一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法及其应用。该方法包括如下步骤：S1、将极端环境微藻培养至对数生长期，得到种子液；S2、将有机碳源加入到未经灭菌的超高氨氮工业废水中，调pH值至1～4，得到超高氨氮废水培养基；其中，培养基的氨氮浓度高于2800mg/L；S3、将适应性培养后的种子液接种到装有超高氨氮废水培养基的光发酵罐中进行间歇补料发酵，待光发酵罐中的氨氮浓度低于20mg/L时，更新废水培养基使发酵罐中氨氮浓度高于4700mg/L。本发明方法氨氮去除效率高，处理周期短，绿色环保，同时还可以回收高价值的藻胆蛋白，实现了资源的综合开发利用。

权利要求

1.一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将极端环境微藻培养至对数生长期，得到极端环境微藻的种子液；

S2、将有机碳源加入到未经灭菌的超高氨氮工业废水中，调节pH值至1 4，得到超高氨~

氮废水培养基；其中，超高氨氮废水中的氨氮浓度高于2800 mg/L；

S3、将步骤S1中得到的极端环境微藻的种子液接种到装有步骤S2中得到的超高氨氮废水培养基的光发酵罐中进行间歇补料发酵，待光发酵罐中的氨氮浓度低于300 mg/L时，取出部分藻液并补入相同体积的超高氨氮废水培养基，使发酵罐中氨氮浓度高于4700 mg/L；

步骤S1中所述的极端环境微藻为嗜硫原始红藻（Galdieria sulphuraria）UTEX 2919；

步骤S1中所述的培养的条件为：葡萄糖浓度为15 35 g/L，培养温度为30 40℃，光照强~ ~

‑2 ‑1

度为65 300 μmol m  s ，转速为100 150 rpm；

~ ~

步骤S3中所述的发酵条件为：pH值为1 4，培养温度为30 40℃，光照强度为65 300 μ‑2 ‑1 ~ ~ ~

mol m  s ，通气量为100 300 L/h，搅拌速率为100 200 r/min；

~ ~

所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，在步骤S2和步骤S3之间，还包括将步骤S1得到极端环境微藻的种子液进行适应性培养的步骤；具体为：将步骤S1中得到的极端环境微藻的种子液接种至S2中得到的超高氨氮废水培养基培养至有机碳源耗尽，得到极端环境微藻的培养液；然后将部分极端环境微藻的培养液接种至超高氨氮废水培养基中，重复上述操作四次以上，得到适应性培养后的种子液；其中，超高氨氮废水中的氨氮浓度高于2800 mg/L；

5

所述的极端环境微藻的种子液的接种量为按其在所述发酵体系的终浓度为1×10～1

8 

×10 cells/mL添加计算；

所述的有机碳源为葡萄糖；

所述的葡萄糖的添加量为按其在所述体系的终浓度为10 35 g/L添加计算；

~

‑2

所述的培养的条件为：pH值为1 4，培养温度为30 40℃，光照强度为65 300 μmol m  ‑1 ~ ~ ~

s ，转速为100 150 rpm；

~

所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，在步骤S3之后还包括如下步骤：

S4、将步骤S3中取出的部分藻液离心洗涤，收集藻泥，再真空冷冻干燥，得到富含藻胆蛋白的藻粉。

2.根据权利要求1所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，其特征在于：

步骤S2中所述的调节pH值为调节pH值至2.5 3.0；

~

步骤S2中所述的有机碳源为葡萄糖；

所述的葡萄糖的添加量为按其在所述体系的终浓度为10 35 g/L添加计算；

~

步骤S2中所述的超高氨氮废水中的氨氮浓度为2800 10000 mg/L；

~

步骤S3中所述的间歇补料为待光发酵罐中的氨氮浓度低于200mg/L进行；

步骤S3中所述的补入相同体积的超高氨氮废水为使发酵罐中氨氮浓度高于5000 mg/L。

3.根据权利要求2所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，其特征在于：

步骤S2中所述的调节pH值为调节pH值至2.5；

步骤S2中所述的超高氨氮废水中的氨氮浓度为3300 7000 mg/L；

~

步骤S3中所述的间歇补料为待光发酵罐中的氨氮浓度低于20 mg/L进行；

步骤S3中所述的补入相同体积的超高氨氮废水为使发酵罐中氨氮浓度高于5500 mg/L。

4.根据权利要求1所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，其特征在于：

步骤S3中所述的间歇补料还包括当葡萄糖浓度低于5g/L和磷酸盐浓度低于100 mg/L时补充有机碳源和磷酸盐，将发酵罐中补充葡萄糖和磷酸盐至初始浓度；

所述的葡萄糖的初始浓度为20 35 g/L；

~

所述的磷酸盐为磷酸二氢钾；

所述的磷酸二氢钾的初始浓度为0.7 g/L。

5.根据权利要求1所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，其特征在于：

步骤S1中所述的培养所用培养基为2MA培养基，其组成成分如下：(NH4)2SO4 5.24 g/L；

CaCl2 ∙2H2O 0.14 g/L；MnCl2 ∙4H2O 1.8 g/L；CoCl2 ∙6H2O 0.04 g/L；KH2PO4 0.54 g/L；

EDTA‑NaFe 0.04 g/L；ZnCl2 0.105 g/L；CuCl2 ∙2H2O 0.043 g/L；MgSO4 ∙7H2O 0.5g/L；

H2BO3 2.85 g/L；Na2MoO4 ∙2H2O 0.39g/L；

步骤S2中所述的超高氨氮工业废水为经过0.8μm的微孔滤膜过滤的高氨氮工业废水；

步骤S3所述的极端环境微藻的种子液的接种量为按其在所述发酵体系的终浓度为1×

5 8 

10～1×10 cells/mL添加计算。

6.权利要求1～5任一项所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法在高氨氮废水处理和/或生产藻胆蛋白中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的高氨氮废水为氨氮浓度高于2800 mg/L的高氨氮废水。

说明书

一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法及其

应用

技术领域

[0001] 本发明属于废水处理与废弃物质资源化利用技术领域，特别涉及一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法及其应用。

背景技术

[0002] 工农业的快速发展不仅拉动了经济增长，同时带来了一系列的环境污染问题。工业和农业生产中产生大量的高氨氮废水，如催化剂生产废水、稀土矿采矿废水、猪场沼液和
垃圾渗滤液等，此类废水中氨氮浓度范围为400～10000mg/L甚至更高。我国现行相关环保
标准中涉及氨氮废水排放指标的有《地表水环境质量标准》(GB3838‑2002)、《地下水环境质
量标准》(GB/T14848‑93)、《污水综合排放标准》(GB8978‑1996)，以及相关行业型水污染物
排放标准。《中华人民共和国污水综合排放标准》(GB8978‑1996)规定医药原料药、染料、石
油化工工业的一级标准是15mg/L，二级标准是50mg/L；其它排污单位一级标准15mg/L，二级
标准25mg/L。过量氨氮废水的排出可造成河流湖泊富营养化和地下水水体污染，从而影响
生态的平衡和人类饮用水的安全。因此，废水脱氨氮在近年来受广泛关注。

[0003] 目前，主要的脱氨氮方法为离子交换法、气体吹脱法、膜分离法和硝化‑反硝化法等。这些方法虽应用广泛，但建设及运营成本高，容易产生二次污染，且传统的生物三级处
理法对高浓度氨氮(>300mg/L)具有不耐受性(活性污泥极易氨中毒)，这些均影响高氨氮废
水处理技术的应用。微藻生长周期短、代谢迅速、环境适应性强，可吸收水体中的氮和磷等
营养物质并快速转化为自身有机质，且运营成本低、副产物经济价值高，在处理高氨氮废水
及其资源化利用方面具有广阔前景。但目前广泛使用于废水处理的藻株普遍存在低氨氮耐
受能力问题，而基于发酵法的异养或兼养藻种培养需要消耗大量碱液来维持pH接近中性
pH、消耗大量碳源提供物质和能量，以及需要高温高压容器、消耗大量蒸汽灭菌等导致能耗
和装备成本高、运行费用高等问题，实际应用时高氨氮废水的处理综合成本普遍较高。嗜硫
原始红藻(Galdieria sulphuraria)为近年新兴的微藻资源。作为水体中的初级生产者，嗜
硫原始红藻可将水中氮磷等营养物质吸收并转化为微藻生物质和高附加值代谢产物，其胞
内的蛋白质含量可达细胞干重的60～70％，同时含有丰富的对热稳定性高的藻胆蛋白。目
前，逐渐有研究将嗜硫原始红藻应用于食品加工行业等有机废水处理，在实现废水净化的
同时获得高值化的微藻生物质。

[0004] 中国专利申请CN110627213A公开了一种利用微藻光发酵高效处理高氨氮废水的方法，该方法利用高温高压灭菌的高氨氮废水培养蛋白核小球藻以达到废水净化的效果，
该藻可耐受的氨氮浓度最高为1200mg/L，最高的去除速率为1021mg/L/d，但过高浓度氨氮
废水对微藻细胞具有毒性作用，且大部分微藻对氨氮浓度的耐受性较低，所以在处理高氨
氮废水时，一般会对废水进行稀释等预处理。中国专利申请CN107473384A公开一种使用膜
接触器对垃圾渗滤液进行预处理的方法，经预处理并对废水氨氮浓度进行稀释至400mg/L
后可用于小球藻的培养，3天内氨氮去除率可达99.3％。中国专利申请CN109912136A公开了
一种使用沸石等吸附剂对高氨氮废水进行预处理，随后用于微藻培养。该方法中的微藻可
处理浓度为500mg/L的氨氮废水，且在8天内去除率达到98.3％。该方法中系统预处理后可
增强体系的氨氮去除效率，但膜分离体系和沸石吸附需增加额外的能耗与成本。中国专利
申请CN106348451A公开了一种利用微藻与水生植物联合处理高氨氮养猪沼液的系统，该系
统可处理的氨氮浓度约为330mg/L，处理20天后氨氮去除率达98.18％。该体系通过微藻和
植物吸收和转化废水中的氨氮，从而达到废水净化的目的，但该体系氨氮去除周期长，且过
高浓度的氨氮亦会影响植物的生长。以上的公开专利表明生物法可有效处理氨氮废水，但
对于氨氮浓度高于1200mg/L的超高氨氮浓度的废水，则需对废水进行稀释或吸附等预处
理，以降低超高浓度氨氮对微藻或植物带来的毒性作用。

[0005] 因此，现有技术尚未将利用微藻发酵法在非灭菌废水体系中快速去除超高浓度氨氮和联产高值化藻胆蛋白生物质有机地结合起来，不利于实现此类废水的高效、低成本处
理和高值资源化利用。

发明内容

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法。

[0007] 本发明的另一目的在于提供所述利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法的应用。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0009] 一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，包括如下步骤：

[0010] S1、将极端环境微藻培养至对数生长期，得到极端环境微藻的种子液；

[0011] S2、将有机碳源加入到未经灭菌的超高氨氮工业废水中，调节pH值至1～4，得到超高氨氮废水培养基；其中，超高氨氮废水中的氨氮浓度高于2800mg/L；

[0012] S3、将步骤S1中得到的极端环境微藻的种子液接种到装有步骤S2中得到的超高氨氮废水培养基的光发酵罐中进行间歇补料发酵，待光发酵罐中的氨氮浓度低于20mg/L时，
取出部分藻液并补入相同体积的超高氨氮废水培养基(即废水培养基更新)，使发酵罐中氨
氮浓度高于4700mg/L。

[0013] 步骤S1中所述的极端环境微藻优选为嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)；进一步优选为嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)UTEX 2919(购于美国UTEX藻种库)。

[0014] 步骤S1中所述的培养的条件优选为：葡萄糖浓度为15～35g/L(优选20g/L)，培养‑2 ‑1 ‑
温度为30～40℃(优选为35℃)，光照强度为65～300μmol m s (优选为200～300μmol m
2 ‑1 ‑2 ‑1
s ；更优选为210μmol m s )，转速为100～150rpm(优选为150rpm)。

[0015] 所述的光照为全光谱LED灯光照。

[0016] 步骤S1中所述的培养所用培养基为2MA培养基；优选为调整配方后的2MA培养基，其组成成分如下：(NH4)2SO4 5.24g/L；CaCl2·2H2O 0.14g/L；MnCl2·4H2O 1.8g/L；CoCl2·
6H2O 0.04g/L；KH2PO4 0.54g/L；EDTA‑NaFe 0.04g/L；ZnCl2 0.105g/L；CuCl2·2H2O 
0.043g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；H2BO3 2.85g/L；Na2MoO4·2H2O 0.39g/L。

[0017] 步骤S2中所述的超高氨氮废水中的氨氮浓度优选为2800～10000mg/L；进一步优选为3300～7000mg/L；再进一步优选为4700～6800mg/L；更优选为5500～6800mg/L。

[0018] 步骤S2中所述的调节pH值优选为调节pH值至2.5～3.0；更优选为调节pH值至2.5。

[0019] 步骤S2中所述的有机碳源优选为葡萄糖。

[0020] 所述的葡萄糖的添加量为按其在所述体系的终浓度为10～35g/L添加计算；优选为按其在所述体系的终浓度为20g/L添加计算。

[0021] 步骤S2中所述的超高氨氮工业废水为过滤后的高氨氮工业废水；最优选为经过0.8μm的微孔滤膜过滤的高氨氮工业废水。

[0022] 步骤S2中所述的高氨氮工业废水中氨氮浓度为2800～10000mg/L，盐度为30～2+ + 2+ 2+ 2+ 2+
40‰，pH为6.0～8.0，微量元素(Mg 、K、Ca 、Mn 、Cu 、Zn )浓度范围为0～400mg/L。

[0023] 步骤S2中所述的超高氨氮废水培养基为催化剂生产原废水添加了适量Ca和P等营养元素的催化剂生产废水配制的废水培养基；优选为添加了2MA培养基配方中除硫酸铵外
的其它营养元素的催化剂生产废水配制废水培养基；更优选为：氨氮2800～10000mg/L；
CaCl2·2H2O 0.14g/L；MnCl2·4H2O 1.8g/L；CoCl2·6H2O 0.04g/L；KH2PO4 0.54g/L；EDTA‑
NaFe 0.04g/L；ZnCl2 0.105g/L；CuCl2·2H2O 0.043g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；H2BO3 
2.85g/L；Na2MoO4·2H2O 0.39g/L。

[0024] 所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，在步骤S2和步骤S3之间，还包括将步骤S1得到极端环境微藻的种子液进行适应性培养的步骤，具体为：

[0025] 将步骤S1中得到的极端环境微藻的种子液接种至S2中得到的超高氨氮废水培养基培养至有机碳源耗尽，得到极端环境微藻的培养液(第一次适应性培养)；然后将部分极
端环境微藻的培养液再次接种至超高氨氮废水培养基中，重复上述操作四次以上，得到适
应性培养后的种子液；其中，超高氨氮废水中的氨氮浓度高于2800mg/L(优选为2800～
10000mg/L；进一步优选为3300～7000mg/L；再进一步优选为4700～6800mg/L；更优选为
5500～6800mg/L)。

[0026] 所述的极端环境微藻的种子液的接种量为按其在所述发酵体系的终浓度为1×5 8 7
10 ～1×10 cells/mL添加计算；优选为按其在所述发酵体系的终浓度为1×10 ～1×
8 8
10 cells/mL添加计算；更优选为按其在所述发酵体系的终浓度为1×10 cells/mL添加计
算。

[0027] 所述的有机碳源优选为葡萄糖。

[0028] 所述的葡萄糖的添加量为按其在所述体系的终浓度为10～35g/L添加计算；优选为按其在所述体系的终浓度为20g/L添加计算。

[0029] 所述的培养的条件优选为：pH值为1～4(优选为2.5～3.0；更优选为2.5)，培养温‑2 ‑1 ‑2 ‑1
度为30～40℃(优选为35℃)，光照强度为65～300μmol m s (优选为200～300μmol m s ；
‑2 ‑1
更优选为210μmol m s )，转速为100～150rpm(优选为150rpm)。

[0030] 步骤S3所述的极端环境微藻的种子液的接种量为按其在所述发酵体系的终浓度5 8 7
为1×10～1×10cells/mL添加计算；优选为按其在所述发酵体系的终浓度为1×10 ～1×
8 8
10 cells/mL添加计算；更优选为按其在所述发酵体系的终浓度为1×10 cells/mL添加计
算。

[0031] 步骤S3中所述的间歇补料优选为待光发酵罐中的氨氮浓度低于200mg/L进行；更优选为待光发酵罐中的氨氮浓度低于300mg/L进行。

[0032] 步骤S3中所述的补入相同体积的超高氨氮废水优选为使发酵罐中氨氮浓度高于5000mg/L；更优选为使发酵罐中氨氮浓度高于5500mg/L；最优选为使发酵罐中氨氮浓度
5500～5800mg/L。

[0033] 步骤S3中所述的间歇补料还包括根据营养消耗的情况适量补加有葡萄糖和磷酸盐；优选为当葡萄糖浓度低于5g/L和磷酸盐浓度低于100mg/L时补充葡萄糖和磷酸盐，将发
酵罐中补充葡萄糖和磷酸盐至初始浓度。

[0034] 所述的葡萄糖的初始浓度为20～35g/L；优选20g/L。

[0035] 所述的磷酸盐优选为磷酸二氢钾。

[0036] 所述的磷酸二氢钾的初始浓度为0.7g/L。

[0037] 步骤S3中所述的光发酵罐为5～10000L的光发酵罐；优选为5L的光发酵罐。

[0038] 步骤S3中所述的发酵条件为：pH值为1～4(优选为2.5～3.0；更优选为2.5)，培养‑2 ‑1 ‑
温度为30～40℃(优选为35℃)，光照强度为65～300μmol m s (优选为200～300μmol m
2 ‑1 ‑2 ‑1
s ；更优选为230μmol m s )，通气量为100～300L/h(优选为150L/h)，搅拌速率为100～
200r/min(优选为150r/min)。

[0039] 步骤S3中所述的超高氨氮废水占光发酵罐容积的70％左右(如5L光发酵罐，装液量为3.5L左右)。

[0040] 所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，在步骤S3之后还包括如下步骤：

[0041] S4、将步骤S3中取出的部分藻液离心洗涤，收集藻泥，再真空冷冻干燥，得到富含藻胆蛋白的藻粉。

[0042] 所述的利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法在高氨氮废水处理和/或生产藻胆蛋白中的应用。

[0043] 所述的高氨氮废水为氨氮浓度高于2800mg/L的高氨氮废水；优选为氨氮浓度为2800～10000mg/L的高氨氮废水；进一步优选为氨氮浓度为3300～7000mg/L的高氨氮废水；
再进一步优选为氨氮浓度为4700～6800mg/L的高氨氮废水；更优选为氨氮浓度为5500～
6800mg/L的高氨氮废水。

[0044] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0045] (1)本发明提供了一种利用极端环境微藻非灭菌发酵法快速脱氨氮的方法，该方法中经适应性培养的嗜硫原始红藻可直接处理氨氮浓度高达5000mg/L以上的废水，处理过
程无需对废水进行稀释和灭菌处理，该技术体系简单有效，废水处理周期短，效率高，绿色
环保，不会产生二次污染，且大大节约能耗与降低成本，该方法可快速解决高氨氮废水带来
的环境污染问题。

[0046] (2)本发明方法中经高氨氮废水培养的红藻，其藻粉内积累了高价值的藻胆蛋白和高含量的蛋白质，该体系可为优质的高蛋白生产及其下游产品生产提供原材料，因此，该
方法在实现快速废水脱氨氮的同时可实现资源的综合开发利用，符合可持续发展的战略。

[0047] (3)本发明所提供的方法和废水处理体系，不仅可快速降低废水中氨氮浓度，还可克服非灭菌发酵培养体系中的微生物污染问题，使嗜硫原始红藻始终处于优势种群，不会
造成常规发酵中的细菌污染放罐问题，尤其是大大降低了潜在致病菌所在类群的种群丰
度，使处理后的废水生物安全性更有保障。在超高氨氮浓度环境中，经适应性培养的嗜硫原
始红藻对废水中氨氮的去除速率达到1240mg/L/d，是目前已报道的最高值。

附图说明

[0048] 图1为嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)在适应性培养中的生物量、氨氮浓度变化、蛋白质和藻胆蛋白积累图；其中，A为生物量变化图；B为氨氮浓度变化图；C为蛋白
质和藻胆蛋白产量图。

[0049] 图2为嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)在非灭菌废水培养基中培养的细胞生长、氨氮浓度变化以及微生物物种分布图；其中，A为嗜硫原始红藻在非灭菌废水培养
基中的细胞生长情况；B为嗜硫原始红藻在非灭菌废水培养基中的氨氮和磷酸盐浓度变化；
C为嗜硫原始红藻在非灭菌废水培养基中的微生物物种分布(潜在致病菌所在的类群使用
黑色实线方框在图例中标注)。

[0050] 图3为嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)在四阶段非灭菌发酵体系下的生物量，氨氮浓度和磷酸盐浓度变化，以及蛋白质和藻胆蛋白积累情况图；其中，A为生物量变
化图；B为氨氮浓度和磷酸盐浓度变化图；C为蛋白质和藻胆蛋白积累情况图。

[0051] 图4为嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)在三阶段非灭菌发酵体系下的生物量，氨氮浓度和磷酸盐浓度变化，以及蛋白质和藻胆蛋白积累情况图；其中，A为生物量变
化图；B为氨氮浓度和磷酸盐浓度变化图；C为蛋白质和藻胆蛋白积累情况图。

具体实施方式

[0052] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列
实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的
实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

[0053] 本发明实施例中的微藻均选用嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)UTEX 2919，购于美国UTEX藻种库。

[0054] 本发明实施例中所选用的高氨氮工业废水为催化剂生产废水，其原废水中氨氮浓2+ + 2+ 2+ 2+
度为2800～10000mg/L，盐度为30～40‰，pH为6.0～8.0，微量元素(Mg 、K、Ca 、Mn 、Cu 、
2+
Zn )浓度范围为0～400mg/L。

[0055] 本发明实例中采取的检测方法可参照如下说明：

[0056] (一)嗜硫原始红藻细胞密度的测定

[0057] 将样品进行稀释，并用300目滤布过滤，随后使用流式细胞仪测定细胞密度。流式细胞仪的激发光为488nm的氩离子激光，测定过程中对细胞的前向散射光信号(Forward 
scatter，FSC)和侧向散射光信号(Side scatter，SSC)进行采集。流式细胞仪采集参数设置
为：样本流速为30μL/min，记录时间为30sec，记录10000个以上的细胞数据，并使用
CytExpert 1.2软件分析数据。根据下列公式计算细胞生长到达稳定期前的平均比生长速
率：

[0058] μ＝(ln Nt‑ln N0)/(T2‑T1)；

[0059] 式中：μ为细胞生长到达稳定期前的平均比生长速率，单位为d‑1；N0和Nt分别为第0天和时间t对应的细胞密度，单位为cells/mL；(T2‑T1)为到达稳定期的时间，单位为d。

[0060] (二)嗜硫原始红藻生物量干重浓度的测定

[0061] 取2ml嗜硫原始红藻藻液于预先称重的离心管中，在8000rpm转速条件下离心3min，弃上清，随后使用去离子水重悬藻泥，再次离心弃去上清获得藻泥。将藻泥置于烘箱
中60℃烘干至恒重，测定并记录总重量，按照以下公式计算生物量和生物量产率：

[0062] 生物量(g/L)＝(M2‑M1)/0.002；

[0063] 式中：M1为离心管空管质量(g)；M2为烘干后含藻泥的离心管总质量(g)。

[0064] 生物量产率(mg/L/d)＝(C2‑C1)/(T2‑T1)；

[0065] 式中：C1和C2分别为时间T1和时间T2对应的生物量干重，单位为mg/L。

[0066] (三)培养基中葡萄糖浓度的测定

[0067] 将一定体积的样品置于8000rpm转速条件下离心3min，取上清并将其稀释至可测定范围(0.00～1.00g/L)，随后采用SBA‑40D生物传感分析仪测定上清液中葡萄糖浓度。首
先使用葡萄糖标准液定标，定标通过后吸取25μL样液进行测定，记录读数，每个样品重复测
定三次后取平均值。使用制作的标准曲线对测定读数进行换算，换算结果乘以稀释倍数即
为样品的实际葡萄糖浓度值。

[0068] (四)废水中氨氮浓度的测定

[0069] 将一定体积的样品置于8000rpm转速条件下离心3min，取上清并稀释至可测定的范围(0.00～10.00mg/L)，稀释至终体积为10mL。采用意大利HANNA HI83200多参数水质分
析仪测定氨氮浓度，记录读数，每个样品重复测定三次后取平均值。根据制作的标准曲线对
测定读数进行换算，换算结果乘以稀释倍数即为样品的实际氨氮浓度值。氨氮去除速率则
按照以下公式进行计算：

[0070] NH4+去除速率(g/L/d)＝(Ct‑C0)/(Tt‑T0)；

[0071] 式中：Ct和C0分别为时间t和第0天下的氨氮浓度，单位为g/L；(Tt‑T0)为培养的时间，单位为d。

[0072] (五)废水中磷酸盐浓度的测定

[0073] 将一定体积的样品置于8000rpm条件下离心3min，取上清并将其稀释至可测定范围(0.00～30.00mg/L)，稀释至终体积为10mL。采用意大利HANNA HI83200多参数水质分析
仪测定磷酸盐浓度，记录读数，每个样品重复测定三次后取平均值。根据制作的标准曲线对
测定读数进行换算，换算结果乘以稀释倍数即为样品的实际磷酸盐浓度值。

[0074] (六)藻胆蛋白含量的测定

[0075] 称取一定质量的藻粉于2mL离心管中，加入1mL磷酸盐缓冲液(0.05mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)和适量研磨珠，随后用液氮迅速冷冻并置于组织破碎仪中破碎2min，重复
冷冻破碎操作直至细胞完全破碎(直至显微镜下不能观察到完整的细胞)。将破碎后的细胞
悬液置于13200rpm转速条件下离心30min，收集上清液于15mL离心管中。随后加入缓冲液重
悬沉淀物，并重复上述操作直至提取后上清无明显的蓝绿色。将色素提取液定容至一定体
积，测量稀释后的色素提取液在562、618、652nm处吸光值，再根据下列公式计算对应藻蓝蛋
白(Phycocyanin，PC)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)和藻红蛋白(Phycoerythrin，
PE)浓度、藻胆蛋白(Phycobiliprotein，PBP)含量和产量：

[0076] c(PC)＝(OD618‑0.474×OD652)/5.34；

[0077] c(APC)＝(OD652‑0.208×OD618)/5.09；

[0078] c(PE)＝(OD562‑2.41×c(PC)‑0.849×c(APC))/9.62；

[0079] c(PBP)＝(c(PC)+c(APC)+c(PE))×V/M；

[0080] 式中：c为相应藻胆蛋白的浓度，单位为mg/mL；V为定容体积，单位为mL；M为藻粉质量，单位为g。

[0081] PBP产量(g/L)＝藻胆蛋白含量×0.001×生物量；

[0082] 式中：藻胆蛋白含量单位为mg/g；生物量单位为g/L。

[0083] (七)总蛋白含量的测定

[0084] 此部分采用凯氏定氮法进行。称取100～150mg的藻粉，并使用称量纸包裹好；随后置于消化管中，加入8g硫酸铜‑硫酸钾混合粉末(质量比＝1:15)和10ml浓硫酸(质量百分数
98％的浓硫酸)，消化过夜。将消化过夜后的消化管置于消化炉中在150℃保持40min和420
℃保持150min以进行消化，消化完毕后冷却消化管。随后，置于凯氏定氮仪中进行定氮，并
使用0.1mol/L的盐酸标准液进行滴定。按照以下公式计算相应样品的蛋白含量和产量：

[0085] 蛋白质含量(％DCW)＝((V1‑V2)×c×0.014×6.25)/M；

[0086] 式中：V1‑V2为消耗的盐酸体积，单位为ml；c为盐酸标准液浓度，单位为mol/L；M为藻粉质量，单位为g。

[0087] 蛋白质产量(g/L)＝蛋白质含量×生物量产量

[0088] 式中：蛋白质含量单位为％DCW；生物量产量单位为g/L。

[0089] 实施例1超高氨氮工业废水对嗜硫原始红藻的适应性培养

[0090] 1.1藻种的活化

[0091] 将嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria UTEX 2919)单藻落从固体培养基中挑出并接种于调整配方后的2MA培养基中进行培养，培养基pH值为2.5，葡萄糖浓度为20g/L，
‑2 ‑1
在培养温度为35℃，光照强度为210μmol m s ，转速为150rpm的恒温光照摇床中进行培养
(培养至对数生长期)。其中，调整配方后的2MA培养基配方如表1所示。

[0092] 表1调整配方后的2MA培养基配方

[0093]

[0094]

[0095] 注：EDTA为乙二胺四乙酸；原2MA培养基配方中(NH4)2SO4浓度为2.62g/L。

[0096] 1.2废水培养基的配制

[0097] 1.2.1使用孔径为0.8μm的微孔滤膜对超高氨氮工业废水进行过滤，根据超高氨氮废水中的初始氨氮浓度进行调节(使用去离子水将废水稀释)，使其初始氨氮浓度范围为
5500～7000mg/L，随后添加调整配方后的2MA培养基配方(表1)中的营养元素(除硫酸铵外)
于滤后废水中(使废水中各营养元素的含量与表1中的相同)，并添加终浓度为20g/L葡萄糖
为主要碳源，得到废水培养基；然后利用10％(v/v)硫酸溶液调节废水培养基pH值至2.5，并
将废水培养基分装至250mL锥形瓶中，装液量为100mL，得到非灭菌超高氨氮废水培养基。

[0098] 1.2.2将上述配制的非灭菌超高氨氮废水培养基在115℃下进行高温高压灭菌20min，得到灭菌超高氨氮废水培养基。

[0099] 1.3适应性培养

[0100] 1.3.1混养培养：取一定体积的种子液于无菌离心管中并将其置于4000r/min条件下离心3min，弃上清，使用灭菌超高氨氮废水培养基重悬细胞并接种，接种密度为1×
8
10 cells/mL。将接种后的培养基置于恒温光照摇床中培养至葡萄糖耗尽，培养温度为35
‑2 ‑1
℃，光源为全光谱LED灯，光照强度为210μmol m s 。当葡萄糖耗尽后再取一定体积的上述
培养液，将其离心去上清并接种至新的灭菌超高氨氮废水培养基中作为微藻的第二次适应
性培养，重复上述操作进行四次适应性培养；其中第一批次初始氨氮浓度为6550mg/L，第二
批次初始氨氮浓度为6530mg/L，第三批次初始氨氮浓度为6780mg/L，第四批次初始氨氮浓
度为6730mg/L。

[0101] 1.3.2分析检测：培养期间每天取一次样，观察培养过程中干重、葡萄糖、NH4+的变化情况。培养结束后回收剩余藻液，将其离心洗涤多次后收集藻泥。将藻泥进行真空冷冻干
燥以获得藻粉，并对其藻胆蛋白含量进行测定。

[0102] 1.3.3产能分析结果：在第三次适应性培养中，嗜硫原始红藻中藻胆蛋白含量和产量最高，分别为14.12％和1963.32mg/L，总蛋白含量为9680mg/L，此时该藻生长速率最高为
‑1 +
0.40d ，NH4去除速率最高为0.38mg/L/d(图1)。表明适应性培养可在一定程度上提高废水
中氨氮的去除速率与效率。

[0103] 实施例2非灭菌培养体系对嗜硫原始红藻氨氮去除效率的影响

[0104] 2.1藻种活化和废水培养基配制

[0105] 嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria UTEX 2919)活化和非灭菌超高氨氮废水培养基的配制分别按1.1和1.2所述的方法进行。

[0106] 2.2非灭菌培养体系对嗜硫原始红藻的培养

[0107] 2.2.1混养培养：将藻种接种至含100mL(容积为250mL)非灭菌超高氨氮废水培养基的锥形瓶中，其中初始氨氮浓度为2800mg/L，以不接种红藻的非灭菌废水培养基为空白
8
组。培养体系的红藻的接种密度为1×10cells/ml，培养基pH值为2.5，葡萄糖浓度为20g/
‑2 ‑1
L。在培养温度为35℃，光照强度为210μmol m s ，转速为150rpm的恒温光照摇床中进行培
养至葡萄糖耗尽。

[0108] 2.2.2分析检测：培养结束后吸取2ml培养液，于3000rpm条件下离心5min，上清液使用一次性无菌注射器经0.45μm微孔滤膜过滤，所得滤膜中含有微生物。随后迅速将滤膜
置于液氮中冷冻，并转移至‑80℃冰箱中保存。样本经基因组DNA提取后，用带有barcode的
特异性引物扩增16S rDNA的高可变区V3+V4区，引物序列为:341F:5’‑CCTACGGGNGGCWGCAG‑
3’；806R:5’‑GGACTACHVGGGTATCTAAT‑3’，对获得的PCR条带进行切胶回收和定量，随后构建
测序文库并进行高通量测序以获得样本的数据信息。下机数据经过滤剔除低质量reads后，
对剩余高质量的clean data作拼接及分析，以获得物种分类和丰度信息，并对样本的微生
物群落丰度和多样性作分析。其余检测及分析方法同1.3.2。

[0109] 2.2.3产能分析结果：非灭菌培养体系中嗜硫原始红藻对氨氮的去除速率、去除效率和藻胆蛋白含量分别为0.34g/L/d、49.37％和84.59mg/g(图2)。对废水中的微生物群落
进行分析，结果表明非灭菌废水体系中细菌含量极显著低于空白组。原废水中的优势菌群
为变形菌门(Proteobacteria)39.42％、放线菌门(Actinobacteria)14.70％、酸杆菌门
(Acidobacteria)10.80％、浮霉菌门(Planctoycetes)9.93％和绿弯菌门(Chloroflexi)
4.70％，此五类细菌约占总细菌丰度的80％。经过该红藻的培养后，原废水中的微生物丰度
和多样性急剧下降；其中，变形菌门细菌的相对丰度降至1.69％、放线菌门细菌的相对丰度
降至2.14％，其余三种细菌的相对丰度则降至1％以下。表明非灭菌培养体系可抑制原废水
中细菌的大量繁殖(见图2)。

[0110] 实施例3嗜硫原始红藻在发酵罐培养体系下对超高氨氮工业废水的连续处理

[0111] 3.1藻种活化和废水培养基配制

[0112] 嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria UTEX 2919)活化和非灭菌超高氨氮废水培养基的配制分别按1.1和1.2所述方法进行。

[0113] 3.2四阶段的发酵罐培养

[0114] 3.2.1光发酵培养：将实施例1中1.3适应性培养后的红藻接种于非灭菌超高氨氮废水培养基中，并置于5L发酵罐(含3.5L废水培养基)中进行培养。光发酵在红藻的初始接
8
种密度为1×10 cells/ml，培养基pH值为2.5，温度为35℃、搅拌速率为150r/min、通气量为
‑2 ‑1
150L/h，LED灯供应的电流为230μmol m s 的培养条件下进行培养。第一阶段的初始氨氮
浓度为3360mg/L，第二阶段初始氨氮浓度为5190mg/L，第三阶段初始氨氮浓度为5540mg/L，
第四阶段初始氨氮浓度为5520mg/L。当第一批次废水培养基中的氨氮浓度降低到600mg/L
时更新废水，具体操作为：取出一部分藻液后再补进去一定体积的废水培养基至终体积为
3.5L，使后续的第二至第四批次的废水培养基中初始氨氮浓度为5500mg/L，在氨氮浓度降
低到100mg/L时更新废水。培养过程中当葡萄糖浓度低于5g/L时，补加葡萄糖至终浓度为20
～35g/L；磷酸盐浓度低于100mg/L时，补加磷酸盐(即磷酸二氢钾)至终浓度为0.7g/L。

[0115] 3.2.2分析检测：检测及分析方法同1.3.2。

[0116] 3.2.3产能分析结果：该体系中NH4+去除速率为0.69～1.71g/L/d，其对应的NH4+去除率为81.71～98.88％，该体系下获得的氨氮去除速率为目前已报道内容中的最大值；该
体系所回收得到的生物质中藻胆蛋白含量为3.06％～4.15％，对应的藻胆蛋白产量为
859.56～2471.71mg/L，总蛋白产量为16.24～31.85g/L，生物量产率为173.02～555.07mg/
+
L/d。表明发酵罐体系可显著提高嗜硫原始红藻的NH4去除速率以及藻胆蛋白生产效率(图
3)。

[0117] 3.3三阶段的发酵罐培养

[0118] 3.3.1光发酵培养：将该红藻接种于非灭菌超高氨氮废水培养基中，并置于5L发酵罐(含3.5L废水培养基)中进行培养。当每一批次培养基中氨氮浓度小于20mg/L时更新废
水，更新操作为：从发酵罐中取出一部分藻液，并加入一定体积含有基础营养元素的废水至
发酵罐总装液量为3.5L，第一阶段的初始氨氮浓度为4700mg/L，第二阶段初始氨氮浓度为
5500mg/L，第三阶段初始氨氮浓度为5800mg/L。其余培养参数按3.2.1所述进行。

[0119] 3.3.2分析检测：检测及分析方法同1.3.2。

[0120] 3.3.3产能分析结果：本发明中的红藻对超高氨氮废水的耐受性是目前已知的耐受性最高的藻种，非灭菌培养体系中第二批次的红藻培养可在4.5天内去除5500mg/L氨氮，
去除率达到100％；可获得的氨氮去除速率为0.59～1.24g/L/d。该体系中可获得的生物量
浓度为50.95～65.33g/L，藻胆蛋白含量和产量分别为16.47～22.36mg/g和1.06～1.18g/
L，蛋白质含量为43.69～50.14％DCW(图4)。表明该红藻对超高氨氮废水耐受性和适应性
强，在超高氨氮浓度废水中亦可快速去除废水中氨氮。

[0121] 综合实施例1～3结果表明，经超高氨氮废水培养基的适应性培养后，嗜硫原始红藻对氨氮的耐受性与适应性增强。且经发酵罐扩大化培养后，氨氮去除效率与去除速率极
显著高于摇瓶体系。对该非灭菌培养体系进行的微生物群落分析表明，加入嗜硫原始红藻
培养的超高氨氮废水中，其原废水的主要细菌的相对丰度下降。表明高氨氮、高盐以及细菌
水平均不会对该体系的高效运行产生较大的影响。此外，该体系成本低、效率高且绿色环
保。

[0122] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。