制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法

摘要

本发明涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法。该方法包括将所述动物同源染色体中一条上的内源性ctsd基因替换为h‑CTSD*基因；所述h‑CTSD*基因为发生c.262dupC位点变异的人源ctsd基因。本申请首次发现h‑CTSD*基因与RP相关，并建立了h‑CTSD*基因敲入的小鼠动物模型。本发明为研究CTSD突变与视网膜色素变性的关系及其致病机理提供了便捷、可靠、经济的手段，为其研究提供了可靠的理论依据。更为重要的是，该动物除RP外并不表现出痉挛、神经元蜡样脂褐质沉积、共济失调等神经性疾病症状，病理学背景更单纯，非常适合于作为RP动物模型的构建。

权利要求

1.制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法，其特征在于，包括：将所述动物同源染色体中一条上的内源性ctsd基因替换为h‑CTSD*基因；

所述h‑CTSD*基因为发生c.262dupC位点变异的人源ctsd基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用Crispr‑Cas9系统将所述内源性ctsd基因敲除，并用所述h‑CTSD*基因替换敲除的内源性ctsd基因；

其中所述Crispr‑Cas9系统包括sgRNA1，sgRNA2和Cas9酶，sgRNA1，sgRNA2所对应的靶位点序列为SEQ ID NO:1和2所示；

所述h‑CTSD*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述h‑CTSD*基因还连接有报告基因或编码标签蛋白的序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述h‑CTSD*基因替换敲除的内源性ctsd基因的方法为同源重组。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述h‑CTSD*基因两侧添加核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和5所示左侧同源臂和右侧同源臂以实现同源重组。

6.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其特征在于，所述基因敲除和h‑CTSD*基因替换处理的对象为受精卵的内源性ctsd基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Crispr‑Cas9系统和所述h‑CTSD*基因转入所述受精卵的方法为显微注射。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将处理后受精卵移植到假孕雌 性动物体内并产出F0代，将正确表达h‑CTSD*基因的F0代动物与野生型动物交配获得F1代。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为啮齿类动物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物是小鼠(Mus musculus)。

11.权利要求1～10任一项所述方法得到的动物在鉴别和/或测试药物中的用途；

所述药物用于预防和/或治疗的适应症为视网膜色素变性和/或治疗与视网膜色素变性相关的并发症。

说明书

制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学与生物医学技术领域，具体而言，涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法。

背景技术

[0002] CRISPR/Cas9技术是近几年发展起来的一种新基因编辑技术，由古细菌和细菌在长期选择性压力中形成的适应性免疫防御发展而来，可以有效抵御外源DNA的入侵。该免疫
系统由Cas9蛋白、CRISPR RNAs(crRNAs)和trans‑activating crRNAs(tracrRNA)三个组分
组成，在免疫防御的过程中，向导crRNA指引Cas9蛋白靶向到外源基因并进行剪切。据此，人
们在体外对crRNA‑tracrRNA进行改造，得到一段可以识别NGG PAM(protosp aceradjacent 
motif)序列和目的基因的sgRNA，同时可以与Cas9蛋白结合，指导其在PAM上游3～8bp处进
行切割，形成DSB(double strand break)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重
组的末端接合(Non‑Homologous End Joining，NHEJ)方式，另一种是同源重组修复
(Homology Directed Repair，HDR)方式，后者需要导入同源片段作为修复模板。NHEJ修复
方式可能产生碱基的插入或缺失，也可能突变成终止密码子，从而影响目的基因的表达。

[0003] 视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组由多种发病机制引起的、主要累及光感受器和色素上皮的进行性视网膜变性疾病。视网膜色素变性是最常见的遗传性
视网膜营养不良，人群中发病率约l/3500～1/7500。RP具有高度的遗传异质性，已发现至少
有87个基因可以导致RP(参考RetNet网站：http://sph.uth.edu/retnet/)。这些基因的突
变可分别导致常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X连锁遗传RP。

[0004] 组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)是Westley等于1979年发现的一种天冬氨酸类溶酶体肽链内切酶，CTSD基因(Gene ID:1509)位于11p15.5，还有9个外显子。其正常功能是
在溶酶体的酸性环境中水解蛋白质。在pH2.8～5.0的范围内，CTSD(最适pH值为4)能够降解
激素、多肽前体、多肽、结构及功能蛋白质。CTSD基因敲除小鼠出生后26天(P26)死亡，并伴
有眼盲、痉挛和神经元蜡样脂褐质沉积(Neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL)。目前，已
有报道CTSD基因错义突变(常染色体隐性突变)会引起NCL，并且CTSD还参与了其他几种疾
病的发病机制，包括乳腺癌和阿尔茨海默病。

[0005] 基于CTSD的上述特性，现有技术中有诸多对其突变位点的研究，部分研究结果整理如下：

[0006]

[0007]

[0008] 可见，虽然现有技术中已有CTSD的部分突变会导致RP的相关报道，但其常常还伴随着多种神经系统症状，例如NCL、共济失调、认知能力衰退等问题，其病理学背景复杂，因
而具有上述突变的动物很难用于RP机制研究或相关药物的筛选研究。

发明内容

[0009] 本发明涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法，包括：

[0010] 将所述动物同源染色体中一条上的内源性ctsd基因替换为h‑CTSD*基因；

[0011] 所述h‑CTSD*基因为发生c.262dupC位点变异的人源ctsd基因。

[0012] 可选的，使用Crispr‑Cas9系统将所述内源性ctsd基因敲除，并用所述h‑CTSD*基因替换敲除的内源性ctsd基因；

[0013] 其中所述Crispr‑Cas9系统包括sgRNA1，sgRNA2和Cas9酶，sgRNA1，sgRNA2所对应的靶位点序列为SEQ ID NO:1和2所示；

[0014] 所述h‑CTSD*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0015] 可选的，所述h‑CTSD*基因还连接有报告基因或编码标签蛋白的序列。

[0016] 可选的，所述h‑CTSD*基因替换敲除的内源性ctsd基因的方法为同源重组。

[0017] 可选的，所述h‑CTSD*基因两侧添加核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和5所示左侧同源臂和右侧同源臂以实现同源重组。

[0018] 可选的，所述基因敲除和h‑CTSD*基因替换处理的对象为受精卵的内源性ctsd基因。

[0019] 可选的，所述Crispr‑Cas9系统和所述h‑CTSD*基因转入所述受精卵的方法为显微注射。

[0020] 可选的，所述方法还包括将处理后受精卵移植到假孕磁性动物体内并产出F0代，将正确表达h‑CTSD*基因的F0代动物与野生型动物交配获得F1代。

[0021] 可选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物。

[0022] 可选的，所述非人哺乳动物是小鼠(Mus musculus)。

[0023] 根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上述方法得到的动物在鉴别和/或测试药物中的用途；

[0024] 所述药物用于预防和/或治疗的适应症为视网膜色素变性和/或治疗与视网膜色素变性相关的并发症。

[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0026] 本申请首次发现h‑CTSD*基因与RP相关，并建立了h‑CTSD*基因敲入的小鼠动物模型。本发明为研究CTSD突变与视网膜色素变性的关系及其致病机理提供了便捷、可靠、经济
的手段，为其研究提供了可靠的理论依据。更为重要的是，该动物除RP外并不表现出痉挛、
神经元蜡样脂褐质沉积、共济失调等神经性疾病症状，病理学背景更单纯，非常适合于作为
RP动物模型的构建。

附图说明

[0027] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0028] 图1为CRISPR/Cas9 gene targeting示意图；

[0029] 图2为本发明打靶策略示意图；

[0030] 图3为本发明一个实施例中经PCR扩增后电泳，得到的目的条带(左侧插入位点)；

[0031] 图4为本发明一个实施例中经PCR扩增后电泳，得到的目的条带(右侧插入位点)；

[0032] 图5为本发明一个实施例中h‑CTSD*‑KI小鼠眼底照。

具体实施方式

[0033] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对
本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部
分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0034] 因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普
通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方
面。

[0035] 本发明涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法，包括：

[0036] 将所述动物同源染色体中一条上的内源性ctsd基因替换为h‑CTSD*基因；

[0037] 所述h‑CTSD*基因为发生c.262dupC位点变异的人源ctsd基因。

[0038] 本发明是基于RP患者中存在CTSD基因发生c.262dupC突变，进而构建了这种CTSD人源化突变(c.262dupC)KI非人动物模型，该基因突变可以导致RP尚未被其他实验室报道
(参考RetNet网站：http://sph.uth.edu/retnet/)，该基因突变与RP的关系及致病机理尚
不明确。h‑CTSD*基因纯合体会造成动物在出生后不久即死亡，但杂合体的胚胎发育正常，
并且动物出生后可发育为性成熟个体；并且该动物不表现出神经性疾病症状，也并未发现
其具有除RP以外的其他明显疾病症状，因而该动物模型为在体内研究CTSD突变与视网膜色
素变性的关系及其致病机理提供便捷、可靠、经济的手段。

[0039] 在一些实施方式中，所述方法使用Crispr‑Cas9系统将所述内源性ctsd基因敲除，并用所述h‑CTSD*基因替换敲除的内源性ctsd基因；

[0040] 其中所述Crispr‑Cas9系统包括sgRNA1，sgRNA2和Cas9酶，sgRNA1，sgRNA2所对应的靶位点序列为SEQ ID NO:1和2所示；

[0041] 所述h‑CTSD*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0042] 目前，CTSD人源化突变KI的小鼠模型未见相关报道。因此发明人设计了本发明一种CTSD人源化突变KI动物模型的构建方法及其应用，基于CRISPR/Cas9基因敲入技术构建
CTSD人源化突变(c.262dupC)敲入动物模型，在动物ctsd基因转录本的第一个外显子起始
密码子ATG附近进行切割，破坏ctsd基因，在同源重组模板存在的情况下，使人源的突变的
CTSD基因插入。CRISPR/Cas9技术可以直接编辑胚胎，得率较高，整体胚胎的质量更好，并且
具有敲入率高的优点。

[0043] 在一些实施方式中，所述h‑CTSD*基因还连接有报告基因或编码标签蛋白的序列。

[0044] 报告基因可选择为本领域技术人员所熟知的代谢标记、催化型报告基因、抗生素标记、抗生素抗性基因、除草剂抗性基因、营养缺陷型报告基因、化合物解毒酶基因、以及糖
类代谢酶选择标记基因；

[0045] 在一些优选的实施方式中，为便于观察和检测，所述报告基因的表达产物为可通过催化底物反应自身发光或产生颜色变化、或可通过催化底物反应使底物发光或产生颜色
变化、或经过激发光照射而产生发射光或产生颜色变化的物质。此类物质较为代表性的包
括荧光蛋白、荧光素酶以及LacZ。荧光蛋白和荧光素酶都属于发光蛋白，可用照相机或类似
的装置来检测荧光表达。荧光蛋白通过吸收一种颜色的光(激发)，然后发出不同颜色(发
射)的较低能量光来起作用。相反，荧光素酶(和其他生物发光酶)通过催化底物(即荧光素)
发生化学反应而发光。与上述两种标记不同，LacZ不发光。LacZ基因的产物β‑半乳糖苷酶可
以催化X‑gal转化成类似于靛蓝的不透明蓝色化合物。

[0046] 进一步地，荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可以采用经过改造后的
GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等；蓝色荧光蛋白可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄
色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana
等；红色荧光蛋白可以选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKate等。

[0047] 标签蛋白优选为HA标签。

[0048] 在一些实施方式中，所述h‑CTSD*基因替换敲除的内源性ctsd基因的方法为同源重组。

[0049] 同源重组臂的长度优选为1kb左右

[0050] 在一些实施方式中，所述h‑CTSD*基因两侧添加核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和5所示左侧同源臂和右侧同源臂以实现同源重组。

[0051] 在一些实施方式中，所述基因敲除和h‑CTSD*基因替换处理的对象为受精卵的内源性ctsd基因。

[0052] 在一些实施方式中，所述Crispr‑Cas9系统和所述h‑CTSD*基因转入所述受精卵的方法为显微注射。

[0053] 在一些实施方式中，所述方法还包括将处理后受精卵移植到假孕磁性动物体内并产出F0代，将正确表达h‑CTSD*基因的F0代动物与野生型动物交配获得F1代。

[0054] 在一些实施方式中，所述非人哺乳动物为啮齿类动物。

[0055] 在一些实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠(Mus musculus)。

[0056] 小鼠品系可以选择BALB/c、C57BL、C3H/He、昆明小鼠、ICR、NIH、CFW、LACA、nude小鼠或Scid小鼠等，优选C57BL小鼠。

[0057] 根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述方法得到的动物在鉴别和/或测试药物中的用途；

[0058] 所述药物用于预防和/或治疗的适应症为视网膜色素变性和/或治疗与视网膜色素变性相关的并发症。

[0059] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

[0060] 实施例

[0061] 本实施例提供了h‑CTSD*‑KI小鼠模型的构建及鉴定过程。

[0062] 一、材料

[0063] 本实施例所用小鼠品系为：C57BL/6J，代孕母鼠品系为C57BL/6J，购自上海斯莱克实验动物有限公司，将小鼠随机分为对照组与实验组。

[0064] 二、方法

[0065] 实验组按照以下方法进行实验：

[0066] 1、在目标基因内含子中寻找合适的靶序列

[0067] 通过在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)及gRNA的设计原则，评估小鼠Ctsd基因ATG序列附近得分较高的靶位点设计gRNA，靶位点序列为SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:2。

[0068] 基因序列及sgRNA信息如下：

[0069] sgRNA1：GCCGCGACCATGAAGACTCC CGG(SEQ ID NO:1)；

[0070] sgRNA2：GGGAGTCTTCATGGTCGCGG CGG(SEQ ID NO:2)；

[0071] 基因序列如下所示：

[0072] ‑‑‑GGAAAGTGGGCGGGCGCGTTCCCGAGAGCCGTGCGTAGGCCTGGAGTAGGGCACGCCTGCGCCCGGGCAGTGTTGGAGGCGGGTTCGGGTCGCCCCGCCCCTCGCCCGCGTCTCACGTGACCCGTTGAGGGCCAAACAAGC
GGGTCAGCTGACTCCGCGGGACTGCGGCGTCATCCTGCCTATAAGCCGGCGACCTCTGGCTTTAAGCTTTGCTCTC
TTCGGGCCGCCGCGACCATGAAGACTCCCGGCGTCTTGCTGCTCATTCTCGGCCTCCTGGCTTCGTCCTCCTTCGC
GATTATCAGgtgaggacccgctctgggtccggagatgcggggctcgtcacctggagtgccgcgtgctccggccgtg
ctggaatgcacctgtgcacccagcgcagccttcctcagggtcccacagactatggggcgagacactcaaaaggcag
gggtctcctgggcccctctccactcctatgactcctatggtcgaacaggagggtacagtagggtggccacaagtgg
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ccgcttctgaggagaagtgctgccccatggataggattctgttgaacccagctgtggaagttggaaaacctagtag
gcccttgcccccctgaacttcctcaggcctttccttttaagggaccctgtttgacagctgtgcactggtgcatagc
cctagaagtttactcaaagatgatcccccctgt‑‑‑‑

[0073] 上述基因序列中大写下划线部分代表编码区；大写无下划线部分代表非编码区，小写部分代表内含子区。

[0074] 2、打靶载体的构建

[0075] 打靶载体核心序列如下所示：

[0076] gaacctggggaaccagaacagctcatgtgtccatgtgtagagtggacttagaggcatccacctcctcaatacaggtagaacatgtccaaaagcgctcccgggatcagaccctggcaaggctcctctgcgttcctgtccttgtat
ggacaccacctctcagagaggacattccccttaaatgcctttctgggctcagctctccatgatggagagctggact
ctgcctctctcaaacagcacccaattcatttgctgacaccaagcagggcattaaagagtgaagtagttaagaccca
agtggcgattgcaaccctggtctcatctcactgtacaccctaccccttgtatcaatagatgcatagtccaggacta
ggcctgcaatcaacattgctacattatggaatgtgcatgttaggtgttccagcttaaataaaaagggtgttgctct
ggggagatgagtaggtagtggagctttgaagagggtgaagtttgctggtccaagagtccagagaggctccagggaa
attctcaaggaggaacagagctgaaagagaaaaggcttaggtttaagctggcatccaggagagggtcagggcccaa
tcagacaaagaccacatcctggtagtgggcaccccaattatgcaaaaaagacagattaagggaggggcggagctga
gggcaggatccgcccctctggatgcttccgggcctgcctggtcttccttcccccacgtgacctgtatccagtcatt
ctccggtcccaggaaagtgggcgggcgcgttcccgagagccgtgcgtaggcctggagtagggcacgcctgcgcccg
ggcagtgttggaggcgggttcgggtcgccccgcccctcgcccgcgtctcacgtgacccgttgagggccaaacaagc
gggtcagctgactccgcgggactgcggcgtcatcctgcctataagccggcgacctctggctttaagctttgctctc
ttcgggccgccgcgacc(SEQ ID NO:4)ATGCAGCCCTCCAGCCTTCTGCCGCTCGCCCTCTGCCTGCTGGCTG
CACCCGCCTCCGCGCTCGTCAGGATCCCGCTGCACAAGTTCACGTCCATCCGCCGGACCATGTCGGAGGTTGGGGG
CTCTGTGGAGGACCTGATTGCCAAAGGCCCCGTCTCAAAGTACTCCCAGGCGGTGCCAGCCGTGACCGAGGGGCCC
ATTCCCGAGGTGCTCAAGAACTACATGGACGCCCAGTACTACGGGGAGATTGGCATCGGGACGCCCCCCCCAGTGC
TTCACAGTCGTCTTCGACACGGGCTCCTCCAACCTGTGGGTCCCCTCCATCCACTGCAAACTGCTGGACATCGCTT
GCTGGATCCACCACAAGTACAACAGCGACAAGTCCAGCACCTACGTGAAGAATGGTACCTCGTT(SEQ ID NO:3)
TACCCATACGACGTACCAGATTACGCT(HA Tag)TGAaagactcccggcgtcttgctgctcattctcggcctcct
ggcttcgtcctccttcgcgattatcaggtgaggacccgctctgggtccggagatgcggggctcgtcacctggagtg
ccgcgtgctccggccgtgctggaatgcacctgtgcacccagcgcagccttcctcagggtcccacagactatggggc
gagacactcaaaaggcaggggtctcctgggcccctctccactcctatgactcctatggtcgaacaggagggtacag
tagggtggccacaagtgggtctgactccaacctcgcctctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt
gtgtgtgtagcggggcggccgcttctgaggagaagtgctgccccatggataggattctgttgaacccagctgtgga
agttggaaaacctagtaggcccttgcccccctgaacttcctcaggcctttccttttaagggaccctgtttgacagc
tgtgcactggtgcatagccctagaagtttactcaaagatgatcccccctgtcctgggtggtgaatctctcctcctc
cctcctgagttgcacaagtcccagagagagaaggtatggagtggcccagttcaaataccttggagctgaggtctac
cccactggggaccaggcccttctcaggcccgtggacttggcctttgtgctagatgaggtcttggtggtagcccgtg
tgttttcccactctgtgagtccctggtcgtggcaggtggctgaggccgtaggctgcgggagtagagctggctctgc
cggctgggcaccagggttgggtgggaaggagcccagtctgtaggctgcaagctgtgggtgggtagcctcagtggag
ccattgtagggagtggcctaggcttgatcctgccctgggcttgcctgccctgccctcaggcttctcttctctggga
agaggtgttgtggactccaggatccctgagactaggcaccagaaacaaagccatgaagactcccggcgt(SEQ ID 
NO:5)

[0077] 上述基因序列中大写部分代表h‑CTSD*编码序列；大写斜体部分代表HA序列；小写下划线部分代表左侧同源臂，小写无下划线部分代表右侧同源臂。

[0078] 3、Cas9 mRNA制备

[0079] 将线性化及纯化DNA并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA：纯化sgRNA至合适转基因注射的纯度。

[0080] 4、显微注射受精卵

[0081] 使用显微注射仪器将上述sgRNA、Cas9mRNA及打靶载体按一定浓度比例混匀后，注射入体外受精小鼠受精卵的胞浆部分，构建形成特定的小鼠胚胎细胞(受精卵)。体外培养
1‑2小时后将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管，胚胎移植的小鼠出生即为F0代小鼠。

[0082] 5、小鼠基因型鉴定

[0083] (1)提取上述步骤所得子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定；

[0084] (2)将目标基因发生敲入的小鼠分别与野生型小鼠杂交。

[0085] 6、基因型鉴定

[0086] (1)基因组DNA提取：

[0087] A、消化：小鼠出生约一周内，剪取0.5cm小鼠脚趾，放入1.5ml EP管中，稍离心后加入500ul裂解液(配方：100mM Tris pH8.0，5mM EDTA pH8.0，0.5％SDS，NaCl 1.17g/
100ml)、0.5ul蛋白酶K(浓度：20mg/ml，溶解在pH7.4，20mM Tris和1mM CaCl2中，50％甘油
缓冲液，‑20℃保存)，混匀，55℃水浴消化过夜；

[0088] B、酚氯仿抽提：

[0089] 1)取出EP管，来回颠倒混匀，1,2000rpm离心10min；

[0090] 2)吸上清400ul到新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿，上下颠倒混匀3min，稍静置后1,2000rpm离心5min；

[0091] 3)轻轻吸取上清至一新的1.5ml EP管中(不要吸到下层的苯酚或沉淀物)，向上清中加入等体积氯仿，上下颠倒混匀3min，稍静置后1,2000rpm离心3min；

[0092] 4)吸取上清至另一新的1.5ml EP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀，‑20℃放置约30min；

[0093] 5)4℃离心机，1,2000rpm离心10min，去上清，将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇；

[0094] 6)待DNA干燥后，加入30ul无菌ddH2O溶解，测浓度，‑20℃保存。

[0095] 对照组无设计sgRNA步骤，直接敲入目的基因，其余步骤均同实验组。

[0096] (2)PCR鉴定

[0097] 针对插入位点上下游区域分别设计正反向PCR引物。

[0098] 1)引物信息见表1

[0099] 表1

[0100]

[0101] 2)PCR反应体系见表2。

[0102] 表2

[0103]

[0104] 注：如果序列复杂，可换其他的酶进行PCR，加入5％DMSO、GC enhancer等(TM值标注DMSO的，建议客户在PCR体系中加入DMSO，该TM值为含DMSO值)

[0105] (3)测序分析

[0106] A、PCR产物直接测序(50ul体系)；

[0107] B、或PCR产物割胶回收、连PMD18T载体，DH5α转化后涂板直接送平板测序(PCR建议使用Taq酶)；

[0108] C、测序结果比对，分析是否成功KI。

[0109] 三、结果

[0110] 基因敲入的关键在于靶点选择，作用于正确靶点可通过同源重组插入目的序列。通过分析小鼠ctsd基因结构，在ctsd基因转录本第一个外显子ATG处设计sgRNA，挑选出敲
入效率最高的sgRNA1‑2。

[0111] 3.1 Founder信息

[0112] 3.1.1 F0代信息

[0113] 2019.8.12生，2019.8.24剪1‑34#

[0114] 3.1.2凝胶电泳如图3和图4：

[0115] 4#、23#、25#和31#为阳性小鼠，PCR为单条小带，正向引物测序即可。WT与H2O分别为野生型和空白对照。

[0116] 3.1.3测序结果分析(正向引物测序)

[0117] 将PCR产物进行测序，测序结果与打靶载体序列比对，用于确认h‑CTSD*序列特异插入到鼠源Ctsd基因ATG处。序列比对结果如下：

[0118] 4#、23#、25#、31#：KI

[0119] 3.2、h‑CTSD*‑KI小鼠(8周)眼底照见图5，可见h‑CTSD*基因敲入组表现出明显的视网膜色素变性症状。

[0120] 大多数遗传修饰小鼠的构建都是为了研究基因表达缺失、增加或靶基因序列变化对机体功能等的影响；也可通过设计基因修饰小鼠来标记特定细胞群(报告基因染色)，监
测生物过程(报告基因株)。CRISPR/Cas9是最近发展起来的新一代基因编辑技术。本发明构
建h‑CTSD*基因敲入小鼠模型时，考虑了多方面因素，最后选择了更为简便、高效的CRISPR/
Cas9技术。CRISPR/Cas9技术打靶效率高、设计便捷，步骤简单，对生物学领域的技术发展起
到了深远的影响。

[0121] 本发明采用CRISPR/Cas9基因敲入技术，首次建立了h‑CTSD*基因敲入的小鼠动物模型。选取了最优sgRNA1‑2，本发明设计的sgRNA1‑2及方法具有敲入效率高的特点。

[0122] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存
在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0123] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。