一种选育优质肉羊的分子生物学方法转让专利
申请号 : CN202010907186.4
文献号 : CN111979338B
文献日 : 2021-07-20
发明人 : 刘学峰 , 李旭业 , 海龙 , 李信涛 , 王洪宝 , 张立春 , 姜明生 , 吴宪 , 王嘉厚 , 郭立宏 , 郝彩虹 , 吕雄杰 , 孙继权 , 杜军 , 穆文利 , 王锋 , 尤海洋 , 李莉 , 郭文凯 , 杨淑萍 , 刘丽秋 , 刘秀玲 , 王佳 , 王宇 , 董扬 , 张超
申请人 : 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院
摘要 :
本发明属于分子生物学和分子育种领域。具体地，本发明提供了杜泊羊PDK4基因上与肉质性状相关的SNP分子标记，所述分子标记的检测方法以及该方法在提高羊肉肉质以及优质肉羊品种培育中的应用。所述分子标记为PDK4基因外显子4第95位的多态性位点，记作G95T。经统计分析可知，分子标记G95T与肉质性状显著相关，特别是肌内脂肪含量、肌纤维直径和失水率。因此，在培育肉羊的过程中可以通过该SNP分子标记辅助选择肉质鲜嫩、多汁的GT型或TT型个体，从而加速优质肉羊育种进程。
权利要求 :
1.一种杜泊羊品种改良的方法，其特征在于，包括检测SNP分子标记并选择基因型为TT或GT的个体作为种羊进行繁殖的步骤，所述分子标记为SEQ ID NO:1的第95位核苷酸的SNP位点，该位点的核苷酸为G或T。
2.根据权利要求1所述的杜泊羊品种改良的方法，所述检测SNP分子标记包括利用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对扩增目的片段的步骤。
3.根据权利要求1所述的杜泊羊品种改良的方法，其中改良的性状为肌内脂肪含量和/或肌纤维直径和/或失水率。
说明书 :
一种选育优质肉羊的分子生物学方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学和分子育种领域。具体地，本发明提供了杜泊羊PDK4基因与肉质相关的SNP分子标记，所述分子标记的检测方法以及该方法在提高羊肉肉质水平及
其在优质肉羊品种培育中的应用。
其在优质肉羊品种培育中的应用。
背景技术
[0002] 肉质相关性状在肉羊育种中具有重要的经济价值。肉的质量受基因、饲喂、养殖条件等内外因素影响。产肉性能主要包括屠宰率、酮体重、脂肪含量等指标，肉的品质又包括
pH24、熟肉率、失水率、剪切力、肉色、嫩度、肌纤维直径等指标。这些指标能够直接反应肉的
质量。DNA分子标记技术的迅猛发展，为人们在分子水平上研究肉质相关性状的遗传机理奠
定了基础。分子标记辅助选择被认为是最具应用前景的育种改良方法。由于分子标记辅助
选择不易受环境因素的影响，且没有性别、年龄的限制，可早期进行选择，因而能够缩短世
代间隔，提高选择强度，进而提高选择效率和准确性。
pH24、熟肉率、失水率、剪切力、肉色、嫩度、肌纤维直径等指标。这些指标能够直接反应肉的
质量。DNA分子标记技术的迅猛发展，为人们在分子水平上研究肉质相关性状的遗传机理奠
定了基础。分子标记辅助选择被认为是最具应用前景的育种改良方法。由于分子标记辅助
选择不易受环境因素的影响，且没有性别、年龄的限制，可早期进行选择，因而能够缩短世
代间隔，提高选择强度，进而提高选择效率和准确性。
[0003] 丙酮酸脱氢酶激酶4（Pyruvate Dehydrogenase Kinase，PDK4）是PDK/BCKDK蛋白激酶家族的成员，具有编码组氨酸激酶结构域的线粒体蛋白，与动物骨骼肌的生长发育密
切相关。其在糖代谢和脂肪酸代谢中也起重要作用，其通过抑制丙酮酸脱氢酶复合体的一
个亚基的磷酸化促进葡萄糖代谢过程的调节。在小鼠中发现，当采取饥饿处理后，鼠骨骼肌
中PDK4基因mRNA的表达水平显著提高。而对牛骨骼肌的相关研究发现，西澳大利亚牛骨骼
肌中的PDK4表达水平高于威尔士牛，并且前者肌内脂肪含量显著高于后者，可见，PDK4表达
量越高，肌内脂肪含量越高。因而，以上现有技术表明PDK4基因与骨骼肌的生长发育和脂肪
代谢相关，因而是研究羊肉质相关分子标记的潜在候选基因。
切相关。其在糖代谢和脂肪酸代谢中也起重要作用，其通过抑制丙酮酸脱氢酶复合体的一
个亚基的磷酸化促进葡萄糖代谢过程的调节。在小鼠中发现，当采取饥饿处理后，鼠骨骼肌
中PDK4基因mRNA的表达水平显著提高。而对牛骨骼肌的相关研究发现，西澳大利亚牛骨骼
肌中的PDK4表达水平高于威尔士牛，并且前者肌内脂肪含量显著高于后者，可见，PDK4表达
量越高，肌内脂肪含量越高。因而，以上现有技术表明PDK4基因与骨骼肌的生长发育和脂肪
代谢相关，因而是研究羊肉质相关分子标记的潜在候选基因。
[0004] 杜泊羊原产于南非，是由有角陶赛特羊和波斯黑头羊杂交培育而成，是世界著名的肉用羊品种。杜泊羊以产肥羔肉特别见长，胴体肉质细嫩、多汁、色鲜、瘦肉率高，被国际
誉为“钻石级肉”。杜泊羊能良好地适应广泛的气候条件和放牧条件，在我国各地畜牧养殖
场已经广泛引进。目前，尚未有研究报道PDK4基因上存在与杜泊羊肉质相关的分子标记。
誉为“钻石级肉”。杜泊羊能良好地适应广泛的气候条件和放牧条件，在我国各地畜牧养殖
场已经广泛引进。目前，尚未有研究报道PDK4基因上存在与杜泊羊肉质相关的分子标记。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种羊肉质相关分子标记及其在品种培育中的应用。具体地，本发明提供了杜泊羊PDK4基因与肉质相关的SNP分子标记，所述分子标记的检测方法以
及该方法在提高羊肉肉质水平以及优质肉羊品种培育中的应用。
及该方法在提高羊肉肉质水平以及优质肉羊品种培育中的应用。
[0006] 一方面，本发明提供了与羊肉质性状相关的分子标记，其对应于PDK4基因的SNP位点；进一步地，所述SNP位点具体为PDK4基因外显子4第95位的多态性位点。进一步地，所述
分子标记的SNP位点如SEQ ID NO:1所示，其中第95位核苷酸为G或T，记作G95T；
分子标记的SNP位点如SEQ ID NO:1所示，其中第95位核苷酸为G或T，记作G95T；
[0007] 进一步地，所述羊的种类为杜泊羊；
[0008] 进一步地，所述PDK4基因为GenBank登录号NC_040255.1所示；
[0009] 另一方面，本发明提供了用于检测羊肉质性状分子标记G95T的引物，其含有如下所述的核苷酸序列：
[0010] 上游引物F：5’‑CATCAAAGTTCGAAACAGACACCA‑3’（SEQ ID NO：2）；
[0011] 下游引物R：5’‑GCACAGCTTATATTCTCCAGCCA‑3’（SEQ ID NO：3）
[0012] 另一方面，本发明提供了包含所述羊肉质性状分子标记的试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对；
[0013] 另一方面，本发明提供了上述分子标记、引物以及试剂盒在鉴定和/或培育优质肉羊品种中的应用；进一步地，所述肉羊品种包括但不限于杜泊羊，寒泊羊，夏洛来羊，苏尼特
羊，无角多赛特羊，萨福克羊，小尾寒羊，波尔山羊。优选地，所述肉羊品种为杜泊羊。
羊，无角多赛特羊，萨福克羊，小尾寒羊，波尔山羊。优选地，所述肉羊品种为杜泊羊。
[0014] 另一方面，本发明提供了一种羊肉质相关性状的方法，包括如下步骤：检测绵羊多胎性状分子标记G95T处的单核苷酸种类。进一步地，所述方法还包括利用如SEQ ID NO:2和
SEQ ID NO:3所示的引物对扩增目的片段的步骤；进一步地，所述方法还包括鉴定所述PCR
产物第80位的单核苷酸种类；进一步地，所述鉴定方法为测序或PCR‑RFLP。进一步得，所述
肉质相关性状为肌内脂肪含量、肌纤维直径和/或失水率。
SEQ ID NO:3所示的引物对扩增目的片段的步骤；进一步地，所述方法还包括鉴定所述PCR
产物第80位的单核苷酸种类；进一步地，所述鉴定方法为测序或PCR‑RFLP。进一步得，所述
肉质相关性状为肌内脂肪含量、肌纤维直径和/或失水率。
[0015] 另一方面，本发明提供了一种提供优质肉羊的培养的方法；所述方法包括确定肉羊核心群分子标记G95T处的单核苷酸种类，选择基因型为TT或GT的个体作为种羊进行繁
殖，从而提高羊群后代肉质的鲜嫩程度和多汁性。
殖，从而提高羊群后代肉质的鲜嫩程度和多汁性。
[0016] 本申请的方法和试剂盒可与其他分子生物学品种培育方法或传统品种培育方法联合使用。
[0017] 本申请的方法和试剂盒筛选出的种羊可用于自然交配和人工授精的品种培育方法。
[0018] 本发明的有益效果在于：发现了与杜泊羊肉质性状相关的分子标记G95T，并提供了能够用于检测所述分子标记的引物对或试剂盒以及相应的检测方法，可以快速准确地鉴
定肉羊的基因型，从而建立高效的分子标记辅助选择育种技术，用于肉羊肉质的改良，加快
育种进程，促进养羊业经济效益的提高。
定肉羊的基因型，从而建立高效的分子标记辅助选择育种技术，用于肉羊肉质的改良，加快
育种进程，促进养羊业经济效益的提高。
附图说明
[0019] 图1为限制性内切酶PvuII切割包含分子标记G95T的PCR产物的示意图。
[0020] 图2为PCR‑RFLP法鉴定基因型的部分电泳结果图。
具体实施方式
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步详述，但本发明的实施方式不仅限于实施例。
[0022] 实施例1 杜泊羊PDK4基因多态性位点的发现
[0023] 实验对象选自申请人自有养殖场内的健康10月龄杜泊羊200只，颈静脉抽血2ml，抗凝处理，‑20℃保存待用。
[0024] （1）基因组DNA的提取。基因组DNA使用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取，经1%琼脂糖凝胶电泳检测无拖尾或弥散现象。用紫外分光光度计对DNA进行
检测，A260/280比值在1.8‑2.0范围内，A260/230比值在1.7‑1.9范围内，样品质量合格。稀
释样品至50ng/μl，于‑20℃冻存。
检测，A260/280比值在1.8‑2.0范围内，A260/230比值在1.7‑1.9范围内，样品质量合格。稀
释样品至50ng/μl，于‑20℃冻存。
[0025] （2）PDK4基因的外显子测序。随机选择20个杜泊羊DNA样本构建池DNA用于外显子测序。以NCBI GenBank数据库上绵羊（Ovis aries）PDK4基因的基因组DNA序列（登录号：NC_
040255.1）为模板。PDK4基因位于绵羊第4号染色体上，DNA序列全长13727bp。该基因包含11
个外显子，编码区包含3667bp，编码蛋白质由407个氨基酸组成。根据该基因的外显子序列
共设计12对能够覆盖全部外显子区域的引物用于序列扩增，将PCR扩增产物进行测序。以上
涉及分子生物学实验部分委托北京微阅基因技术有限公司进行。将测序结果与GenBank上
登录号为NC_040255.1的基因组DNA序列进行比对，发现外显子4序列的第95位存在一个单
核苷酸突变位点（G>T），该单核苷酸突变为错义突变，导致PDK4蛋白第142位丙氨酸突变为
丝氨酸（Ala>Ser）。PDK4基因外显子4的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其中下划线处第95位
存在单核苷酸突变（G>T），记作G95T：
040255.1）为模板。PDK4基因位于绵羊第4号染色体上，DNA序列全长13727bp。该基因包含11
个外显子，编码区包含3667bp，编码蛋白质由407个氨基酸组成。根据该基因的外显子序列
共设计12对能够覆盖全部外显子区域的引物用于序列扩增，将PCR扩增产物进行测序。以上
涉及分子生物学实验部分委托北京微阅基因技术有限公司进行。将测序结果与GenBank上
登录号为NC_040255.1的基因组DNA序列进行比对，发现外显子4序列的第95位存在一个单
核苷酸突变位点（G>T），该单核苷酸突变为错义突变，导致PDK4蛋白第142位丙氨酸突变为
丝氨酸（Ala>Ser）。PDK4基因外显子4的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其中下划线处第95位
存在单核苷酸突变（G>T），记作G95T：
[0026] ttttgtagatactctcatcaaagttcgaaacagacaccatgatgtaattcctacaatggcacagggagtcctggaatataaagatgcctgtacagctgacccagtcaccaatcaaaatcttcagtatttcttggatcgatttta
catgaatcgtatttctacccggatgctgatgaaccagcaca（SEQ ID NO：1）
catgaatcgtatttctacccggatgctgatgaaccagcaca（SEQ ID NO：1）
[0027] 实施例2 多态性位点的基因型频率和等位基因频率
[0028] （1）PCR扩增包含突变位点的PDK4外显子4的DNA片段。利用Primer Premier 5.0设计引物扩增包含突变位点的DNA片段并进行限制性内切酶位点分析。上游引物F：5’‑
CATCAAAGTTCGAAACAGACACCA‑3’（SEQ ID NO：2）；下游引物R：5’‑
GCACAGCTTATATTCTCCAGCCA‑3’（SEQ ID NO：3） 。PCR反应体系：10μl体系中含模板1μl，上、
下游引物各0.2μl，5μl Taq DNA聚合酶，剩余为milli‑Q水；PCR反应程序：94℃预变性2min，
35个循环（94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s），72℃后延伸5min，4℃保存待用。该
PCR产物为233bp的DNA片段（SEQ ID NO:4），其中第80位为单核苷酸突变位点（G>T）。经分
析，该突变位点导致原来存在的限制性内切酶PvuII（CAG丨CTG）位点消失，图1为PvuII切割
非突变和突变PCR产物的示意图。
CATCAAAGTTCGAAACAGACACCA‑3’（SEQ ID NO：2）；下游引物R：5’‑
GCACAGCTTATATTCTCCAGCCA‑3’（SEQ ID NO：3） 。PCR反应体系：10μl体系中含模板1μl，上、
下游引物各0.2μl，5μl Taq DNA聚合酶，剩余为milli‑Q水；PCR反应程序：94℃预变性2min，
35个循环（94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s），72℃后延伸5min，4℃保存待用。该
PCR产物为233bp的DNA片段（SEQ ID NO:4），其中第80位为单核苷酸突变位点（G>T）。经分
析，该突变位点导致原来存在的限制性内切酶PvuII（CAG丨CTG）位点消失，图1为PvuII切割
非突变和突变PCR产物的示意图。
[0029] （2）PCR‑RFLP法检测基因型。PCR‑RFLP方法基于PCR技术，PCR特异性扩增包含突变位点的DNA，经特定限制性内切酶酶切后，再利用琼脂糖凝胶电泳分子酶切产物，通过电泳
行为的改变区分变异样本以及鉴定基因型。对PCR产物进行酶切，酶切体系：10μl体系含10
×Buffer 1μl，PvuII酶（10U/μl，宝生物）0.5μl，PCR产物5μl，剩余为milli‑Q水。37℃水浴
30min。使用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物（80/153,80/153/233,233bp）用于基因分型
（GG,GT,TT），图2为部分样本电泳结果。
行为的改变区分变异样本以及鉴定基因型。对PCR产物进行酶切，酶切体系：10μl体系含10
×Buffer 1μl，PvuII酶（10U/μl，宝生物）0.5μl，PCR产物5μl，剩余为milli‑Q水。37℃水浴
30min。使用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物（80/153,80/153/233,233bp）用于基因分型
（GG,GT,TT），图2为部分样本电泳结果。
[0030] （3）基因型分析
[0031] 经统计，200只杜泊羊PDK4外显子4第95位个单核苷酸突变位点（G>T）的基因型频率和等位基因频率见表1：
[0032] 表1：基因型频率和等位基因频率
[0033]
[0034] 利用SPSS进行卡方检验，结果表明该杜泊羊群在两个多态性位点处于Hardy‑Weinberg 平衡状态（P>0.05）。其中，T为优势等位基因。
[0035] 实施例3不同基因型与肉质性状的关联性分析
[0036] （1）肌内脂肪含量测定。肌内脂肪是羊肉肉质的主要指标之一。在正常范围内，肌内脂肪含量与肉质鲜嫩度、口感风味和多汁性呈正相关。肌肉纤维之间沉积一定量的脂肪
时大理石纹增加，肉质鲜嫩程度和多汁性得以改善。肌内脂肪含量测定使用索氏抽提法，检
测羊背最长肌肉样的肌内脂肪含量：（1）将3‑5g样品在液氮中研至细粉，装入称重过的烘干
滤纸包中（W1），称重含湿样的滤纸包（W2），干燥2h后，称重含干样的滤纸包（W3）；（2）使用索
氏抽提器室温下乙醚抽提6h；（3）乙醚挥发后，将滤纸包干燥2h后称重（W4），计算肌内脂肪
含量。
时大理石纹增加，肉质鲜嫩程度和多汁性得以改善。肌内脂肪含量测定使用索氏抽提法，检
测羊背最长肌肉样的肌内脂肪含量：（1）将3‑5g样品在液氮中研至细粉，装入称重过的烘干
滤纸包中（W1），称重含湿样的滤纸包（W2），干燥2h后，称重含干样的滤纸包（W3）；（2）使用索
氏抽提器室温下乙醚抽提6h；（3）乙醚挥发后，将滤纸包干燥2h后称重（W4），计算肌内脂肪
含量。
[0037] 肌内脂肪含量=（W3‑W4）/（W2‑W1）×100%
[0038] （2）肌纤维直径测定。肌肉的组织是影响肌肉品质的结构基础，是评价肌肉品质的另一重要指标，实践中可根据肌纤维直径、单根肌纤维横截面积或肌纤维密度来判断肌肉
品质的好坏。肌束内纤维数量是判断肉质鲜嫩程度的重要因素，肌纤维越细，其肉质就越细
嫩。石蜡固定小块组织，用切片机切片，随后进行HE染色。染色后的相片在15×40倍并带有
目镜微尺的显微镜下观察并在明亮不同的视野下拍照15张。用Image‑Pro Express软件测
量肌纤维直径，每个相片随机选择50根肌纤维，测量取其平均值。
品质的好坏。肌束内纤维数量是判断肉质鲜嫩程度的重要因素，肌纤维越细，其肉质就越细
嫩。石蜡固定小块组织，用切片机切片，随后进行HE染色。染色后的相片在15×40倍并带有
目镜微尺的显微镜下观察并在明亮不同的视野下拍照15张。用Image‑Pro Express软件测
量肌纤维直径，每个相片随机选择50根肌纤维，测量取其平均值。
[0039] （3）熟肉率测定。熟肉率是将肉煮熟后质量损失比重，这一部分损失大部分为脂肪3
和蛋白质。取干净肉样2cm称重（W1），120℃蒸煮15分钟后再次称重（W2），计算熟肉率。
和蛋白质。取干净肉样2cm称重（W1），120℃蒸煮15分钟后再次称重（W2），计算熟肉率。
[0040] 熟肉率=W2/W1×100%
[0041] （4）失水率测定。系水力指屠宰后骨骼肌保持水分的能力，这一指标影响烹制后肉3
的多汁性和口感。失水率与系水力呈反相关。取干净肉样2cm称重（W1），随后将其置于滤纸
和纱布做成的包裹内，用压力仪对其施加35kg的压力，5分钟后再次称重（W2），计算失水率。
的多汁性和口感。失水率与系水力呈反相关。取干净肉样2cm称重（W1），随后将其置于滤纸
和纱布做成的包裹内，用压力仪对其施加35kg的压力，5分钟后再次称重（W2），计算失水率。
[0042] 失水率=（W1‑W2）/W1×100%
[0043] （5）数据分析。采用SPSS 22.0软件处理各项指标检测结果，利用单因素方差分析，用LSD法进行平均值的多重比较，结果以平均值±标准差表示。表2显示了PDK4外显子4上分
子标记G95T的基因型与各肉质性状之间的关系。
子标记G95T的基因型与各肉质性状之间的关系。
[0044] 表2. 基因型与肉质性状的关联性
[0045]
[0046] 注：不同字母表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）
[0047] 由上表可以看出，TT型杜泊羊肌内脂肪较GG型和GT型分别增加1.04%(P＜0.05)和0.31%（P<0.05），GT型较GG型增加0.73%（P＜0.05），可见等位基因T具有明显的加性效应，使
得肌内脂肪含量增加。TT型失水率较GG型和GT型分别减少9.20%（P＜0.05）和3.75%（P＜
0.05），GT型较GG型减少5.35%，可见等位基因T具有明显的加性效应，使得失水率减少，即系
4 2
水力增加。在肌纤维直径方面，TT型较GG型和GT型分别减少0.45×10μm（P＜0.05）和0.35
4 2
×10μm（P＜0.05），GT型和GG型之间差异并不显著，可见纯合等位基因T对肌纤维直径具有
显著的加性效应。在熟肉率方面，三种基因型并无显著差异。综上所述，PDK4外显子4上分子
标记G95T与肉质相关性状显著相关，具体相关指标为肌内脂肪含量、肌纤维直径和失水率。
等位基因T使得肌内脂肪含量增加，肌纤维直径减少，失水率降低，从而使得肉质更鲜嫩多
汁。由此可见，该SNP位点具有作为优质肉羊品种培育分子标记的潜力。
得肌内脂肪含量增加。TT型失水率较GG型和GT型分别减少9.20%（P＜0.05）和3.75%（P＜
0.05），GT型较GG型减少5.35%，可见等位基因T具有明显的加性效应，使得失水率减少，即系
4 2
水力增加。在肌纤维直径方面，TT型较GG型和GT型分别减少0.45×10μm（P＜0.05）和0.35
4 2
×10μm（P＜0.05），GT型和GG型之间差异并不显著，可见纯合等位基因T对肌纤维直径具有
显著的加性效应。在熟肉率方面，三种基因型并无显著差异。综上所述，PDK4外显子4上分子
标记G95T与肉质相关性状显著相关，具体相关指标为肌内脂肪含量、肌纤维直径和失水率。
等位基因T使得肌内脂肪含量增加，肌纤维直径减少，失水率降低，从而使得肉质更鲜嫩多
汁。由此可见，该SNP位点具有作为优质肉羊品种培育分子标记的潜力。
[0048] 实施例4 PDK4基因SNP分子标记在培育优质肉羊中的应用
[0049] PDK4基因外显子4上的SNP分子标记G95T与肉质性状显著相关。因此，在繁殖培育杜泊羊的过程中可以通过该SNP分子标记辅助选择肉质鲜嫩、多汁的GT型或TT型个体，从而
加速优质肉羊育种进程。杜泊羊是世界范围内的优质肉羊品种，因而在杜泊羊中发现的与
肉质相关的分子标记还能够应用于其他肉羊品种的培育，所述肉羊品种包括但不限于杜泊
羊，寒泊羊，夏洛来羊，苏尼特羊，无角多赛特羊，萨福克羊，小尾寒羊，波尔山羊。
加速优质肉羊育种进程。杜泊羊是世界范围内的优质肉羊品种，因而在杜泊羊中发现的与
肉质相关的分子标记还能够应用于其他肉羊品种的培育，所述肉羊品种包括但不限于杜泊
羊，寒泊羊，夏洛来羊，苏尼特羊，无角多赛特羊，萨福克羊，小尾寒羊，波尔山羊。
[0050] 以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合、修饰，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。