水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7及其应用转让专利
申请号 : CN202010902374.8
文献号 : CN111961676B
文献日 : 2021-09-17
发明人 : 陈铭学 , 关美艳 , 牟仁祥 , 曹赵云 , 朱智伟
申请人 : 中国水稻研究所
摘要 :
本发明公开了一种水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7及其应用。水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7，野生OsCOPT7基因的编码区发生碱基突变，即ATG下游第344个碱基由G突变为A，即编码区第115个密码子由GGG变为GAG，致使蛋白序列中第115位氨基酸由甘氨酸（Gly/G）突变为谷氨酸（Glu/E）。所述的突变基因OsCOPT7的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。突变体lc1的水稻籽粒中铜含量显著低于野生型水稻籽粒的铜含量。所述突变体的应用，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖中的一种或者多种；所述的突变基因OsCOPT7的应用，使水稻包含所述的突变基因OsCOPT7，或使水稻包含所述的突变基因OsCOPT7的编码氨基酸。
权利要求 :
1.一种水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7，其特征在于，野生OsCOPT7基因的编码区发生碱基突变，即ATG下游第344个碱基由G突变为A，对应为编码区第115个密码子由GGG变为GAG，编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的水稻籽粒低铜积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7，其特征在于，所述的突变基因OsCOPT7的编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，即野生型OsCOPT7蛋白序列中第115位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸。
3.一种如权利要求1所述的水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7在降低水稻铜积累中的应用，其特征在于，使水稻包含如权利要求1中所述的突变基因OsCOPT7；或使水稻包含如权利要求2中所述的突变基因OsCOPT7的编码氨基酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方式包括转基因、杂交、回交或无性繁殖中的一种或者多种。
5.一种表达盒或重组载体，其特征在于，含有如权利要求1中所述的突变基因OsCOPT7。
说明书 :
水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及了一种水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7及其应用。
背景技术
[0002] 铜（Copper，Cu）是我国耕地土壤重金属污染主要元素之一。许多研究表明，铜过量积累抑制植株的生长，并影响相关生理过程。另外，铜作为辅酶因子参与多种生化反应过
程，在人体内以铜蓝蛋白和铜酶的形式存在，是生命健康所必须的微量元素。而适量的铜摄
入是对居民身体健康至关重要。稻米是我国居民主要粮食，培育适用于铜污染土壤的铜低
积累水稻品种意义重大。由于水稻不同品种间的铜积累能力差异明显，通过选择籽粒中铜
低积累的水稻品种种植，是一种经济有效的途径。
程，在人体内以铜蓝蛋白和铜酶的形式存在，是生命健康所必须的微量元素。而适量的铜摄
入是对居民身体健康至关重要。稻米是我国居民主要粮食，培育适用于铜污染土壤的铜低
积累水稻品种意义重大。由于水稻不同品种间的铜积累能力差异明显，通过选择籽粒中铜
低积累的水稻品种种植，是一种经济有效的途径。
[0003] 水稻籽粒中铜含量受根系对铜的吸收、转运和再分配过程的影响，且这一过程受遗传控制。近些年，一些参与水稻铜吸收、转运和韧皮部转运的基因和转运蛋白已陆续被发
现。铜元素进入植物根系后，主要由重金属ATP酶（P1B‑ATPase，HMA）家族转运蛋白参与其转
运过程，在水稻中对应为转运蛋白OsHMA4‑9。另外铁转运蛋白OsYSL1和OsYSL3、锌转运蛋白
OsZIP2和OsZIP4等基因可能也参与植物对铜的转运过程。而定位于韧皮部的OsYSL16，可通
过转运Cu‑NA参与铜的再分配过程。CTR类高亲和铜转运蛋白（COPT）是与水稻根系对铜的吸
收过程的主要参与者，然而目前少有水稻COPT家族基因及蛋白功能的研究被报道，也没有
通过针对OsCOPT家族成员基因突变而获得籽粒中铜低积累的突变体。
现。铜元素进入植物根系后，主要由重金属ATP酶（P1B‑ATPase，HMA）家族转运蛋白参与其转
运过程，在水稻中对应为转运蛋白OsHMA4‑9。另外铁转运蛋白OsYSL1和OsYSL3、锌转运蛋白
OsZIP2和OsZIP4等基因可能也参与植物对铜的转运过程。而定位于韧皮部的OsYSL16，可通
过转运Cu‑NA参与铜的再分配过程。CTR类高亲和铜转运蛋白（COPT）是与水稻根系对铜的吸
收过程的主要参与者，然而目前少有水稻COPT家族基因及蛋白功能的研究被报道，也没有
通过针对OsCOPT家族成员基因突变而获得籽粒中铜低积累的突变体。
发明内容
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7及其应用。
[0005] 一种水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7，野生OsCOPT7基因的编码区发生碱基突变，即ATG下游第344个碱基由G突变为A，对应为编码区第115个密码子由GGG变为
GAG，编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的水稻铜低积累突变体lc1的籽粒中铜积累
量显著降低至野生型的20%以下。
GAG，编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的水稻铜低积累突变体lc1的籽粒中铜积累
量显著降低至野生型的20%以下。
[0006] 所述的水稻籽粒低铜积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7，所述的突变基因OsCOPT7的编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，野生型OsCOPT7蛋白序列中第115位氨基酸
由甘氨酸突变为谷氨酸。
由甘氨酸突变为谷氨酸。
[0007] 一种所述的水稻铜低积累突变体lc1的突变基因OsCOPT7的应用，使水稻包含所述的突变基因OsCOPT7；或使水稻包含所述的突变基因OsCOPT7的编码氨基酸。
[0008] 所述的应用，应用方式包括转基因、杂交、回交或无性繁殖中的一种或者多种。
[0009] 一种表达盒或重组载体，含有所述的突变基因OsCOPT7。
[0010] 本发明有益效果：
[0011] 本发明获得的突变体材料lc1的籽粒中铜含量降低至20%以下。因此，突变体lc1的OsCOPT7基因突变方式对籽粒铜积累影响显著，可在后续育种中发挥显著效果。而突变体
lc1可用于后续的铜污染土壤优势品种的构建和利用。
lc1可用于后续的铜污染土壤优势品种的构建和利用。
附图说明
[0012] 图1是野生型与铜低积累突变体（lc1）植株的基本参数图。
[0013] 图2是野生型和lc1植株糙米及稻穗中的铜含量图。
具体实施方式
[0014] 以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
[0015] 本发明以籼稻9311（Oryza_Indica）为野生型种子（M0代）并进行EMS诱变处理，种植处理的种子获得M1代植株。M1代植株自交产生种子（M2代），在田块上种植M2代植株，收获
的水稻籽粒脱壳后，用电感耦合等离子体光谱仪（ICP）测定糙米中的铜含量，筛选铜低积累
植株。将获得的水稻铜低积累株系进一步自交筛选，并在不同稻田种植验证，获得了一个稻
米铜积累量低、能稳定遗传的突变纯合单株，命名为lc1（low copper mutant 1），并用于杂
交育种和生物技术研究。
的水稻籽粒脱壳后，用电感耦合等离子体光谱仪（ICP）测定糙米中的铜含量，筛选铜低积累
植株。将获得的水稻铜低积累株系进一步自交筛选，并在不同稻田种植验证，获得了一个稻
米铜积累量低、能稳定遗传的突变纯合单株，命名为lc1（low copper mutant 1），并用于杂
交育种和生物技术研究。
[0016] 水稻铜低积累突变体lc1，所述突变位点位于水稻OsCOPT7基因起始密码子ATG下游下游第344个碱基由G突变为A，对应为CDS序列中第115个密码子由GGG变为GAG，使
OsCOPT7蛋白序列中第115位氨基酸由甘氨酸（Gly/G）突变为谷氨酸（Glu/E），导致lc1突变
体水稻籽粒中铜含量显著低于野生型水稻籽粒的铜含量。
OsCOPT7蛋白序列中第115位氨基酸由甘氨酸（Gly/G）突变为谷氨酸（Glu/E），导致lc1突变
体水稻籽粒中铜含量显著低于野生型水稻籽粒的铜含量。
[0017] 水稻铜低积累突变体lc1，其突变基因OsCOPT7核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0018] 一、水稻铜低积累突变体获取过程：
[0019] 2013年，将常规水稻野生型种子450g（此为M0），清水浸种12小时，用1.0%的甲磺酸乙酯（EMS）室温浸泡处理12小时，期间搅拌，弃去EMS处理液并用清水冲洗4小时。经诱变处
理的种子，经浸种、催芽后播种，25d秧龄后单本移栽，按常规肥水管理（此为M1）。成熟时，根
据结实率状况每株收获1～3穗，共收获4140个株。除单株种子保存外，每株随机取15粒混合
成M2种子。
理的种子，经浸种、催芽后播种，25d秧龄后单本移栽，按常规肥水管理（此为M1）。成熟时，根
据结实率状况每株收获1～3穗，共收获4140个株。除单株种子保存外，每株随机取15粒混合
成M2种子。
[0020] 2014年，M2种子浸种、催芽后播种，25d秧龄单本移栽于同一田块（土壤pH=7.5），按常规肥水管理。成熟后单株收获，共收获35689株。选取433株结实率低的和12527株正常结
实的水稻植株，收获后将对应植株籽粒脱壳后，用电感耦合等离子体光谱仪（ICP）测定糙米
中的铜等元素的含量。从中获得了一个水稻铜低积累材料，其糙米铜含量为1.4mg/kg，而对
应的野生型品种糙米铜含量为3.6‑4.1 mg/kg。
实的水稻植株，收获后将对应植株籽粒脱壳后，用电感耦合等离子体光谱仪（ICP）测定糙米
中的铜等元素的含量。从中获得了一个水稻铜低积累材料，其糙米铜含量为1.4mg/kg，而对
应的野生型品种糙米铜含量为3.6‑4.1 mg/kg。
[0021] 鉴于上一块土壤pH值较高，会影响水稻对铜的吸收。2015年，将获得的水稻铜积累材料种子于次年浸种、催芽后播种，25d秧龄单本移栽18株于土壤pH值为5.4的田块中，按常
规肥水管理。成熟后单株收获，共收获10株。收获后的水稻籽粒脱壳，用ICP测定糙米中的铜
含量，其中9株水稻的糙米铜含量明显低于野生型，浓度分布为1.7‑2.1mg/kg，而野生型品
种糙米铜含量分布为7.0‑8.2mg/kg。
规肥水管理。成熟后单株收获，共收获10株。收获后的水稻籽粒脱壳，用ICP测定糙米中的铜
含量，其中9株水稻的糙米铜含量明显低于野生型，浓度分布为1.7‑2.1mg/kg，而野生型品
种糙米铜含量分布为7.0‑8.2mg/kg。
[0022] 2016年，将上一年收获的9株低铜积累水稻材料种子于次年浸种、催芽后播种，于25d秧龄单本移栽18株于土壤pH值为5.4的田块中，按常规肥水管理。成熟后单株收获，籽粒
脱壳，用ICP测定糙米中的铜含量。结果显示，糙米中铜含量未出现分离现象，均低于野生型
植株稻米铜含量60%左右。其中1株系水稻的糙米铜含量显著低于野生型，浓度分别为1.5‑
2.3mg/kg，而野生型品种糙米铜含量分布为5.4‑6.8mg/kg。
脱壳，用ICP测定糙米中的铜含量。结果显示，糙米中铜含量未出现分离现象，均低于野生型
植株稻米铜含量60%左右。其中1株系水稻的糙米铜含量显著低于野生型，浓度分别为1.5‑
2.3mg/kg，而野生型品种糙米铜含量分布为5.4‑6.8mg/kg。
[0023] 鉴于上述株系植株的籽粒中铜低积累性状未出现分离，于2017年将该株系编号为K152，并筛选含量较低的柱系进行进一步自交纯化，在浙江富阳两地稻田中分别种植验证。
结果显示，突变体株系籽粒中铜含量均显著低于野生型，分别为野生型籽粒铜含量的7%和
10%，且均能稳定遗传。另外，于2018年在另一背景的田块中进行验证，结果显示突变体株系
仍具有显著的低铜优势。因此，取K152为籽粒铜低积累的突变体进行后续实验，命名为lc1
(low copper mutant 1)。
结果显示，突变体株系籽粒中铜含量均显著低于野生型，分别为野生型籽粒铜含量的7%和
10%，且均能稳定遗传。另外，于2018年在另一背景的田块中进行验证，结果显示突变体株系
仍具有显著的低铜优势。因此，取K152为籽粒铜低积累的突变体进行后续实验，命名为lc1
(low copper mutant 1)。
[0024] 二、铜低积累突变体lc1铜积累特性
[0025] 铜低积累突变体lc1的分蘖数、结实率和株高显著低于野生型，而其他主要农艺性状均与野生型没有显著差异（见图1）。
[0026] 2016、2017连续两年在杭州富阳常安的稻田种植，2018年在浙江富阳中水花苑稻田种植，结果均显示突变体lc1糙米中的铜含量均显著低于野生型；2019年浙江富阳中水花
苑稻田种植结果显示，突变体lc1植株稻穗和糙米中铜含量分别为野生型的50%和16%，详细
结果如图2所示。
苑稻田种植结果显示，突变体lc1植株稻穗和糙米中铜含量分别为野生型的50%和16%，详细
结果如图2所示。
[0027] 三、铜低积累突变体lc1突变基因的确定
[0028] 将野生型与铜低积累水稻突变体lc1品种进行杂交，所有F1植株均未表现低铜积累特性。当年冬季在海南将F1代自交，获得F2代分离群体。随机选取约500粒F2代种子，经浸
种、催芽后，于海南南繁基地种植，单株收获，用ICP测定糙米中的铜含量。F2分离群体中铜
在糙米中低积累和正常积累株呈典型的1：3分离，表明水稻lc1突变体的特殊性状受隐性单
基因控制。
种、催芽后，于海南南繁基地种植，单株收获，用ICP测定糙米中的铜含量。F2分离群体中铜
在糙米中低积累和正常积累株呈典型的1：3分离，表明水稻lc1突变体的特殊性状受隐性单
基因控制。
[0029] 进一步选择突变体lc1与野生型品种杂交的F2群体作为定位群体，在分离出的糙米中铜含量极低和极高表型中各选择30个单株，分别进行DNA提取，然后将30个样品DNA等
量混合构建DNA池，记为F2‑L和F2‑H并进行全基因组重测序。
量混合构建DNA池，记为F2‑L和F2‑H并进行全基因组重测序。
[0030] DNA提取按如下步骤进行：取约2cm长的水稻叶片置于装有钢珠的2ml离心管中；液氮冷冻后，用破碎仪将叶片打碎，取出并加入500ml的1.5×CTAB，室温下晃动试管至叶片粉
末与提取剂混合均匀；65℃水浴20‑30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的氯仿，上下颠
倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；吸取400ml上清液至新的离心管，200ml的异丙醇，
上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；离心后弃上清，加入500ml 75%乙醇，颠倒
漂洗，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100ml ddH2O 溶解DNA，
电泳检测DNA质量。
末与提取剂混合均匀；65℃水浴20‑30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的氯仿，上下颠
倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；吸取400ml上清液至新的离心管，200ml的异丙醇，
上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；离心后弃上清，加入500ml 75%乙醇，颠倒
漂洗，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100ml ddH2O 溶解DNA，
电泳检测DNA质量。
[0031] 基因组重测序步骤如下：获得DNA后，将群体两个亲本和两个子代极端表型混池DNA样品随机打断成长度为350bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit进行建
库，DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备，
构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。
库，DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备，
构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。
[0032] 测序共产生Raw data 36.381G，过滤后的Clean data为36.321 G，测序质量高（Q20≥96.83%、Q30≥91.69%），GC含量分别在42.98% 43.98%之间。综上，所有样本的数据量
~
足够，测序质量合格，GC分布正常，建库测序成功。
~
足够，测序质量合格，GC分布正常，建库测序成功。
[0033] 有效测序数据通过BWA软件比对到参考基因组Oryza_Indica，比对结果经SAMTOOLS去除重复，所有样本的比对率在96.35% 99.18%之间。比对结果正常，可用于后续
~
的变异检测及相关分析。
~
的变异检测及相关分析。
[0034] 采用GATK3.3软件的Unified Genotyper模块进行多个样本SNP的检测，使用Variant Filtration进行过滤，得到总的SNP为254,730个。其中外显子上的同义变异为
7435个，非同义变异为11698个。基于基因分型的结果，筛选两个亲本间纯合差异的标记，共
挑选出3743个多态性标记。根据子代SNP‑index在染色体上的分布情况，发现9号染色体即
为候选基因所在染色体。
7435个，非同义变异为11698个。基于基因分型的结果，筛选两个亲本间纯合差异的标记，共
挑选出3743个多态性标记。根据子代SNP‑index在染色体上的分布情况，发现9号染色体即
为候选基因所在染色体。
[0035] 对于候选的多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果，筛选出候选基因BGIOSGA030839，该候选基因CDS对应编码序列为铜转运蛋白OsCOPT7（Copper Transporter
7），其在突变体lc1中编码序列如SEQ ID No.1所示。候选基因位于9号染色体14863852‑
14864301bp间，lc1突变体中ATG下游344bp处发生碱基由G突变为A，导致OsCOPT7的氨基酸
序列中第115位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸（G115E），氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
7），其在突变体lc1中编码序列如SEQ ID No.1所示。候选基因位于9号染色体14863852‑
14864301bp间，lc1突变体中ATG下游344bp处发生碱基由G突变为A，导致OsCOPT7的氨基酸
序列中第115位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸（G115E），氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。