加入HEK 293T细胞中，培养48小时收集HEK 293T细胞进行Western blot检测
tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的表达，其中分别用WT1和Survivin抗体检测。
tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的表达，其中分别用WT1和Survivin抗体检测。
[0082] 5.2、WT1抗体采用R&D的兔多克隆抗体(AF5729)，结果如图6中A幅所示，可见感染了Ad5F35 GBC/WSL的HEK 293T细胞(B泳道)显示一条约55KDa的条带带，与 tWT1/
Survivin/LAMP‑1融合蛋白预测的分子量一致(55kDa)，而未感染病毒的HEK 293T 细胞无
任何条带显示(A泳道)。为证明WT1抗体的可靠性，我们用K562细胞作为阳性对照，K562细胞
表达野生型的WT1，Western Blot可检测到一条比tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的分子
量要小的特异性条带(43kDa)(C泳道)。
Survivin/LAMP‑1融合蛋白预测的分子量一致(55kDa)，而未感染病毒的HEK 293T 细胞无
任何条带显示(A泳道)。为证明WT1抗体的可靠性，我们用K562细胞作为阳性对照，K562细胞
表达野生型的WT1，Western Blot可检测到一条比tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的分子
量要小的特异性条带(43kDa)(C泳道)。
[0083] 5.3、Survivin抗体采用R&D的兔多克隆抗体(AF886)，结果如图6中B幅所示，可见感染了Ad5F35 GBC/WSL的HEK 293T细胞(B泳道)显示两条带，一条为野生型Survivin 蛋白
(分子量约为19kDa)，另一条带的大小为55kDa，与tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白预测的
分子量一致，而未感染病毒的HEK 293T细胞(A泳道)也显示二条条带，其中一条为野生型
Survivin蛋白条带、另外一条约51kDa不明的条带(抗体说明书给出的图片亦存在此带)。
(分子量约为19kDa)，另一条带的大小为55kDa，与tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白预测的
分子量一致，而未感染病毒的HEK 293T细胞(A泳道)也显示二条条带，其中一条为野生型
Survivin蛋白条带、另外一条约51kDa不明的条带(抗体说明书给出的图片亦存在此带)。
[0084] 按照以上方法，使用上述实施例3获得的纯化后的Ad5 GBC/WSL感染HEK 293T细胞后对tWT1/Survivin/LAMP‑1融合蛋白的表达情况进行鉴定，获得同上述Ad5F35 GBC/WSL
感染HEK 293T细胞类似的结果。
感染HEK 293T细胞类似的结果。
[0085] 实施例6、Ad5F35 GBC/WSL感染人外周血单核细胞后诱导其向树突状细胞分化
[0086] 该实施例采用上述实施例3获得的纯化后的腺病毒Ad5F35 GBC/WSL对人外周血单核细胞进行感染，观察该人外周血单核细胞的分化情况，具体包括以下步骤：
[0087] 6.1、采集健康人外周血10ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMCs)，按1×6
10/ml 的细胞密度接种至培养皿中，将Ad5F35 GBC/WS按100pfu/cell的病毒滴度加入单
核细胞中，分别在培养36小时和72小时收集培养上清用ELISA检测GM‑CSF的含量，结果如图
7中A 幅所示，可见Ad5F35 GBC/WS感染单核细胞后36小时至72小时仍然有大量的GM‑CSF分
泌。
10/ml 的细胞密度接种至培养皿中，将Ad5F35 GBC/WS按100pfu/cell的病毒滴度加入单
核细胞中，分别在培养36小时和72小时收集培养上清用ELISA检测GM‑CSF的含量，结果如图
7中A 幅所示，可见Ad5F35 GBC/WS感染单核细胞后36小时至72小时仍然有大量的GM‑CSF分
泌。
[0088] 6.2、当Ad5F35 GBC/WS感染单核细胞36小时后，在显微镜下观察，如图7中B幅所示，可见单核细胞的形态逐步显现伸出伪足和树突状，并成簇生长，表明单核细胞向树突状
细胞的分化。
细胞的分化。
[0089] 按照以上方法，使用上述实施例3获得的纯化后的Ad5GBC/WSL感染人外周血单核细胞后对细胞向树突状细胞的分化情况进行检测，获得同上述Ad5F35 GBC/WSL感染人外周
血单核细胞类似的结果，即单核细胞向树突状细胞的分化。
血单核细胞类似的结果，即单核细胞向树突状细胞的分化。
[0090] 实施例7、Ad5F35 GBC/WSL诱导树突状细胞的成熟
[0091] 该实施例采用上述实施例3获得的纯化后的腺病毒Ad5F35 GBC/WSL对人外周血单核细胞进行感染，观察Ad5F35 GBC/WSL诱导树突状细胞的成熟情况，具体包括以下步骤：
[0092] 7.1、采集健康人外周血10ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMCs)，按1×6
10/ml 的细胞密度接种至培养皿中，将Ad5F35 GBC/WSL按100pfu/cell的病毒滴度加入单
核细胞中，分别在培养36小后收集细胞进行细胞基因表达的鉴定，结果如图8中A幅所示，可
见单核细胞均明显表达4‑1BBL和CD40L，单核细胞仍然呈现CD14表型。
10/ml 的细胞密度接种至培养皿中，将Ad5F35 GBC/WSL按100pfu/cell的病毒滴度加入单
核细胞中，分别在培养36小后收集细胞进行细胞基因表达的鉴定，结果如图8中A幅所示，可
见单核细胞均明显表达4‑1BBL和CD40L，单核细胞仍然呈现CD14表型。
[0093] 7.2、当Ad5F35 GBC/WSL感染单核细胞36小时后，对共刺激分子表型进行流式细胞检测分析，结果如图8中B幅所示，可见CD40、CD80和CD83明显上调，而CD86和HLA‑DR 本身表
达就很高，感染Ad5F35 GBC/WSL后无明显改变，表明Ad5F35 GBC/WSL感染单核细胞后除诱
导向树突状细胞的分化外，还上调多种共刺激分子的表达，诱导树突状细胞的成熟，成熟的
树突状细胞可加工、处理表达的肿瘤相关抗原，并把抗原信息递呈给T细胞，能有效激活初
始T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
达就很高，感染Ad5F35 GBC/WSL后无明显改变，表明Ad5F35 GBC/WSL感染单核细胞后除诱
导向树突状细胞的分化外，还上调多种共刺激分子的表达，诱导树突状细胞的成熟，成熟的
树突状细胞可加工、处理表达的肿瘤相关抗原，并把抗原信息递呈给T细胞，能有效激活初
始T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
[0094] 按照以上方法，使用上述实施例3获得的纯化后的Ad5GBC/WSL感染人外周血单核细胞后对诱导树突状细胞的成熟情况进行检测，获得同上述Ad5F35 GBC/WSL感染人外周血
单核细胞类似的结果，即Ad5GBC/WSL感染人外周血单核细胞后可以上调多种共刺激分子的
表达，诱导树突状细胞的成熟。
单核细胞类似的结果，即Ad5GBC/WSL感染人外周血单核细胞后可以上调多种共刺激分子的
表达，诱导树突状细胞的成熟。
[0095] 综上实施例所述，本发明提供一种能够同时表达多种目的基因的重组腺病毒，可以在一次表达时同时获得肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑
1BBL，将该重组腺病毒感染人外周血单核细胞后能够利用其表达的GM‑CSF诱导单核细胞向
树突状细胞分化，并且诱导分化产生的树突状细胞可加工、处理表达的肿瘤相关抗原，并把
抗原信息递呈给T细胞；而表达的CD40L诱导DCs成熟以及表达的4‑1BBL有助于刺激T细胞的
活化，实现最佳的T细胞激活效果，由此获得一种治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗，该治疗
性树突状细胞(DCs)癌症疫苗能够通过诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞而发挥抗肿瘤
作用，进而可以治疗各种血液系统肿瘤和实体肿瘤，例如包括但不限于急性髓系白血病、慢
性髓系白血病和高危型骨髓增生异常综合征(MDS)等的WT1和/或Survivin阳性的血液系统
肿瘤，和包括但不限于肺癌、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈
癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、各类恶性肉瘤等的
WT1和/或Survivin阳性的实体肿瘤。因此，本发明提供的重组腺病毒以及治疗性树突状细
胞(DCs)癌症疫苗等均可以用作制备治疗上述这些血液系统肿瘤和实体肿瘤的药物。当施
用治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗时，可以采用皮内注射和静脉内注射的方式，其中皮下
7
注射方式为1～3×10个树突状细胞用1ml的生理盐水重悬，腹股沟和腋窝附近的皮内多点
7
注射(6～8个点)，每个部位注射约150μl左右；静脉内注射则将1～3×10个树突状细胞重
悬至100ml的生理盐水，半小时左右输注完毕。
1BBL，将该重组腺病毒感染人外周血单核细胞后能够利用其表达的GM‑CSF诱导单核细胞向
树突状细胞分化，并且诱导分化产生的树突状细胞可加工、处理表达的肿瘤相关抗原，并把
抗原信息递呈给T细胞；而表达的CD40L诱导DCs成熟以及表达的4‑1BBL有助于刺激T细胞的
活化，实现最佳的T细胞激活效果，由此获得一种治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗，该治疗
性树突状细胞(DCs)癌症疫苗能够通过诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞而发挥抗肿瘤
作用，进而可以治疗各种血液系统肿瘤和实体肿瘤，例如包括但不限于急性髓系白血病、慢
性髓系白血病和高危型骨髓增生异常综合征(MDS)等的WT1和/或Survivin阳性的血液系统
肿瘤，和包括但不限于肺癌、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈
癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、各类恶性肉瘤等的
WT1和/或Survivin阳性的实体肿瘤。因此，本发明提供的重组腺病毒以及治疗性树突状细
胞(DCs)癌症疫苗等均可以用作制备治疗上述这些血液系统肿瘤和实体肿瘤的药物。当施
用治疗性树突状细胞(DCs)癌症疫苗时，可以采用皮内注射和静脉内注射的方式，其中皮下
7
注射方式为1～3×10个树突状细胞用1ml的生理盐水重悬，腹股沟和腋窝附近的皮内多点
7
注射(6～8个点)，每个部位注射约150μl左右；静脉内注射则将1～3×10个树突状细胞重
悬至100ml的生理盐水，半小时左右输注完毕。
[0096] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可
以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的
保护范围之内。
以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的
保护范围之内。