一种治疗肾间质纤维化的黑人参提取物、黑人参速释微丸及其应用

摘要

本发明提供了一种治疗肾间质纤维化的黑人参提取物、黑人参速释微丸及其应用，属于药物技术领域。黑人参提取物以超声提取法从黑人参中高效提取人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1。本发明还提供了黑人参速释微丸，包括以下质量百分含量的组分：所述黑人参提取物15％～35％、微晶纤维素25％～47％、乳糖23％～26％、交联羧甲基淀粉钠5％～8％、低取代羟丙基纤维素5％～8％和余量的体积分数50％～65％乙醇水溶液。通过体内外实验考察其干预肾间质纤维化的药效作用及药理机制，表明黑人参提取物或黑人参速释微丸有制备治疗肾间质纤维化的药物的潜力。

权利要求

1.一种用于治疗肾间质纤维化的黑人参速释微丸，其特征在于，包括以下质量百分含量的组分：黑人参提取物25％、微晶纤维素36％、乳糖24％、交联羧甲基淀粉钠7％、低取代羟丙基纤维素7％和余量的50％乙醇水溶液；

 

所述黑人参提取物，包括人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1；所述Rg3的含量为1.14～7.62mg﹒g‑1 ‑1  ‑1

；所述Rg5的含量为1.22～8.38mg﹒g  ；所述Rk1的含量为0.52～8.26mg﹒g ；所述人参皂 ‑1

苷的总含量为2.92～24.26mg﹒g 。

2.根据权利要求1所述黑人参速释微丸，其特征在于，所述黑人参提取物的制备方法，包括以下步骤：

黑人参粉末和体积分数50％～70％乙醇水溶液混合，在40～80KHz条件超声提取20～

50min，提取3～4次，合并提取液后滤过，得到滤液，滤液浓缩后冷冻干燥，得到黑人参提取物；

所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：(10～20)mL。

3.根据权利要求2所述黑人参速释微丸，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积分数为

55％～65％；所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：(15～20)mL；所述超声的频率为60～80KHz；单次超声提取的时间为35～48min。

4.根据权利要求2所述黑人参速释微丸，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积分数为

65％，所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：20mL，提取3次，单次超声提取的时间为48min，超声的频率为80KHz。

5.根据权利要求2或3所述黑人参速释微丸 ，其特征在于，所述黑人参为4年生以上的人参炮制所得；所述黑人参包括有须黑人参和无须黑人参。

6.根据权利要求1所述黑人参速释微丸，其特征在于，所述黑人参速释微丸为棕黄色丸剂，外观圆整、均匀，粒径为0.09～0.13mm，崩解时间小于30s，累积溶出度10min大于90％。

7.权利要求1～6任意一项所述黑人参速释微丸在制备治疗肾间质纤维化的药物中的应用。

说明书

一种治疗肾间质纤维化的黑人参提取物、黑人参速释微丸及

其应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及一种治疗肾间质纤维化的黑人参提取物、黑人参速释微丸及其应用。

背景技术

[0002] 慢性肾病(Chronic kindey disease，CKD)是临床面临的严重问题，目前肾纤维化尤其是肾小管间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)公认为是终末期肾病(End 
stage renal disease，ESRD)的常见途径，其中肾纤维化的发展过程与CKD的发生显著相
关。RIF是不断变化循序渐进的过程，其特征是肾小管中持续生成活化的肌成纤维细胞
(myofibroblast)和过量的细胞外基质 (Extracellularmatrix，ECM)，而活化的肌成纤维
细胞被认为是RIF发病机制的主要因素。活化的肌成纤维细胞起源仍不明确，有证据表明它
们可能起源于上皮‑间充质转分化(Epithelial mesenehymal transition，EMT)。EMT的发
展经历以下过程：①E‑cadherin的严重丢失；②α‑SMA的高度表达；③肾小球基底膜(TBM)被
严重破坏；④有所增强的细胞迁移和侵袭能力。在EMT 过程中，肾小管上皮细胞和毛细血管
内皮细胞首先逐渐转变为间充质细胞，其在表型和功能上呈现肌成纤维细胞特征。目前的
研究也证实EMT受多种细胞因子调节。TGF‑β1被广泛接受为必需的纤维化因子，TGF‑β1及其
下游的Smad3表达已被证实是纤维发生中的主要调控因素。TGF‑β1信号通过 Smad与非Smad
通路向细胞内转导，肌成纤维细胞标志物增加，ECM合成增加；TGF‑β1使肌成纤维细胞的数
量增加，促进来自骨髓生成的纤维细胞募集。在受伤的肾组织中观察到TGF‑β1高度上调，其
下游Smad级联反应普遍存在严重的肾纤维化。Smads蛋白家族中参与TGF‑β1信号转导的有 
Smad2、3、4、6、7，相关研究发现，肾纤维化受Smad2和Smad3的正向调节和Smad7的负向调节。
有证据表明，在患者和动物疾病模型中，TGF‑β1 可以启动并完成整个EMT过程。因此，干预
TGF‑β1/Smads诱导的EMT过程被认为是治疗各种抗纤维化的靶点。

[0003] 人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，归脾、肺、心经；具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神的功效。黑人参(Black ginseng，BG)是鲜人参通
过反复蒸制、烘干制备的一种人参炮制品。黑人参质地坚韧、通体色黑。人参经九蒸九晒炮
制为黑人参后，其抗炎，抗氧化及降低血糖等功效显著增强。黑人参在炮制条件下，人参中
原来的常见皂苷类组分发生转变，其中人参苷Rg3、Rg5、Rk1及达玛烷苷元PPT、PPD含量较
高，人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1是黑人参中新出现的主要特征性皂苷，药理作用多且显著，具有
改善血液流变学、抗细胞凋亡和抗血小板聚集、改善微循环和抗凝血等作用。黑人参的提取
方法在吉林省地方标准黑参中(DB 22/T 2758‑2017)，采用的是中国药典中人参含量测定
方法项下供试品溶液的制备方法，此方法提取分离时间长，步骤多且目标成分在基质内、外
的浓度梯度比较大，对皂苷类成分提取不够彻底。中药常用的回流提取法利用溶液处于沸
腾状态，使溶液与基质间的扰动加强，减少了基质表面流体膜的扩散阻力，但此法由于提取
到一定阶段溶液缺乏浓度梯度，不利于成分的进一步溶出，采用该法提取黑人参时，稀有人
参皂苷Rg3、Rg5、Rk1总含量低。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效提取治疗肾间质纤维化的黑人参提取物(Black ginseng extract，BGE)的方法，其主要成分人参皂苷Rg3、 Rg5、Rk1具有较高的
提取率。

[0005] 本发明的目的还在于提供一种药物成分释放快、收率高的黑人参速释微丸。

[0006] 本发明的目的还在于提供黑人参提取物或黑人参速释微丸在制备治疗肾间质纤维化疾病的药物中的应用。

[0007] 本发明提供了黑人参提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 黑人参粉末和体积分数50％～70％乙醇水溶液混合，在40～80KHz条件超声提取20～50min，提取3～4次，合并提取液后滤过，得到滤液，滤液浓缩，冷冻干燥，得到黑人参提
取物；

[0009] 所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：(10～20)mL。

[0010] 优选的，所述乙醇水溶液的体积分数为55％～65％；所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：(15～20)mL；所述超声的频率为60～80 KHz；单次超声提取的时间
为35～48min。

[0011] 优选的，所述乙醇水溶液的体积分数为65％，所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：20mL，提取3次，单次超声提取的时间为48 min，超声的频率为80KHz。

[0012] 优选的，所述黑人参为4年生以上人参炮制所得；所述黑人参包括有须黑人参和无须黑人参。

[0013] 本发明提供了所述制备方法制备得到的黑人参提取物，包括人参皂苷 Rg3、Rg5和‑1 ‑1
Rk1；所述Rg3的含量为1.14～7.62mg﹒g ；所述Rg5的含量为1.22～8.38mg﹒g ；所述Rk1的
‑1 ‑1
含量为0.52～8.26mg﹒g ；所述人参皂苷的总含量为2.92～24.26mg﹒g 。

[0014] 本发明提供了一种用于治疗肾间质纤维化的黑人参速释微丸，包括以下质量百分含量的组分：所述黑人参提取物15％～35％、微晶纤维素 25％～47％、乳糖23％～26％、交
联羧甲基淀粉钠5％～8％、低取代羟丙基纤维素5％～8％和余量的体积分数50％～70％乙
醇水溶液。

[0015] 优选的，包括以下百分含量的组分：所述黑人参提取物25％、微晶纤维素36％、乳糖24％、交联羧甲基淀粉钠7％、低取代羟丙基纤维素7％和余量的50％乙醇水溶液。

[0016] 优选的，所述黑人参速释微丸为棕黄色丸剂，外观圆整、均匀，粒径为0.09～0.13mm，崩解时间为30s，累积溶出度10min大于90％。

[0017] 本发明提供了所述黑人参提取物或所述黑人参速释微丸在制备治疗肾间质纤维化的药物中的应用。

[0018] 本发明提供了黑人参提取物的制备方法，充分考虑溶剂中乙醇浓度、乙醇用量(料液比)、超声频率和单次超声时间对黑人参中人参皂苷Rg3、Rg5、 Rk1含量的影响，以稀有人
参皂苷Rg3、Rg5、Rk1总含量为依据，以各因素无相互作用且对设计结果干扰少作为设计前
提，得到人参皂苷Rg3、Rg5、 Rk1提取率较高的提取方法。本发明采用超声提取方法提取效
率最高，相比于传统的回流醇提法，工艺稳定，操作简单，方法可行，结果可靠，此结果可为
黑人参地方标准中样品制备方法的修订提供依据。所建立的延边产黑人参中稀有人参皂苷
Rg3、Rg5、Rk1含量测定方法准确、简单、可靠、重复性好，可用于黑人参药材中标志性成分含
量测定，其结果可为其质量控制、合理用药及进一步研究开发提供参考。

[0019] 进一步的，本发明具体限定了原料黑人参来源的生长年限和黑人参有无须根。以外标法计算稀有人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1总含量，测定结果表明，上述三种稀有皂苷含量比
较，黑人参的须根明显多于主根，5年生多于4年生黑人参。

[0020] 本发明提供的黑人参速释微丸，包括以下质量百分含量的组分：所述黑人参提取物15％～35％、微晶纤维素25％～47％、乳糖23％～26％、交联羧甲基淀粉钠5％～8％、低
取代羟丙基纤维素5％～8％和余量的体积分数 50％～65％乙醇水溶液。本发明以收率和
崩解时间为考察指标，综合评分评价黑人参速释微丸的药物释放性能。所述黑人参速释微
丸为棕黄色丸剂，外观圆整、均匀，粒径为0.09～0.13mm，崩解时间为30s，累积溶出度10min 
大于90％。HPLC法测定黑人参速释微丸中3种稀有皂苷含量，本品含人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1
‑1 ‑1 ‑1
应不低于0.295mg﹒g 、0.294mg﹒g 、0.142mg﹒g 。

[0021] 本发明提供了所述黑人参提取物或所述黑人参速释微丸在制备治疗肾间质纤维化的药物中的应用。空白组(Control)、模型组(ADR)和阳性对照组为对照，以高剂量、中剂
量和低剂量给药黑人参提取物为实验组，灌胃给药连续9周进行检测。以尿蛋白排泄量和尿
素氮(BUN)、血肌酐(SCr)的含量作为生理生化检测指标结果表明，ADR组大鼠24h尿蛋白排
泄量较Control 组显著升高(P<0.05)；实验后9W，给药组大鼠24h尿蛋白排量较ADR组均显
著降低(P<0.05)，BGE高剂量组最为显著；ADR组较Control组大鼠血清 BUN含量增加显著(P
<0.05)，各给药组同ADR组相比，能够显著下降BUN 水平(P<0.05)；ADR组较Control组大鼠
Scr水平明显升高(P<0.05)，各给药组同ADR组相比，能够显著降低Scr的含量(P<0.05)。肾
组织病理检测结果表明，ADR组肾小管形态丢失，同时可见明显的肾小管扩张，上皮细胞凋
亡坏死，细胞丢失，肾间质发现异常变化；给予不同剂量BGE后，各病理变化有不同程度转
好，间质纤维化程度减轻；BGE高剂量组较HKSX、LOS 组改善作用更为显著。ADR组大鼠肾脏
明显有大量的胶原纤维富积于肾小管周围，肾间质变宽，并且胶原纤维变多，大量蛋白管
型，肾脏间质以弥漫性分布；各给药组的胶原沉积和纤维化面积明显低于ADR组，且BGE高剂
量组仅有少量丝状纤维沉积，改善作用最为显著。同时免疫组化结果表明，与ADR组相比，
BGE给药组以剂量依赖性方式阻止α‑SMA和COL‑Ⅰ蛋白水平升高，且与其他给药组比较，BGE
高剂量组对蛋白的转变最显著 (P<0.05)。半定量分析结果显示，ADR组大鼠肾组织中α‑SMA
和COL‑Ⅰ的平均阳性面积表达率显著高于Control组，而BGE给药组大鼠肾组织中α‑SMA和
COL‑Ⅰ平均阳性面积表达率显著低于ADR组(P<0.05)。BGE对 TGF‑β1/Smads信号通路的激活
具有显著干预作用，从而通过TGF‑β1/Smad 信号通路抑制纤维化过程。BGE以剂量依赖性方
式改善ADR诱导的RIF进程，对肾功能具有保护作用，这与其调控TGF‑β1/Smad3信号通路有
关。

附图说明

[0022] 图1为稀有皂苷人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1标准曲线，图1A‑人参皂苷 Rg3；图1B‑人参皂苷Rg5；图1C‑人参皂苷Rk1；

[0023] 图2为混合对照品与供试品溶液HPLC图；A‑混合对照品，B‑供试品； 1‑Rg3，2‑Rk1，3‑Rg5；

[0024] 图3为空白、对照品及供试品溶液HPLC色谱图；图3A为空白组HPLC 色谱图；图3B为对照品HPLC色谱图；图3C为供试品溶液HPLC色谱图；

[0025] 图4为大鼠24h尿蛋白排泄量(n＝10)，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001VS Control；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001VSModel；

[0026] 图5为大鼠血清Scr、BUN的含量变化(n＝10)；##P<0.01VSControl； *P<0.05，**P<0.01VS Model；

[0027] 图6为各组大鼠肾脏病理变化(200x)，a‑Control group，b‑ADR‑stimulated group，c‑ADR+BGE 300group，d‑ADR+BGE 600group，e‑ADR+BGE 1200 group，f‑ADR+HKSX 
70group，g‑ADR+LOS 5.25group；

[0028] 图7为各组大鼠胶原沉积情况(200x)；a‑Control group，b‑ADR‑stimulated group，c‑ADR+BGE 300group，d‑ADR+BGE 600group，e‑ADR+BGE 1200 group，f‑ADR+HKSX 
70group，g‑ADR+LOS 5.25group；

[0029] 图8为BGE对肾组织中α‑SMA表达的影响(200x)；a‑Control group， b‑ADR‑stimulated group，c‑ADR+BGE 300group，d‑ADR+BGE 600group， e‑ADR+BGE 1200group，
f‑ADR+HKSX 70group，g‑ADR+LOS 5.25group；

[0030] 图9为BGE对肾组织中COL‑Ⅰ表达的影响(200x)；a‑Control group， b‑ADR‑stimulated group，c‑ADR+BGE 300group，d‑ADR+BGE 600group， e‑ADR+BGE 1200group，
f‑ADR+HKSX 70group，g‑ADR+LOS 5.25group；

[0031] 图10为BGE对肾组织TGF‑β1/Smads信号通路的影响。

具体实施方式

[0032] 本发明提供了黑人参提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0033] 黑人参粉末和体积分数50％～70％乙醇水溶液混合，在40～80KHz条件超声提取20～50min，提取3～4次，合并提取液后过滤，得到滤液，浓缩冷冻干燥，得到黑人参提取物；
所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：(10～20)mL。

[0034] 在本发明中，所述乙醇水溶液的体积分数优选为55％～65％；所述黑人参粉末的质量和乙醇水溶液的体积比优选为1g：(15～20)mL；所述超声的频率优选为60～80KHZ；单
次超声的时间优选为35～48min；更优选为所述乙醇水溶液的体积分数为65％，所述黑人参
粉末的质量和乙醇水溶液的体积比为1g：(10～20)mL，提取3次，每次超声时间为48min，超
声的频率为80 KHz。

[0035] 在本发明中，所述黑人参优选包括4年～5年生人参炮制所得黑人参；所述黑人参优选包括有须黑人参和无须黑人参。有须黑人参比无须黑人参的人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1的
提取量高。5年生黑人参比4年生黑人参的人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1的提取量高。本发明所述
黑人参产地为于吉林省延边朝鲜族自治州。本发明对黑人参的炮制方法没有特殊限制，采
用本领域所熟知的炮制方法即可。

[0036] 本发明提供了所述制备方法制备得到的黑人参提取物，包括人参皂苷 Rg3、Rg5和‑1 ‑1
Rk1；所述Rg3的含量为1.14～7.62mg﹒g ；所述Rg5的含量为1.22～8.38mg﹒g ；所述Rk1的
‑1 ‑1
含量为0.52～8.26mg﹒g ；所述人参皂苷的总含量为2.92～24.26mg﹒g 。

[0037] 在本发明中，所述黑人参提取物中Rg3、Rg5和Rk1的含量测定优选采用色谱测定。所述色谱测定的方法包括参考品的配制、供试品制备及色谱分析；所述参考品的配制是将
‑1
人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1对照品制成0.52、0.47、 0.51mg·mL 的对照品甲醇溶液。将制备的黑
人参提取物加乙醇稀释至250 mL容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜得到。所述色谱分析的参数优
选如下：色谱柱：Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为水，梯度洗脱条件：
0～5min(25％～45％A)，6～10min(45％～60％A)，11～20 min(60％～73％A)，21～25min
‑1
(73％～75％A)，26～35min(75％～25％A)；流速：0.8mL·min ；检测波长：203nm；柱温：30
℃；进样量：20μL。在该液相条件下与其他色谱条件相比，色谱柱具有良好柱效，待测组分稀
有人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5与相邻未知峰的分离度大于1.0，可较好分离待测组分。结果表明
本检测人参皂苷的方法重现性、稳定性良好；加样回收实验表明，准确度良好。

[0038] 本发明提供了一种用于治疗肾间质纤维化的黑人参速释微丸，包括以下质量百分含量的组分：所述黑人参提取物15％～35％、微晶纤维素25％～47％、乳糖23％～26％、交
联羧甲基淀粉钠(CMC‑Na)5％～8％、低取代羟丙基纤维素(L‑HPC)5％～8％和余量的体积
分数50％～70％乙醇水溶液。

[0039] 在本发明中，所述黑人参速释微丸以上述制备的黑人参提取物为药物活性成分，通过载料量测试，将黑人参提取物的质量优选占黑人参速释微丸总质量的20％～30％，最
优选为25％。

[0040] 在本发明中，所述黑人参速释微丸中以微晶纤维素和乳糖共同作为稀释剂，以MCC+乳糖作为稀释剂制备的微丸综合评分(96.7)优于其他两种稀释剂(微晶纤维素84.1或乳
糖81.7)。同时实验表明MCC：乳糖的质量比为 3：2，所述微晶纤维素的质量优选占黑人参速
释微丸总质量的30％～40％， 36％。所述乳糖的质量优选占黑人参速释微丸总质量为24％
～25％，最优选为24％。

[0041] 在本发明中，所述黑人参速释微丸中以交联羧甲基淀粉钠和低取代羟丙基纤维素共同作为崩解剂。实验表明，5％CMC‑Na+5％L‑HPC较其他组 (10％CMC‑Na、10％L‑HPC、10％
PPVP、5％CMC‑Na+5％PPVP、5％ L‑HPC+5％PPVP)更适合作为速释微丸的崩解剂。所述微丸
中添加复合崩解剂有利于颗粒的成型，且缩短了颗粒的崩解时限，故选择5％ CMC‑Na+5％
L‑HPC为速释微丸的复合崩解剂。所述CMC‑Na的质量占黑人参速释微丸总质量的7％。所述
L‑HPC的质量占黑人参速释微丸总质量的 7％。

[0042] 在本发明中，所述黑人参速释微丸中以乙醇水溶液为润湿剂。实验表明，以50％～70％乙醇水溶液为润湿剂制备的微丸综合评分优于5％淀粉浆，从节省成本角度考虑优选
50％乙醇水溶液为速释微丸的润湿剂。所述50％乙醇水溶液补足黑人参速释微丸总质量至
100％，优选占黑人参速释微丸总质量的1％。

[0043] 在本发明中，所述黑人参速释微丸的制备方法，优选采用挤出‑滚圆法制备。所述挤出‑滚圆法优选包括以下步骤：

[0044] 取上述制备的人参提取物加入崩解剂和稀释剂，过100目筛，研磨混匀，加润湿剂制软材，挤成条柱状进入滚圆机中滚圆，转速为1500r/min和滚圆时间为8min，得丸粒，在40
℃干燥6h，过20目筛整粒，即得微丸。本发明制备的所述黑人参速释微丸优选为棕黄色丸
剂，外观圆整，小丸的最大直径与最小直径的比值范围均在1.05～1.08之间，小丸圆整度合
格；粒径优选为0.09～0.13mm；丸重差异结果符合规定。堆密度的平均值为0.762g/ml。流动
性良好。通过崩解实验及溶出度实验表明，本发明制备的黑人参速释微丸，崩解时间优选为
30s，累积溶出度10min优选大于90％，在一定时间人参皂苷的释放具有较高的稳定性、重复
性。人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1平均回收率分别为98.79％，RSD＝0.984％、98.99％，RSD＝
0.772％、99.01％， RSD＝1.342％，表示本法准确度比较好且可行。HPLC法测定黑参速释微
‑1 ‑1
丸中3种稀有皂苷含量，本品含人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1应不低于0.295mg ﹒g 、0.294mg﹒g 、
‑1
0.142mg﹒g 。

[0045] 本发明提供了所述黑人参提取物或所述黑人参速释微丸在制备治疗肾间质纤维化的药物中的应用。

[0046] 在本发明中，将所述黑人参提取物或所述黑人参速释微丸制备药物的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的微丸的制备方法即可。所述黑人参提取物在药物中的含量为
15％～35％，更优选为20％～30％。

[0047] 在本发明中，通过生理生化指标测定，结果表明与模型组相比，给药组能显著降低尿蛋白排泄量，降低BUN和Scr水平；肾组织病理检测结果表明，给药组能使间质纤维化程度
显著减轻；同时免疫组化结果表明，给药组以剂量依赖性方式阻止α‑SMA和COL‑Ⅰ蛋白水平
升高，对TGF‑β1/Smads 信号通路的激活具有显著干预作用，从而通过TGF‑β1/Smad信号通
路抑制纤维化过程。因此，所述黑人参提取物或所述黑人参速释微丸以剂量依赖性方式改
善ADR诱导的RIF进程，对肾功能具有保护作用，这与其调控 TGF‑β1/Smad3信号通路有关。

[0048] 下面结合实施例对本发明提供的一种治疗肾间质纤维化的黑人参提取物、黑人参速释微丸及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0049] 药材：黑人参为4年生和5年生园参去须根或不去须根的炮制品(由延边黑参保健食品有限责任公司提供)，经本实验室鉴定符合质量要求。

[0050] 所用试剂、试药的来源见表1。

[0051] 表1试剂、试药

[0052]

[0053]

[0054] 所用仪器见表2。

[0055] 表2仪器设备

[0056]

[0057]

[0058] 实施例1

[0059] 黑人参提取物样品制备方法

[0060] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以65％乙醇为溶剂，料液比为 1:20，采用超声提取法，提取3次，每次超声48min，超声频率80KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0061] 实施例2

[0062] 黑人参提取物样品制备方法

[0063] 精密称取干燥4年生有须黑人参粉末，以65％乙醇为溶剂，料液比为1:20，采用超声提取法，提取3次，每次超声48min，超声频率80KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0064] 实施例3

[0065] 黑人参提取物样品制备方法

[0066] 精密称取干燥5年生无须黑人参粉末，以65％乙醇为溶剂，料液比为 1:20，采用超声提取法，提取3次，每次超声48min，超声频率80KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0067] 实施例4

[0068] 黑人参提取物样品制备方法

[0069] 精密称取干燥5年生有须黑人参粉末，以65％乙醇为溶剂，料液比为 1:20，采用超声提取法，提取3次，每次超声48min，超声频率80KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0070] 实施例5

[0071] 黑人参提取物样品制备方法

[0072] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以70％乙醇为溶剂，料液比为 1:20，采用超声提取法，提取3次，每次超声35min，超声频率60KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0073] 实施例6

[0074] 黑人参提取物样品制备方法

[0075] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以55％乙醇为溶剂，料液比为 1:15，采用超声提取法，提取3次，每次超声35min，超声频率60KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0076] 实施例7

[0077] 黑人参提取物样品制备方法

[0078] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以70％乙醇为溶剂，料液比为 1:15，采用超声提取法，提取3次，每次超声30min，超声频率80KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0079] 实施例8

[0080] 黑人参提取物样品制备方法

[0081] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以70％乙醇为溶剂，料液比为 1:10，采用超声提取法，提取3次，每次超声35min，超声频率60KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0082] 实施例9

[0083] 黑人参提取物样品制备方法

[0084] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以55％乙醇为溶剂，料液比为 1:10，采用超声提取法，提取3次，每次超声35min，超声频率60KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0085] 实施例10

[0086] 黑人参提取物样品制备方法

[0087] 精密称取干燥4年生无须黑人参粉末，以70％乙醇为溶剂，料液比为 1:10，采用超声提取法，提取3次，每次超声35min，超声频率80KHz，合并3次提取液，滤过，浓缩至1mL相当
于1g黑人参饮片的浓度，冷冻干燥，即得黑人参提取物样品。

[0088] 对比例1

[0089] 按照实施例5的方法制备黑人参提取物样品，不同之处在于溶剂为40％乙醇水溶液。

[0090] 对比例2

[0091] 按照实施例6的方法制备黑人参提取物样品，不同之处在于超声的时间为20min。

[0092] 对比例3

[0093] 按照实施例9的方法制备黑人参提取物样品，不同之处在于超声的频率为20KHz。

[0094] 实施例11

[0095] 黑人参中稀有人参皂苷含量测定方法研究

[0096] 采用HPLC法，测定黑人参中人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5的含量，建立方法学

[0097] 1、混合对照品溶液的制备

[0098] 分别精密称取人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1对照品5.200、4.700、5.100mg，制成0.52、‑1
0.47、0.51mg·mL 的对照品甲醇溶液，各精密量取对照品溶液2 mL至同一10mL量瓶中，得
‑1
到质量浓度为0.104、0.094、0.102mg·mL 的混合对照品溶液，过0.22μm滤膜，备用。

[0099] 量取混合对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mL，各自定容于1mL容量瓶中，用甲醇配成浓度为0.01，0.02，0.03，0.04， 0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，
‑1
0.10mg·mL 。各量取20μL进HPLC检测，测定其峰面积。通过峰面积(Y)对横坐标进样量(X)
回归计算，如图1，结果得人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1回归方程分别为Y＝129.43X+0.0551，r＝ 
0.9993；Y＝517.13X+1.4498，r＝0.9993；Y＝416.95X+3.6333，r＝0.9992。表明，人参皂苷
‑1 ‑1
Rg3、Rk1、Rg5分别在0.0104～0.104mg·mL 、0.0102～0.102 mg·mL 、0.0094～
‑1
0.094mg·mL 范围，其进样量与峰面积线性关系符合要求。

[0100] 2、供试品溶液的制备

[0101] 将实施例1～10的黑人参提取液，加乙醇稀释至250mL容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。

[0102] 3、色谱条件及系统适应性试验

[0103] 色谱柱：Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B 为水，梯度洗脱条件：0～5min(25％～45％A)，6～10min(45％～60％A)， 11～20min(60％～73％A)，21～
25min(73％～75％A)，26～35min(75％～25％ A)；流速：0.8mL·min‑1；检测波长：203nm；
柱温：30℃；进样量：20μL。以外标法定量，混合对照品及供试品的色谱图，见图2。在对照品
色谱保留时间相应处，供试品有相应色谱峰。在该液相条件下，理论塔板数均符合要求，色
谱柱具有良好柱效，待测组分稀有人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5与相邻未知峰的分离度大于1.0，
可较好分离待测组分。

[0104] 以外标法计算人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5含量。测定结果表明，样品中的人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5含量及总含量见表3。

[0105] 表3不同样品含量测定结果

[0106]

[0107] 4、精密度考察

[0108] 4.1中间精密度精密量取混合对照品，按上述检测方法检测人参皂苷 Rg3、Rk1、Rg5峰面积值，结果显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积的RSD 值分别为0.653％(n＝6)、
0.112％(n＝6)、0.349％(n＝6)，表明仪器精密度良好。

[0109] 4.2重复性考察精密量取供试品溶液，按上述检测方法检测人参皂苷 Rg3、Rk1、Rg5峰面积值，结果显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积的RSD 值分别为0.274％(n＝6)、
1.021％(n＝6)、1.136％(n＝6)，表明本方法重现性良好。

[0110] 4.3稳定性考察

[0111] 精密量取同一供试品溶液，室温下在0，2，4，6，8，12，24h，按上述色谱条件检测供试品，结果显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积的RSD 值分别为0.777％(n＝6)、0.796％(n＝
6)、1.279％(n＝6)，表明在24h内供试品溶液相对稳定。

[0112] 4.4加样回收率考察

[0113] 精密量取已知含量的黑人参提取液样品9份，精密量取并加入3种浓度混合对照品，各浓度分别制备3份。按上述方法制备供试品，按上述方法检测人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5峰
面积值，结果显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1 平均回收率分别99.06％，RSD为0.899％；
98.65％，RSD为1.115％；99.36％， RSD为1.049％，表明此法准确度良好，可行。

[0114] 实施例12

[0115] 1.黑人参提取物理化性质考察

[0116] BGE制备：取4年生无须黑人参，按优化后的上述提取工艺制备黑人参提取液，减压浓缩至料液比1:1，浓缩液置于真空冷冻干燥机，冷冻干燥，得冻干粉，粉碎，过100目筛，即
得BGE。

[0117] 1)引湿性

[0118] 精密称取1.000g黑人参提取物，共3份，105℃条件下干燥至恒重，在饱和氯化铵溶液湿度环境下放置24h，测量24h引湿率。结果表明，在24h 内提取物引湿率为17％，表明提
取物极具引湿性。

[0119] 2)溶解性

[0120] 精密称取1.000g黑人参提取物，共3份，分别置于5mL 25±2℃蒸馏水中，每隔2min涡旋30s，观察提取物溶解状态，无可见颗粒或液滴，为完全溶解。观察发现，在5min内完全
溶解，表明本品易溶于水。

[0121] 实施例13

[0122] 1.挤出‑滚圆法制备微丸的工艺过程

[0123] 取实施例12制备的BGE加入辅料，过100目筛，研磨混匀，加润湿剂制软材，过挤出机(孔径1.0mm)挤成相似条柱状，然后根据预实验所确定的制备工艺参数调节滚圆机转速
为1500r/min和滚圆时间为8min，通过摩擦力使条状物完全滚圆，得丸粒，丸粒40℃干燥6h，
过20目筛整粒，即得微丸。

[0124] 2.综合评分评价指标及测定方法

[0125] 根据速释微丸的特点，确定以收率和崩解时间为考察指标，在综合评分中的权重分别为40％，60％；

[0126] 综合评分＝(40×样品收率/各组样品最大收率)+(60×各组样品最小崩解时间/样品崩解时间)。

[0127] (1)收率测定：取制备好的微丸称重，收集筛分径在‑18～+24目范围的微丸，称重；微丸收率＝筛后质量/微丸总质量×100％，平行实验3次，计算平均值。

[0128] (2)崩解时间测定：称取0.500g合格微丸6份，分别置于崩解仪吊篮中，测量全部通过筛网所需时间(37℃恒温，筛网直径为0.425mm)，即为崩解时间，重复实验3次，计算平均
值。

[0129] 3.微丸制剂处方单因素考察

[0130] 按项1的方法制备微丸，分别进行单因素考察，确定微丸载料量、处方中稀释剂种类(MCC、乳糖)、崩解剂种类(CMS‑Na、L‑HPC、PPVP)、粘合(润湿)种类(5％淀粉浆、60％乙
醇)。

[0131] (1)载料量

[0132] BGE是易吸湿的原料，其在处方中的用量决定丸粒的质量。本文选择 MCC为辅料并考察其用量，BGE与MCC质量比分别为2:1、3:2、1:1、2:3 及1:2，即BGE在处方中含量质量分
数分别为66.7％、60.0％、50.0％、40.0％及33.3％，采用综合评分法评价，得出最佳载料
量。

[0133] (2)稀释剂种类

[0134] 称取BGE 3份，分别与MCC、乳糖、MCC+乳糖按比例混合均匀，60％乙醇为润湿剂制软材，挤压滚圆，干燥筛分后，采用综合评分法评价微丸。

[0135] (3)崩解剂种类

[0136] 称取BGE 6份，根据稀释剂考察结果，每份加入相应比例的MCC、乳糖，再分别与崩解剂10％CMS‑Na、10％L‑HPC、10％PPVP、5％ CMS‑Na+5％L‑HPC、5％CMS‑Na+5％PPVP、5％L‑
HPC+5％PPVP混合均匀，60％乙醇为润湿剂制软材，挤压滚圆，干燥筛分后，采用综合评分法
评价微丸。

[0137] (4)粘合(润湿)剂种类

[0138] 称取BGE 2份，根据稀释剂、崩解剂考察结果，每份加入相应比例的 MCC、乳糖，5％CMS‑Na+5％L‑HPC，再分别加入5％淀粉浆、60％乙醇适量制软材，挤压滚圆，干燥筛分后，采
用综合评分法评价微丸。

[0139] (5)正交设计实验优化制剂处方

[0140] 依据单因素试验筛选出的辅料种类及用量，对乳糖‑MCC比例(A，g/g)、崩解剂用量4
(B，％)，润湿剂乙醇的浓度(C，％)三个因素，采用L9(3) 正交设计实验优化处方。根据综
合评分结果，得出最优处方。各因素与各水平见表4，试验设计见表5。

[0141] 表4因素与水平

[0142]

[0143] 表5试验设计

[0144]

[0145]

[0146] 速释微丸的处方考察结果

[0147] (1)载料量考察结果

[0148] 结果表明，BGE与MCC质量比为1:2时制备的微丸综合评分高于其他组，故最佳载料量选择BGE与MCC质量比为1:2，见表6。

[0149] 表6载料量结果

[0150]

[0151] (2)稀释剂种类考察结果

[0152] 结果表明，稀释剂为MCC+乳糖时，所制备的微丸综合评分高于其他组，故选择MCC+乳糖为速释微丸的稀释剂，见表7。

[0153] 表7稀释剂种类筛选结果

[0154]

[0155] (3)崩解剂种类考察结果

[0156] 结果表明，5％CMS‑Na+5％L‑HPC为崩解剂时，所制备的微丸综合评分高于其他组。复合崩解剂不仅影响微丸的成型效果，而且显著缩短微丸的崩解时间，故选择5％CMS‑Na+
5％L‑HPC为速释微丸的复合崩解剂，见表8。

[0157] 表8崩解剂种类筛选结果

[0158]

[0159] (4)粘合(润湿)种类考察

[0160] 结果表明，以60％乙醇为润湿剂制备的微丸综合评分优于5％淀粉浆，故选择60％乙醇为速释微丸的润湿剂，见表9。

[0161] 表9润湿剂种类筛选结果

[0162]

[0163] 正交设计实验结果

[0164] 1.试验设计与结果

[0165] 试验设计和结果见表10，方差分析见表11，结果显示，各因素对其影响为A>B>C。A因素对结果影响最为显著，直观分析选择A3水平，B因素对结果影响较为显著，直观分析选
择B3水平，C因素对结果无显著性影响，为降低成本，选择C1水平，故最优制剂处方为
A3B3C1。即MCC:乳糖比例为3:2，崩解剂用量为7％，润湿剂为50％乙醇。

[0166] 表10试验设计与结果

[0167]

[0168] 表11方差分析结果

[0169]

[0170]

[0171] 注：F0.05(2，2)＝19.00

[0172] 2验证试验

[0173] 根据上述正交设计实验结果，按照如下配方制备微丸：BGE在微丸中含量为25％，MCC为36％，乳糖为24％(MCC:乳糖比例为3:2)，交联羧甲基淀粉钠(CMS‑Na)为7％，低取代
羟丙基纤维素为7％，润湿剂50％乙醇)为1％。制备的微丸进行3次验证试验，由结果可知，
最优微丸制剂处方稳定、重现性较好，见表12。

[0174] 表12验证试验结果

[0175]

[0176] 采用优化的最佳处方所制备的微丸外观良好，硬度适宜，收率高，30s 内崩解，能够满足速释微丸的要求，药物释放的重现性良好。

[0177] 实施例14

[0178] 按实施例13得到的微丸的配方制备黑参速释微丸样品，为控制产品质量，对微丸的外观、圆整度、粒径分布、丸重差异以及溶出度等项目进行检查，建立黑参速释微丸的质
量标准草案。

[0179] 1外观形态

[0180] 随机选取微丸样品20粒平铺于A4纸上，日光灯光源下肉眼观察微丸外观圆整，大小、色泽均匀，无粘连现象。

[0181] 2堆密度

[0182] 分别称取3批微丸样品100.0g，通过玻璃漏斗将其倾倒至500mL量筒中，测定松动的体积，计算堆密度pb＝w/v(其中w为称得质量，v为倒入量筒的体积)，求其平均值为
0.762g/ml。

[0183] 3流动性(休止角)

[0184] 称取100.0g微丸样品，取玻璃漏斗并在底部水平放置一张白纸，将样品慢慢加入，用量角器测其形成的堆积体的倾斜角，重复3次，测得倾斜角即休止角均小于30度，表明流
动性良好。

[0185] 4圆整度

[0186] 微丸圆整度能够反映微丸成丸或成型的质量。取3批样品，每批30丸，采用物镜尺测定微丸直径，计算最大直径与最小直径的比值，其范围在0.6～1.2mm之间为合格。结果表
明，小丸的最大直径与最小直径的比值范围均在1.05～1.08之间，小丸圆整度合格。

[0187] 5丸重差异

[0188] 取3批微丸样品，每批20丸，分别精密称重，并计算各批微丸平均丸重。3批样品丸重差异结果符合规定。

[0189] 6粒径分布

[0190] 称取100.0g微丸样品，分别过60目、40目、20目、18目、16目标准检验筛，测定过筛目的微丸的质量。结果表明，有87.68％微丸粒径分布在 ‑18～+24目范围内。

[0191] 7体外溶出度检查

[0192] 7.1溶液的配制

[0193] 7.1.1对照品溶液的制备

[0194] 分别精密称量人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1对照品5.200、4.700、5.100mg，制成0.52、‑1
0.47、0.51mg·mL 的对照品甲醇溶液，各精密量取对照品溶液2 mL至同一10mL量瓶中，得
‑1
到质量浓度为0.104、0.094、0.102mg·mL 的混合对照品溶液，过0.22μm滤膜，备用。

[0195] 7.1.2供试品溶液的制备

[0196] 精密称取微丸4.000g，在37±0.5℃水浴条件下，加入200mL脱气H2O 溶解即得。

[0197] 7.1.3空白溶液的制备

[0198] 精密称取1.440g MCC、1.000g乳糖、0.280g CMS‑Na、0.280g L‑HPC，在37±0.5℃水浴条件下，加入200mL脱气H2O溶解即得。

[0199] 7.2微丸溶出度测定

[0200] 溶出度是速释制剂质量控制的重要指标。采用HPLC法测定该产品中标志性组分人参皂苷Rg3、Rk1、Rg5的溶出情况。

[0201] 取6批微丸样品，以黑参速释微丸中人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1含量为指标，按上述条‑1
件，测定三种标志性成分溶出情况。采用小杯法，转速100r ﹒min ，温度37±0.5℃，脱气H2O
为溶出介质。精密称取主药含量相当于 1.000g的微丸6批，分别置于装有200mL溶出介质的
溶出杯中，分别在1， 2，3，5，7，8，10，12，15，20，30min定时定位取1mL样品，同时补加 1mL脱
气H2O(37±0.5℃)，过0.22μm滤膜，吸滤液20μL注入液相仪，测定三种人参皂苷含量，计算
药物浓度及同时间累积释放度，绘制时间‑溶出度曲线。

[0202] 7.3溶出成分测定方法学考察

[0203] 7.3.1色谱条件与系统适应性试验

[0204] 色谱条件同上，空白、对照品及供试品色谱图，见图3。结果表明，理论塔板数符合要求，在该条件下，待测组分稀有人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1 与相邻未知峰的分离度大于1.0，
可较好分离待测组分；在与对照品溶液保留时间相同处，供试品溶液有相应色谱峰，空白溶
液无色谱峰。

[0205] 7.3.2重复性考察

[0206] 精密量取供试品溶液，按上述方法检测人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积值，结果显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积的RSD值分别为1.047％ (n＝6)、1.125％(n＝6)、0.963％(n
＝6)，表明本方法重现性良好。

[0207] 7.3.3稳定性考察

[0208] 精密量取同一供试品溶液，室温下在0，2，4，6，8，12，24h，按上述条件检测供试品溶液人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积值，结果显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1峰面积的RSD值分别
为1.361％(n＝6)、1.367％(n＝6)、 1.482％(n＝6)，表明在24h内相对稳定。

[0209] 7.3.4加样回收率考察

[0210] 精密量取已知含量的黑参速释微丸样品溶液9份，精密量取并加入3种浓度混合对照品溶液，按上述条件制备供试品，按上述条件检测人参皂苷 Rg3、Rg5、Rk1峰面积值，结果
显示人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1平均回收率分别为98.79％，RSD＝0.984％、98.99％，RSD＝
0.772％、99.01％，RSD＝1.342％，表示本法准确度比较好且可行。

[0211] 7.4微丸溶出度测定结果

[0212] 结果表明，黑参速释微丸在5min累积溶出度为60％，10min累积溶出度超过90％，30min内达到100％，可满足速释微丸的要求。本法专属性较强，操作容易，灵敏度较高，重复
性较好，辅料无干扰，能有效控制产品质量。

[0213] 8黑参速释微丸中人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1含量测定

[0214] 8.1溶液的制备

[0215] 8.1.1混合对照品溶液的制备

[0216] 同上述混合对照品溶液制备方法。

[0217] 8.1.2供试品溶液的制备

[0218] 精密称取黑参速释微丸1.000g，加入甲醇15mL，超声3次，每次20min，合并提取液，挥干溶剂，加5mL甲醇溶解即得。

[0219] 8.2样品中人参皂苷含量测定

[0220] 精密称取3批黑参速释微丸1.000g，按上述方法制备样品，按上述记载方法检测样品中人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1含量，结果见表13。故规定本品含人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1不低于
‑1 ‑1 ‑1
0.295mg﹒g 、0.294mg﹒g 、0.142mg ﹒g (平均含量×90％)。

[0221] 表13速释微丸中3种人参皂苷含量测定结果

[0222]

[0223]

[0224] 黑参速释微丸为棕黄色丸剂，外观圆整、均匀，粒径在0.09～0.13mm，崩解时间为30s，累积溶出度10min大于90％。HPLC法测定黑参速释微丸中3种稀有皂苷含量，本产品含
‑1 ‑1 ‑1
人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1应不低于0.295mg ﹒g 、0.294mg﹒g 、0.142mg﹒g 。

[0225] 实施例15

[0226] 1实验动物

[0227] SPF级SD雄性大鼠70只，体重(200±20g)(长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK吉2012‑0002)，适应喂养1W，大鼠编号，自由摄食饮水，单笼喂养，笼具定
期消毒。室内通风良好，相对湿度65％～75％。

[0228] 2实验方法

[0229] 2.1动物分组及给药

[0230] 实验动物适应喂养1W后，收集24h代谢物尿液，测定24h尿蛋白，均为阴性后纳入实验。随机分为空白组(Control)、模型组(ADR)、模型给药组和阳性对照组，每组10只。除
‑1
Control组外，剩余各组一次性尾静脉注射阿霉素6.2mg·kg 造模；造模1d开始，每日早晨
通过灌胃给予大鼠相应剂量药物，Control和ADR组灌胃同体积生理盐水，给药连续9周。实
验结束后取大鼠血清及左右肾，并对各项指标进行检测。实验分组及给药浓度说明，见表
14。

[0231] 表14实验分组及给药浓度(mg·kg‑1·day‑1)

[0232]

[0233] 2.2一般检查

[0234] 实验周期内，每日观察动物体重、精神状况、饮食饮水、行为活动、皮毛色泽等。

[0235] 2.3指标检测

[0236] 2.3.1 24h尿蛋白排泄量

[0237] 在实验周期内，每周定时收集代谢笼内大鼠24h尿液，尿液经前处理后采用双缩脲法检测各组大鼠24h尿蛋白浓度，重复3次取平均值，并按公式 (1)计算24h尿蛋白排泄量。

[0238] 24h尿蛋白排泄量(mg)＝24h尿蛋白浓度(mg·mL‑1)×24h尿量(mL)  公式(1)

[0239] 2.3.2血清中肾功能指标检测

[0240] 实验结束后，乙醚麻醉，眼球取血，室温下血液放置30min，以3000 rpm·min‑1离心10min，取上清于1.5mL管，储存于‑80℃，采用试剂盒测定血清中尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)
的含量。

[0241] 2.4组织病理学检测

[0242] 2.4.1石蜡切片

[0243] (1)4％多聚甲醛固定大鼠肾组织24h后，垂直切取厚度为3mm左右肾组织装入包埋盒，流水冲洗30min以上；

[0244] (2)脱水后透明并浸蜡包埋：组织置于40％和70％乙醇各20min，80％、乙醇I、乙醇II、无水乙醇I和无水乙醇II各10min，二甲苯I和二甲苯II 各5min，56‑58℃软蜡30min，硬
蜡包埋40min；

[0245] (3)包埋：组织放在包埋盒的中央，避免气泡产生；

[0246] (4)切片：肾组织包埋好后，切成3μm厚度；

[0247] (5)捞片、展片、烤片：于50℃水浴展开，在烘片机上烤1h，防止脱片。

[0248] 2.4.2 HE染色

[0249] (1)切片脱蜡至水：于二甲苯I中10min，二甲苯II、无水乙醇I、无水乙醇II、95％乙醇、90％乙醇、85％乙醇各5min，流水冲洗5min；

[0250] (2)HE染色：苏木素液染色2min后，用小水流冲洗5min，1×PBS返蓝 2min，流水冲洗5min，伊红染色6min，流水冲洗5min；

[0251] (3)脱水、透明、封固：切片依次在85％、90％、95％I、95％II、100％ I、100％II乙醇浓度各10下，二甲苯I和二甲苯II各3min，中性树胶封片。

[0252] 2.4.3 MASSON染色

[0253] (1)切片脱蜡至水：同上；

[0254] (2)室温下，切片于Bouin固定液中浸泡过夜，水冲洗至切片上无黄色为止；

[0255] (3)天青石兰染色5min，蒸馏水稍稍冲洗；

[0256] (4)苏木素染色5min，蒸馏水稍稍冲洗；

[0257] (5)5％冰醋酸水溶液分化15s，流水洗；

[0258] (6)酸性复红、磷钼酸水溶液各浸染10min；

[0259] (7)5％磷钨酸分化10‑20min，滤纸轻吸；

[0260] (8)苯胶蓝液染色15min，迅速通过95％酒精；

[0261] (9)脱水后透明并封固封片：于无水乙醇I、II、III，各5～10min下；二甲苯I、II各3～5min；中性树胶封片，镜下观察。

[0262] 2.5免疫组化法检测肾组织中α‑SMA、COL‑Ⅰ蛋白表达

[0263] (1)切片脱蜡至水：同“2.4.2”；

[0264] (2)切片置于0.01M枸橼酸钠中，加热至沸腾后转为低温加热20min，冷却20min；

[0265] (3)PBS冲洗，时间5min×2次，甩去PBS；

[0266] (4)室温下，滴入50μL 3％H202湿盒中10min，阻断内源性过氧化酶活性，PBS冲洗，时间5min×2次；

[0267] (5)滴入50μL 5％Goat Serum湿盒中30min；

[0268] (6)滴入50μL一抗(兔抗鼠α‑SMA稀释1:100，兔抗鼠COL‑Ⅰ稀释 1:100)，于湿盒中4℃过夜，后用PBS冲洗，时间5min×3次；

[0269] (7)滴入50μL二抗，室温下放置30min，后用PBS冲洗，时间5min×3 次；

[0270] (8)滴入50μL HRP anti‑Rabbit IgG室温孵育20min，后用PBS冲洗5 min×3次；

[0271] (9)DAB溶液显色；

[0272] (10)苏木素复染10s，水洗5min，PBS返蓝10s；

[0273] (11)脱水、透明、封固：于无水乙醇I、II、III，各5～10min下；二甲苯 I、II各3～5min；为长期保持用中性树胶封片，镜下观察；

[0274] (12)在200倍显微镜下，每个样本随机选择5至10个非重叠视野，并计算每个切片在整个视野中呈阳性的免疫组织化学百分比，取3次平均值。

[0275] 2.6 Westernblotting检测肾组织中蛋白表达

[0276] 2.6.1肾组织蛋白提取

[0277] (1)取10～15mg肾组织，低温条件下，加入裂解液研磨，裂解至无明显块状组织，收集于1.5mL管中，置4℃冰箱30min进行裂解，冰浴中超声 10min，至‑80℃低温过夜保存；

[0278] (2)次日取出组织匀浆液，于4℃10000rpm/min离心30min，取上层；

[0279] (3)取少许匀浆液测定蛋白浓度(BCA法)，其余加Loading Buffer混匀后沸水煮8min后，存于‑80℃。

[0280] 2.6.2 BCA法测定蛋白浓度

[0281] (1)根据样品个数，配制BCA工作液，试剂A与B以50：1配比充分混匀，现配现用；

[0282] (2)BSA标准品的配制：用1×PBS和1mg·mL‑1BSA溶液配制浓度为0， 0.05mg·mL‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
，0.1mg·mL ，0.2mg·mL ，0.4mg·mL ，0.6mg·mL ，0.8 mg·mL 和1mg·mL 的蛋白标
准品；

[0283] (3)稀释蛋白样品：从‑80℃取出总蛋白，自然融化后将其稀释10倍(2μL 蛋白样品+18μL1*PBS)；

[0284] (4)前期工作准备好后，标准品和待测样品分别加入96孔板，样品均设 3个复孔，每孔加入样品2μL，工作液200μL；将孔板放入烘箱孵育30min (37℃)，检测562nm处样品的
吸光度，根据标准曲线测定样品蛋白浓度。

[0285] 2.6.3 Westernblotting检测蛋白表达

[0286] (1)制胶：取干净的玻璃，用75％酒精和擦镜纸擦干玻璃上残留的污渍和纸屑，在胶架上放好；依据所做蛋白大小选择制胶浓度，按照表15中各试剂比例制下层胶即分离胶，
涡旋混匀后迅速加入胶架上两片玻璃间，每个约5mL，并在最上层加饱和正丁醇1mL平整液
面，排泡液封；1h后下层胶凝固，倒掉饱和正丁醇，用双蒸水冲洗液面，将残留的正丁醇洗
掉，用滤纸吸干，按照表16中各试剂比例制上层胶即5％浓缩胶，涡旋混匀后迅速加入，并插
上事先根据样品数选好的梳子；30min后上层胶凝固，拔掉梳子，用双蒸水冲走孔内的气泡
和残留的上层胶，组装好机器。

[0287] 表15分离胶的配制

[0288]

[0289] 表16浓缩胶的配制

[0290]

[0291] (2)制样：依据测定的样品蛋白浓度，按照目标上样量计算蛋白样品、 1*PBS和样品缓冲液(Sample Loading Buffer)的量，按比例制备样品，离心‑涡旋‑离心后，将样品放
入95℃金属浴5min，使其变性，样品冷却后，离心‑涡旋‑离心，放入‑20℃暂存，等待上样；

[0292] (3)上样、跑胶：倒入适量的缓冲液，开始上样，第一个样品左侧上2μL 的Marker，其余各孔上样液为30μL，空白孔用Loading Buffer填补，80V 电压开始跑胶，当样品在浓缩
胶中浓缩完全后，电压调至100V，使样品一直跑到分离胶的底部停止；

[0293] (4)转印：PVDF膜事先将其浸泡于甲醇中，剥离浓缩胶，只留有分离胶待用，在转印缓冲液中按照海绵‑滤纸‑PVDF膜‑分离胶‑滤纸‑海绵顺序放好，扣上转印夹，在冰浴转印槽
中转印，根据蛋白大小决定转印时间；

[0294] (5)Blocking：小心取出PVDF膜，并将其放入5％脱脂牛奶(1g脱脂牛奶+20mLPBST)中封闭1h，后用PBST洗膜上可能残留的脱脂牛奶；

[0295] (6)一抗孵育：加入兔抗鼠TGF‑β1、Smad3、p‑Smad3和Smad7(1:2500) 一抗进行孵育；置4℃摇床过夜，PBST洗膜；

[0296] (7)二抗孵育：加入与一抗相符合的二抗(1:2500)，室温下孵育1h，PBST 反复洗膜；

[0297] (8)ECL液中充分浸泡显色，成像系统中曝光。

[0298] 3统计学分析

[0299] 数据均用Mean±SD表示，统计分析采用Student’s t test或one‑way ANOVA进行比较，Tukey’s比较进行检验。GraphPad Prism6.0软件(GraphPad Software，Inc.La 
Jolla，CA，USA)进行统计学分析，P<0.05说明有统计学差异。

[0300] 4实验结果

[0301] 4.1一般情况

[0302] Control组体重增加，色泽光亮；ADR组体重增加较慢，毛色暗淡，出现水肿，腹泻等情况，约90％ADR组尾部出现不同程度肿胀，腐烂，为阿霉素的副作用所致，定期对大鼠尾部
碘酒消毒处理；给药后各给药组以不同程度缓解ADR组各症状，且烂尾情况好转。

[0303] 4.2大鼠体重变化

[0304] 各组体重结果显示，与Control组相比，ADR组体重有所下降，给药后大鼠体重有所增长，但无显著性差异。

[0305] 4.3指标检测结果

[0306] 4.3.1 24h尿蛋白定量结果

[0307] 实验0～1W，不同组大鼠UP无显著差异(P>0.05)；实验后2W，ADR组大鼠24h尿蛋白排泄量较Control组显著升高(P<0.05)；实验后9W，给药组大鼠24h尿蛋白排量较ADR组均降
低(P<0.05)，BGE高剂量组最为显著，见图4。

[0308] 4.3.2生化指标检测结果

[0309] ADR组较Control组大鼠血清BUN含量增加显著(P<0.05)，各给药组同ADR组相比，能够显著下降BUN水平(P<0.05)。ADR组较Control组大鼠Scr水平明显升高(P<0.05)，各给
药组同ADR组相比，能够显著降低 Scr的含量(P<0.05)，见图5。

[0310] 4.4肾组织病理检测结果

[0311] 4.4.1 HE染色结果

[0312] 光学显微镜下可见，Control组大鼠肾脏未见异常改变，肾小管形态完好，排列致密，间质未见异常变化；ADR组肾小管形态丢失，同时可见明显的肾小管扩张，上皮细胞凋亡
坏死，细胞丢失，肾间质发现异常变化；给予不同剂量BGE后，各病理变化有不同程度转好，
间质纤维化程度减轻； BGE高剂量组较HKSX、LOS组改善作用更为显著，见图6。

[0313] 4.4.2 Masson染色结果

[0314] 光学显微镜下可见，Control组大鼠肾脏无胶原产生或有很少量细丝状沉积；ADR组大鼠肾脏明显有大量的胶原纤维富积于肾小管周围，肾间质变宽，并且胶原纤维变多，大
量蛋白管型，肾脏间质以弥漫性分布；各给药组的胶原沉积和纤维化面积明显低于ADR组，
且BGE高剂量组仅有少量丝状纤维沉积，改善作用最为显著，见图7。

[0315] 4.5免疫组化结果

[0316] 4.5.1α‑SMA蛋白表达结果

[0317] 从免疫组织化学和半定量数据结果可以看出，在Control组大鼠中只有轻微的棕黄色颗粒出现，说明有很少的α‑SMA表达；在ADR组中α‑SMA表达增加十分显著(P<0.05)；与
ADR组相比，BGE给药组以剂量依赖性方式阻止α‑SMA蛋白水平升高，且与其他给药组比较，
BGE高剂量组对蛋白的转变最显著(P<0.05)。半定量分析结果显示，ADR组大鼠肾组织中α‑
SMA的平均阳性面积表达率显著高于Control组，而BGE给药组大鼠肾组织中α‑SMA平均阳性
面积表达率显著低于ADR组(P<0.05)，见图8。

[0318] 4.5.2 COL‑Ⅰ蛋白表达结果

[0319] 各组大鼠肾组织中COL‑Ⅰ表达情况如图9所示。由图可见Control组大鼠肾组织COL‑Ⅰ仅有少量表达；与Control组相比，ADR模型组大鼠肾组织中可见大量棕黄色颗粒沉
积，COL‑Ⅰ表达显著增加(P<0.05)；与ADR组相比，BGE给药组能够抑制大鼠肾组织中COL‑Ⅰ蛋
白表达，其中高剂量组的变化最为显著(P<0.05)。半定量分析结果显示，ADR组大鼠肾组织
中 COL‑Ⅰ的平均阳性面积表达率显著高于Control组，而BGE给药组大鼠肾组织中COL‑Ⅰ平
均阳性面积表达率显著低于ADR组(P<0.05)。

[0320] 4.6 BGE平衡肾组织中的TGF‑β1/Smad3信号

[0321] 本实验考察BGE对TGF‑β1/Smad3信号通路的影响，该通路已被证实对 RIF调节作用明显。与ADR组相比，BGE给药组以剂量依赖性方式下调 TGF‑β1表达水平，降低p‑Smad3与
Smad3的比例，上调负调节因子Smad7 的表达(P<0.05)，且BGE高剂量组的变化十分显著，见
图10。结果表明， BGE对TGF‑β1/Smads信号通路的激活具有显著干预作用，从而通过 TGF‑β
1/Smad信号通路抑制纤维化过程。

[0322] 综上，BGE以剂量依赖性方式改善ADR诱导的RIF进程，对肾功能具有保护作用，这与其调控TGF‑β1/Smad3信号通路有关。

[0323] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。