一种测序文库的构建方法

摘要

一种用于第二代高通量测序文库构建的方法和试剂盒，可提高核酸模板的利用效率，简化测序文库的构建流程，使得测序结果更加准确和覆盖度更加均一。

权利要求

1.一种对脱氧多核苷酸单链底物进行建库的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将所述脱氧多核苷酸单链底物与如下物质混合以形成第一混合物：a) 选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸；b) 末端脱氧核苷酸转移酶和DNA连接酶；c) 控尾组分，其中该控尾组分是由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区序列，以及与X区序列互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子；其中多核苷酸同聚物中的单核苷酸与a)中的脱氧核苷酸为互补脱氧核苷酸关系，即：a）中的脱氧核苷酸为dATP时，b）中的多核苷酸同聚物为dTTP同聚物；a）中的脱氧核苷酸为dTTP时，b）中的多核苷酸同聚物为dATP同聚物；a）中的脱氧核苷酸为dCTP时，b）中的多核苷酸同聚物为dGTP同聚物；a）中的脱氧核苷酸为dGTP时，b）中的多核苷酸同聚物为dCTP同聚物；其中，所述多核苷酸同聚物与所述X区相连形成单链，所述多核苷酸同聚物位于所述单链的3’端；所述X区序列包括用于核酸片段扩增或测序的引发序列，与所述连接子多核苷酸的5’端完全互补；

(2)孵育所述的第一混合物，脱氧多核苷酸单链底物的3’端与溶液中的脱氧核苷酸发生加尾反应，添加了多核苷酸同聚尾的底物3’端与控尾组分的连接子连接，得到加尾后的底物；

(3)在步骤(2)的反应体系中，添加DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸和线性扩增引物，以形成第二混合物；其中步骤(3)的线性扩增引物与控尾组分的连接子多核苷酸的3’端互补；

(4)孵育所述第二混合物，以步骤(2)得到的加尾后的底物为模板进行第一次线性延伸反应，合成底物的互补链，再解链，线性扩增引物与底物互补后，再次进行后续的线性延伸反应，其中线性延伸反应的次数不低于3次；

(5)使步骤(4)的产物解链；

(6)在步骤(5)的溶液中添加5’测序接头和DNA连接酶形成第三混合物；其中，所述5’测序接头含有双链部分及3’突出的随机单链多核苷酸；其中，所述的双链部分包括用于核酸片段扩增或测序所需的引发序列；

(7)孵育所述的第三混合物，5’测序接头与底物互补链3’端结合，制备得到DNA文库。

2.如权利要求1所述的方法，其中a)中的脱氧核苷酸是dATP。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的控尾组分包含5至13个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的控尾组分包含7至10个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(2)在温度20℃‑50℃下进行。

6.如权利要求5所述的方法，其中步骤(2)在温度25℃‑45℃下进行。

7.如权利要求5所述的方法，其中步骤(2)在温度25℃‑37℃下进行。

8.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，所用的引物是控尾分子。

9.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，所用的引物是步骤(3)中添加的线性扩增引物。

10.权利要求9所述的方法，其中在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，控尾组分中与底物互补的序列被降解或被步骤(3)中添加的线性扩增引物所竞争。

11.如权利要求1所述的方法，其中步骤(4)的线性延伸反应的次数不低于4次。

12.如权利要求11所述的方法，其中步骤(4)的线性延伸反应的次数为4‑50次。

13.如权利要求11所述的方法，其中步骤(4)的线性延伸反应的次数为4‑20次。

14.如权利要求11所述的方法，其中步骤(4)的线性延伸反应的次数为4‑12次。

15.权利要求1所述的方法，其中5’测序接头的一条链的3’末端悬了2‑30个随机碱基的单链多核苷酸。

16.权利要求15所述的方法，其中5’测序接头的一条链的3’末端悬了2‑17个随机碱基的单链多核苷酸。

17.权利要求15所述的方法，其中5’测序接头的一条链的3’末端悬了4‑15个随机碱基的单链多核苷酸。

18.权利要求15所述的方法，其中5’测序接头的一条链的3’末端悬了7‑10个随机碱基的单链多核苷酸。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于控尾组分的多核苷酸同聚物和连接子包含3’封闭基团。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于5’测序接头包含3’封闭基团。

21.如权利要求19所述的方法，封闭基团选自以下组分的一种或几种：核糖核苷酸、碳三间臂、磷酸、双脱氧核苷酸、氨基基团和倒置脱氧胸腺嘧啶核苷。

22.如权利要求1所述的方法，控尾组分中的连接子多核苷酸包含5’端磷酸和3’端封闭基团。

23.如权利要求1所述的方法，5’测序接头中与含有随机碱基链的互补链上包含5’端磷酸。

24.如权利要求1所述的方法，其中，脱氧多核苷酸底物是去磷酸化的多核苷酸序列。

25.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(4)之后，从所述的第二混合物中分离双链及单链脱氧多核苷酸，解链后得到单链脱氧多核苷酸用于后续步骤。

26.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(7)之后，对制备得到的DNA进行PCR扩增。

27.如权利要求26所述的方法，其中在步骤(7)之后，对制备得到的DNA进行纯化，纯化后再进行PCR扩增。

28.一种用于权利要求1所述的方法的试剂盒，其包含：

组分一：包含选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸、末端脱氧核苷酸转移酶、DNA连接酶和控尾组分，其中所述的控尾组分由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子；其中多核苷酸同聚物中的单核苷酸与a)中的脱氧核苷酸为互补脱氧核苷酸关系，即：a）中的脱氧核苷酸为dATP时，b）中的多核苷酸同聚物为dTTP同聚物；a）中的脱氧核苷酸为dTTP时，b）中的多核苷酸同聚物为dATP同聚物；a）中的脱氧核苷酸为dCTP时，b）中的多核苷酸同聚物为dGTP同聚物；a）中的脱氧核苷酸为dGTP时，b）中的多核苷酸同聚物为dCTP同聚物；其中，所述多核苷酸同聚物与所述X区相连形成单链，所述多核苷酸同聚物位于所述单链的3’端；所述X区序列包括用于核酸片段扩增或测序的引发序列，与所述连接子多核苷酸的5’端完全互补；

组分二：包含DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸，和线性扩增引物；

所述线性扩增引物与所述控尾组分的连接子多核苷酸的3’端互补；

组分三：包含5’测序接头和DNA连接酶；其中，所述5’测序接头含有双链部分及3’突出的随机单链多核苷酸；其中，所述的双链部分包括用于核酸片段扩增或测序所需的引发序列。

29.权利要求28所述的试剂盒，其中组分一中选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸是dATP。

30.权利要求28所述的试剂盒，其中所述控尾组分包含5至13个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。

31.权利要求28所述的试剂盒，其中所述控尾组分包含7至10个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。

32.权利要求28所述的试剂盒，其中所述控尾组分包含7至9个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。

33.权利要求28所述的试剂盒，其中所述的线性扩增引物与控尾组分的连接子多核苷酸的3’端互补。

34.权利要求28所述的试剂盒，其中所述的5’测序接头的一条链的3’末端悬了2‑30随机碱基的单链多核苷酸。

35.权利要求34所述的试剂盒，其中所述的5’测序接头的一条链的3’末端悬了2‑17个随机碱基的单链多核苷酸。

36.权利要求34所述的试剂盒，其中所述的5’测序接头的一条链的3’末端悬了4‑15个随机碱基的单链多核苷酸。

37.权利要求34所述的试剂盒，其中所述的5’测序接头的一条链的3’末端悬了7‑10个随机碱基的单链多核苷酸。

38.权利要求28‑37中任一项所述的试剂盒在对脱氧多核苷酸单链底物进行建库中的应用。

说明书

一种测序文库的构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及用于第二代高通量测序文库构建的方法和试剂盒，更具体地，本发明涉及3’末端悬随机碱基的测序接头用于高通量测序文库构建的方法和试剂盒。

背景技术

[0002] 相对于第一代测序技术，第二代测序技术测序速度更快，通量更高，符合目前科技发展对测序的需求。目前，第二代测序技术的平台主要包括Illumina公司的Hiseq、Miseq、Nextseq、Novaseq以及Life Technologies公司的SOLID system、PGM、Proton等。第二代测序技术的技术思路是边合成边测序，即根据新合成的不同碱基带来的信号变化确定 DNA序列，比如，Illumina测序平台是检测光信号，Life测序平台是检测酸碱变化引起的电流变化。第二代测序技术是迄今为止发展最为成熟、使用最为广泛的DNA高通量测序手段，在基因组大规模测序和基因诊断治疗中功不可没，其在临床方面的应用也将越来越广泛。

[0003] 循环DNA又称为游离DNA，是血液中在细胞外存在的DNA。游离DNA的主要来源是凋亡细胞或骨髓细胞，这些细胞释放的DNA再经体内核酸酶切割后，产生了长度约为 166bp的小片段DNA(Y.M.Dennis Lo et al.ScienceTranslationalMedicine.2010.10：61ra91)。游离DNA在体内处于一个动态平衡状态，所以，游离DNA可以作为健康评估的一个重要参数。肿瘤发生、器官移植等变化都会导致外周血游离DNA的性质发生改变，这些性质包括游离DNA的长度、碱基信息、表观修饰等；所以，游离DNA可以作为疾病的早期诊断、监测和预后评估的一种无创检测的重要标志物。

[0004] 目前，以游离DNA作为分子标记开展的无创产前诊断临床应用已经获得了全方面认可，多个国家已经全面推进该技术应用。除了碱基信息，游离DNA的长度信息也是一种非常重要的分子标记。有研究发现，不同组织或不同状态细胞的核小体、转录因子或 DNA结合蛋白会与DNA的不同区域结合，最终导致游离DNA长度和测序覆盖度发生变化，根据这些差异可以追溯这些游离DNA的来源，这将给癌症早诊、器官移植、监控等领域带来新的曙光(Matthew W.Snyder et al.Cell 2016.1：57‑68)。另一个方面，利用高通量测序方法对肿瘤甲基化的研究发现，利用甲基化测序分析肿瘤与正常组织的DNA甲基化差异信号后，可以通过此差异实现癌症的早期诊断，再结合不同组织特异的甲基化信号，还可以对肿瘤的具体位置进行定位，这对于癌症早筛后诊治具有重大意义(Kun Sun et al.2015.5：5503‑12；ShichengGuo et al.2017.3：635‑642)。

[0005] 利用第二代高通量测序技术对游离DNA进行甲基化测序前，需要先构建甲基化测序文库。目前，第二代高通量甲基化测序文库的传统构建流程(参见图4)是先进行预文库构建，包括末端补平，5’末端磷酸化，3’末端悬A和接头连接步骤；在预文库构建完成后，再进行亚硫酸氢盐处理，亚硫酸氢盐处理会导致大量DNA损伤，最终可以进行测序的模板占原始模板的比例不到10％(Masahiko Shiraishi et al.2004.10：409‑415)。甲基化测序文库的构建流程需要，1)每一步都需要纯化，操作繁琐；2)补平步骤会人为引入核苷酸，改变真实的甲基化状态；3)大量DNA模板在亚硫酸氢盐处理时被破坏，并在PCR 扩增后丢失。

[0006] 目前，Swift甲基化测序文库构建方法较传统方法能更高效的建库(CN104395480，参见图5)，构建流程是先进行亚硫酸氢盐处理，再进行文库构建，包括3’末端加尾和接头连接，再进行延伸反应，在得到双链脱氧多核苷酸的基础上，再进行另一端测序接头的连接，因为延伸反应时的DNA模板含有大量的dUTP，加上亚硫酸氢盐处理对DNA模板的损伤，只发生一轮延伸反应，得到完整双链脱氧多核苷酸的效率低，可用于另一端测序接头连接的模板少，最终可以进行测序的模板少。而在基因诊断领域一直需要开发出更优、更高效的建库方法，以提高模板的利用效率。

发明内容

[0007] 鉴于目前基于亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化测序文库构建过程中所遇到的问题，本发明提供了一种对单链脱氧多核苷酸进行接头连接的方法；并进而提供了一种第二代高通量测序文库构建方法。本发明的方法不但适用于正常DNA，还适用于FFPE样本、古 DNA、亚硫酸氢盐处理后的DNA样本等损伤严重的样本。

[0008] 本发明涉及一种对脱氧多核苷酸底物进行建库的方法，所述方法包括如下步骤：

[0009] (1)将所述脱氧多核苷酸单链底物与如下物质混合以形成第一混合物：a)选自 dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸；b)末端脱氧核苷酸转移酶和DNA连接酶；c)控尾组分，其中该控尾组分是由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X 区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子；其中多核苷酸同聚物与a)中的脱氧核苷酸互补；

[0010] (2)孵育所述的第一混合物，脱氧多核苷酸单链底物的3’端与溶液中的脱氧核苷酸发生加尾反应，添加了多核苷酸同聚尾的底物3’端与控尾组分的连接子连接，得到加尾后的底物；

[0011] (3)在步骤(2)的反应体系中，添加DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP 的脱氧核苷酸和线性扩增引物，以形成第二混合物；

[0012] (4)孵育所述第二混合物，以步骤(2)得到的加尾后的底物为模板进行第一次线性延伸反应，合成底物的互补链，再解链，线性扩增引物与底物互补后，再次进行后续的线性延伸反应，其中线性延伸反应的次数不低于3次；

[0013] (5)使步骤(4)的产物解链；

[0014] (6)在步骤(5)的溶液中添加5’测序接头和DNA连接酶形成第三混合物；

[0015] (7)孵育所述的第三混合物，5’测序接头与底物互补链结合，制备得到DNA文库。

[0016] 在一个具体的实施方式，在步骤(4)的第一次线性延伸反应中，所用的引物是控尾分子(也就是控尾区和X区所组成的单链)，后续的延伸反应中，所用的引物为步骤(3)中添加的线性扩增引物。

[0017] 在一个具体的实施方式，在步骤(4)延伸反应开始之前，降解控尾组分中的多核苷酸同聚物和X区片段，以步骤(3)中添加的线性扩增引物针对底物进行线性延伸反应。

[0018] 在一个具体的实施方式，步骤(3)中添加的线性扩增引物对底物进行竞争性结合，从而该添加的线性扩增引物针对底物进行线性延伸反应。

[0019] 本发明进一步涉及一种试剂盒，该试剂盒能对脱氧多核苷酸底物进行建库，其包含：

[0020] 组分一：包含选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸、末端脱氧核苷酸转移酶、DNA连接酶和控尾组分，其中所述的控尾组分由5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物和X区，以及与X区互补的连接子多核苷酸组成的部分双链核苷酸分子，该多核苷酸同聚物与所述的选自dGTP、dCTP、dATP和dGTP中的一种脱氧核苷酸互补；

[0021] 组分二：包含DNA聚合酶、包含dGTP、dCTP、dATP和dTTP的脱氧核苷酸，和线性扩增引物；

[0022] 组分三：包含5’测序接头和DNA连接酶。

[0023] 本发明通过设计线性扩增，可有效提高原始单链多核苷酸底物的互补链的数量。通过设计一条链的3’末端悬若干个随机碱基的5’测序接头，可以非常高效的在多核苷酸底物的互补链的3’末端添加5’测序接头。进一步，将多核苷酸底物变性为单链，在底物加尾后与连接子连接、之后完成多核苷酸底物的线性扩增得到互补链、互补链3’端连接5’测序接头后，PCR富集，得到可进行下一代测序的文库。

[0024] 此外，由于底物被甲基化，得到了含U碱基的脱氧多核苷酸底物模板，由于U碱基可能导致线性扩增的中止，得到的互补链长短不一，但是本发明通过一条链的3’末端悬若干个随机碱基的5’测序接头与互补链单链多核苷酸的连接，大大提高了互补链的利用率。依据本发明，本建库流程可对低至2ng人类培养细胞来源的基因组DNA构建全基因组甲基化测序文库，并得到高效的测序结果。

附图说明

[0025] 图1：本发明方法DNA文库构建流程图

[0026] 图2：控尾组分的结构

[0027] 图3：悬6N“5’测序接头”的结构

[0028] 图4：传统方法DNA甲基化文库构建流程图

[0029] 图5：Swift方法DNA甲基化文库构建流程图

[0030] 发明详述

[0031] 说明书中的3’、3’端和3’末端的含义相同，5’、5’端和5’末端的含义相同，他们分别指核苷酸序列的3’端或者5’端。

[0032] 多核苷酸底物

[0033] 多核苷酸底物是需要进行加尾反应和文库构建的多核苷酸底物片段。在各种实施方案中，多核苷酸底物为单链或双链的DNA。在另外的实施方案中，多核苷酸底物是经过化学处理的核苷酸序列，包括但不限于是经过亚硫酸氢盐处理的多核苷酸。

[0034] 多核苷酸底物可以是天然来源的或合成的。天然来源是来自原核生物或真核生物，如人、小鼠、病毒、植物或细菌的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸底物还可以是，FFPE 样本、古DNA、亚硫酸氢盐处理后的DNA等损伤严重的样本。多核苷酸底物被加尾，能用于涉及微阵列的测定并且产生用于下一代核酸测序的文库。加尾的多核苷酸底物还可以用于多核苷酸序列的有效克隆。

[0035] 在一些实施方式中，多核苷酸底物是单链的或双链的并且包含3’端游离羟基。在一些方面，多核苷酸底物是双链的并且包含平末端。在其它方面，双链多核苷酸底物包含3’凹陷末端。多核苷酸底物的突出末端或凹陷末端的长度可以变化。在各个方面，多核苷酸底物的突出末端或凹陷末端的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。

[0036] 在一些方面，多核苷酸底物的长度介于约10个与约5000个核苷酸之间，或介于约40个与约2000个核苷酸之间，或介于约50个与约1000个核苷酸之间，或介于约 100个与约
500个核苷酸之间。在另外的方面，多核苷酸底物的长度为至少3个到至多约50、100或1000个核苷酸。

[0037] DNA去磷酸化

[0038] DNA去磷酸化是指DNA 5’端和3’端的第一个氨基酸残基磷酸基团的除去；一般是采用碱性磷酸酶处理DNA来实现5’端和3’端残基的去磷酸化。

[0039] 在一些实施方式中，本发明在对脱氧多核苷酸底物进行加尾之前，对脱氧多核苷酸底物进行去磷酸反应。

[0040] 加尾反应

[0041] 如本文所使用的术语“加尾”可与术语“受控加尾”互换。本发明所述方法的步骤(2) 对脱氧多核苷酸底物进行加尾，所述方法用于以受控方式将所需数量的核苷酸添加至多核苷酸底物3’端。通过举例并且非限制性地，通过添加控尾组分，使多核苷酸底物的尾部控制在一定的长度范围内(见图1)。该控尾组分包含了5至20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物，控尾组分与底物新添加的核苷酸同聚尾序列形成双链结构，因此降低了聚合过程的速率，使多核苷酸底物的尾部控制在一定的长度范围内(见图1)。

[0042] 加尾反应中所添加的核苷酸是选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸，例如可以是dGTP溶液，或dCTP溶液，或dATP溶液，或dGTP溶液。在一个具体实施方案中，采用含聚(dT)的核苷酸同聚序列的控尾组分控制TdT酶(末端脱氧核苷酸转移酶)在多核苷酸底物的3’端添加聚(dA)尾(又称为，核苷酸(dA)同聚尾)。进一步，多核苷酸底物的同聚尾与控尾组分的连接子连接，形成底物的3’端加尾区。

[0043] 在一个具体实施方案中，控尾组分包含了5‑20个、优选5‑13个、进一步优选为7‑ 10个、更优选为7‑9个相同核苷酸的核苷酸同聚物序列。

[0044] 在一个具体实施方案中，多核苷酸底物与控尾组分的摩尔浓度比范围为1∶1‑1∶100，优选1∶5‑1∶50。

[0045] 在一个具体实施方案中，本发明所述方法的步骤(2)的加尾反应的pH范围为约5.0 到约9.0；多核苷酸底物与单核苷酸摩尔浓度比范围为1∶10‑1∶20000，优选1∶100‑1∶2000；孵育的时间在1分钟到120分钟，优选0.5‑60分钟，0.5‑30分钟，1‑20分钟，1‑15分钟或1‑10分钟；孵育的温度为20℃‑50℃，优选25℃‑45℃，更优选25℃‑37℃。

[0046] 控尾组分

[0047] 本发明通过添加控尾组分来控制多核苷酸底物的加尾长度和效率。控尾组分是由控尾区和X区，以及能够与X区互补的连接子序列(见图2)，控尾组分又称为“控尾接头”。控尾区和X区所组成的单链被称为“控尾分子”。

[0048] 本发明的控尾区是一段5‑20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物。多核苷酸同聚物又称“poly区”，是相同的核苷酸连接成的多核苷酸链。本发明的控尾区是dGTP、dCTP、 dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸组成的核苷酸同聚物序列；优选是dTTP组成的聚 (dT)的控尾区。优选地，本发明控尾区的多核苷酸同聚物的长度为5‑20个核苷酸，优选 7‑20、9‑20个核苷酸，进一步优选为5‑10个核苷酸，7‑10个核苷酸，更优选为7‑9个核苷酸。一定长度的dGTP或dCTP多核苷酸同聚物可以有效控制多核苷酸底物加尾在20 个核苷酸左右。

[0049] “X区序列”提供用于核酸片段的扩增或测序的引发序列，还可以包含用于区分不同的底物分子的标记序列，标记序列可以包含4‑16个碱基，并且在一些方面用于下一代测序应用。在本发明的一些实施方式中，X区序列可以是但不限于与Illumina、 Ion Torrent、Roche 454或SOLiD测序平台相容的含下一代测序(NGS)接头序列。X区序列可以是DNA序列、RNA序列或者包含DNA和RNA的杂聚序列。

[0050] 控尾组分中的连接子，只具有与X区序列互补的连接子被称为“短连接子”；除了与X区互补序列外还包括延伸引物结合区的连接子序列，被称为“长连接子”，如表2所不。

[0051] 本发明使用了一种对脱氧多核苷酸底物进行加尾的方法，所述方法用于以受控方式将所需数量的核苷酸添加至多核苷酸底物3’端。通过举例并且非限制性地，通过添加控尾组分，该控尾组分包含了5‑20个核苷酸长度的多核苷酸同聚物，控尾组分与底物新添加的核苷酸同聚尾序列互补形成双链结构，因此降低了聚合过程的速率，使多核苷酸底物的尾部控制在一定的长度范围内(见图1)。

[0052] 在本发明的一些实施方式中，采用含聚(dT)的核苷酸同聚序列的控尾组分控制TdT 酶在多核苷酸底物的3’端添加聚(dA)尾(又称为核苷酸(dA)同聚尾)。进一步，多核苷酸底物的聚(dA)尾与控尾组分的连接子连接，形成底物的3’端加尾区。

[0053] 在本发明的一些实施方式中，控尾组分包含封闭基团。本文所使用的封闭基团是阻止通过酶进行延伸的部分。如果没有封闭基团，酶能够通过添加核苷酸合成多核苷酸。封闭基团包括但不限于：磷酸基团、碳三间臂、双脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基以及反向脱氧胸苷。

[0054] 在本发明的一些实施方式中，控尾组分连接子的5’端有磷酸化修饰，3’端有封闭基团，控尾区的3’有封闭基团。

[0055] 线性扩增反应

[0056] 线性扩增反应也称为“线性延伸反应”或“线性延伸”。

[0057] 本发明在对脱氧多核苷酸底物进行加尾之后，进一步以脱氧多核苷酸底物为模板进行线性扩增反应。本发明提供了一种对脱氧核苷酸底物进行线性扩增的方法，所述方法用于以线性扩增的方式来增加脱氧多核苷酸底物的数量(见图1)。

[0058] 在本发明的一些实施方式中，在加尾反应之后，加入线性扩增引物，以加尾的底物为模板进行延伸反应，延伸反应可以首先是通过控尾分子发生延伸反应。在本发明的一些实施方式中，线性扩增引物通过竞争的方式使控尾分子与底物多核苷酸底物分离，进而以脱氧多核苷酸底物为模板进行线性扩增反应。在一些具体实施方式中，在步骤(4)延伸反应开始之前，降解控尾组分中的多核苷酸同聚物和X区片段，以步骤(3)中添加的线性扩增引物针对底物进行线性延伸反应。

[0059] 在一个具体实施方式中，该方法包括：在加尾反应之后，多核苷酸底物变性呈单链状态，加入与底物3’连接子序列互补的线性扩增引物、DNA聚合酶和脱氧核苷酸，与多核苷酸底物进行反应；在线性扩增引物的3’端发生核苷酸延伸反应，合成底物的互补链，得到双链脱氧多核苷酸，双链脱氧多核苷酸通过变性使底物的互补链与底物分离，底物再次与线性扩增引物、DNA聚合酶和脱氧核苷酸发生延伸反应，发生延伸反应的次数称为线性扩增循环数。在一些方面，所述的DNA聚合酶可以高效扩增含U碱基的脱氧多核苷酸底物模板。

[0060] 在一个具体实施例方案中，线性扩增循环数不低于3次，优选不低于4次，优选为 4‑50次，进一步优选4‑20次，更优选为4‑12次，8‑12次。

[0061] 5’测序接头的连接反应

[0062] 本发明的5’测序接头是具有部分双链结构的脱氧多核苷酸；“部分双链”指的是所述悬随机个数碱基的5’测序接头包含单链部分和双链部分。

[0063] 5’测序接头提供用于核酸片段的扩增或测序的引发序列，并且在一些方面用于下一代测序应用。

[0064] 本发明通过添加悬随机碱基的5’测序接头与线性扩增反应之后得到的底物的互补链发生连接反应，悬随机碱基的5’测序接头的3’末端包含一段随机碱基单链多核苷酸 (见图3)，因此悬随机碱基的5’测序接头是多分子结构的具有部分双链的多核苷酸，悬随机碱基的5’测序接头又称“悬N 5’测序接头”。例如悬6个随机碱基的5’测序接头又称“悬6N 5’测序接头”，N代表一种脱氧核苷酸碱基，也就是6个N中每一个都是随机选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种脱氧核苷酸碱基，“悬6N 5’测序接头”是不同随机碱基连接后的混合分子。

[0065] 本发明的5’测序接头悬随机碱基的个数为0‑50个，优选2‑30个，进一步优选为2‑ 17，4‑15，4‑10，更优选7‑10，7‑9个。

[0066] 在本发明的具体实施方式中，5’测序接头由两条多核苷酸链退火形成，不含随机碱基的多核苷酸链的5’端有磷酸化修饰，3’端有封闭基团，含随机碱基的多核苷酸链的3’端有封闭基团(见图3)。

[0067] 在对单链脱氧多核苷酸进行接头连接的方法中，所述方法用于以悬随机碱基的5’测序接头的随机碱基单链多核苷酸部分与线性扩增反应之后得到的底物的互补链的3’端形成互补，得到除5’测序接头双链部分之外的部分双链结构，在DNA连接酶的作用下，5’测序接头不含随机碱基的多核苷酸链的5’端与多核苷酸底物的互补链的3’端连接 (见图1)；在线性扩增步骤及纯化步骤之后用于与5’测序接头连接的底物互补链增多，连接效率提高。

[0068] 在一个具体实施例方案中，多核苷酸底物与5’测序接头的摩尔浓度比范围为1∶100‑ 1∶4000，优选1∶500‑1∶1000。

[0069] 连接酶

[0070] 可用于本发明方法的连接酶可以是DNA连接酶和RNA连接酶，包括但不限于T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、T7 DNA连接酶以及T4 RNA连接酶。

[0071] 本发明的连接酶使控尾组分中的连接子与底物加尾的多核苷酸连接。在另一些实施方式中，本发明的连接酶使5’测序接头与合成的底物的互补链单链脱氧多核苷酸连接。

[0072] 分离步骤

[0073] 在一些实施方案中，对本发明步骤(7)之后的多核苷酸产物进行纯化。多核苷酸产物的纯化通过本领域技术人员已知和理解的任何方法来进行。在本发明多核苷酸底物的纯化可以通过加入表面是羧基修饰的磁珠来进行。在其它的具体实施方式中，通过柱纯化和沉淀来进行多核苷酸底物的纯化。

具体实施方式

[0074] 实施例中所用的序列参见如下表1‑表5

[0075] 表1.用于实施例的DNA多核苷酸

[0076]

[0077]

[0078] Phos：磷酸；*：硫代位点；C3 Spacer：碳3间臂；5mC：5‑甲基‑胞嘧啶脱氧核苷酸；

[0079] N：dA、dT、dC或dG核苷酸

[0080] 表2.用于甲基化测序文库构建的悬聚(dT)控尾组分

[0081]

[0082] Phos：磷酸；C3 Spacer：碳3间臂；*：硫代位点

[0083] 表3.用于实施例1的悬不同数量N的5’测序接头

[0084]

[0085] Phos：磷酸；C3 Spacer：碳3间臂；*：硫代位点；N：dA、dT、dC或dG的核苷酸[0086] 表4.用于甲基化测序文库构建的带分子标签的悬聚(dT)控尾组分

[0087]

[0088] Phos：磷酸；C3 Spacer：碳3间臂；*：硫代位点；N：dA、dT、dC或dG的核苷酸[0089] 表5.用于甲基化测序文库构建的“传统甲基化测序接头”

[0090]

[0091] Phos：磷酸；5mC：5‑甲基‑胞嘧啶脱氧核苷酸

[0092] 实施例

[0093] 实施例1.悬不同数量随机碱基的5’测序接头对5’测序接头连接的影响[0094] 材料：

[0095] 5 x退火缓冲液(碧云天，目录号D0251)

[0096] 无酶水(索莱宝，目录号R1600‑100)

[0097] λ‑DNA(takara，目录号3019)

[0098] 亚硫酸氢盐处理试剂盒(Zymo Research，目录号D5005)

[0099] FastAP温敏碱性磷酸酶(ThermoFisher，EF0651，1U/μL)

[0100] 10 x CutSmart缓冲液(New England Biolabs，目录号B7204S)

[0101] 10 x绿色缓冲液(Enzymatics，目录号B0120，20mM Tris‑醋酸盐、50mM乙酸钾、10 mM乙酸镁，pH 7.9)

[0102] β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(New England Biolabs，目录号B9007S，50mM)[0103] dATP(Takara，目录号4026，100mM)

[0104] TdT酶(Enzymatics，目录号P7070L，20U/μL)

[0105] 大肠杆菌DNA连接酶(Takara，目录号2161，60U/μL)

[0106] EB缓冲液(Qiagen，目录号19086)

[0107] dNTP(takara，目录号4030，每种2.5mM)

[0108] Phusion U热启动DNA聚合酶(ThermoFisher，目录号F555L，2U/μL)

[0109] 5 x Phusion HF缓冲液(ThermoFisher，目录号F555L)

[0110] Beckman Ampure XP磁珠(Beckman，目录号A63882)

[0111] SB缓冲液：20％PEG8000，2.5M NaCl，10mM Tris‑盐酸，1mM EDTA

[0112] 2 x T4 DNA快速连接反应缓冲液(Enzymatics，目录号B1010)

[0113] T4 DNA快速连接酶(Enzymatics，目录号L6030‑HC‑L，600U/μl)

[0114] 方法：

[0115] (1)接头制备：将多核苷酸对(001/002，007/015，008/015，009/015，010/015，011/015，012/015，013/015，014/015)等摩尔量混合，在1x退火缓冲液中于95℃孵育2分钟，然后缓慢冷却至室温，得到控尾接头(如表2所示)和3’末端悬不同数量随机碱基的5’测序接头(如表3所示)。

[0116] (2)使用亚硫酸氢盐处理试剂盒对40ng λ‑DNA(takara，目录号3019)进行亚硫酸氢盐处理。

[0117] (3)使用聚焦超声仪(Covaris，目录号S220)将步骤(2)的DNA产物片段化至300bp，待用。

[0118] (4)按照表1‑1所示制备DNA去磷酸化反应混合液，在37℃温浴30分钟后，95℃处理 5分钟，之后立即插入冰上并孵育2分钟后待用，使底物保持单链状态。

[0119] 表1‑1

[0120]

[0121] (5)对多核苷酸底物进行加尾：按照表1‑2所示制备加尾和连接反应混合液，将反应混合液在37℃温浴30分钟后，95℃处理5分钟，然后保持在4℃。

[0122] 表1‑2

[0123]

[0124] (6)线性扩增：制备如表1‑3所示的线性扩增的反应混合液，按照表1‑4所示的PCR扩增程序运行4个线性扩增；使用166μl 1∶6稀释的Beckman Ampure XP磁珠(1体积的Beckman Ampure XP磁珠加上5体积的SB缓冲液)和280μl的1.8∶1稀释的SB 缓冲液(1.8体积的SB缓冲液加上1体积的无酶水)纯化回收线性扩增产物，再加入 100μl EB缓冲液洗脱，将100μl洗脱液分成5μl/份于200μl PCR管中，分出18份用于下步反应。

[0125] 表1‑3

[0126]

[0127] 表1‑4

[0128]

[0129] (7)将步骤(6)的18份DNA在95℃反应5分钟，立即置于冰上2分钟待用，使双链解链保持单链待用。

[0130] (8)按照如表1‑5所示制备来自步骤(7)的DNA与悬2N‑9N的“5’测序接头”连接的反应混合液，每种接头两个平行，在25℃温浴15分钟，使用17μl Beckman Ampure XP 磁珠回收连接后的DNA，再加入26μl无酶水洗脱，得到PCR扩增前文库。

[0131] 表1‑5

[0132]

[0133] (9)使用文库定量试剂盒(KAPA Biosystems，目录号KK4824)以及DNA定量标准品和预混合引物试剂盒(KAPA Biosystems，目录号KK4808)，加上qPCR正向引物/qPCR 反向引物(005/004，如表1，使用浓度同预混合引物试剂盒)检测PCR扩增前文库的摩尔浓度，计算时PCR扩增前文库片段大小为320bp。

[0134] 实验结果：如表1‑6所示，使用悬2个N的“5’测序接头”构建的PCR扩增前文库浓度最低，为0.000780nM，“5’测序接头”悬N的数量从2增加到4个，PCR扩增前文库浓度从0.000780nM增加到0.0254nM，呈指数增加；从4到7，PCR扩增前文库浓度增加趋势减弱，使用悬7N“5’测序接头”构建的PCR扩增前文库浓度最高，为0.0653 nM；使用悬7个N、8个N和9个N的“5’测序接头”(见表3)构建的PCR扩增前文库浓度基本一致，分别为0.0653nM、0.0627nM和0.0646nM。

[0135] 结论：悬2‑9个N的“5’测序接头”均能有效与线性扩增后得到的核苷酸底物的互补链发生连接反应，并对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行甲基化文库的构建。

[0136] 表1‑6

[0137]

[0138] 实施例2.不同接头浓度对5’测序接头连接的影响

[0139] 方法：

[0140] (1)接头制备：按照实施例1中接头制备方法制备控尾接头(001/002，如表2所示)以及3’末端悬6个N的“5’测序接头”(011/015，如表3所示)

[0141] (2)使用亚硫酸氢盐处理试剂盒对24ng λ‑DNA进行亚硫酸氢盐处理。

[0142] (3)制备线性扩增产物：按照实施例1中所描述的方法制备线性扩增产物，线性扩增产物纯化回收时加入31.2μl EB缓冲液洗脱，将31.2μl洗脱液分成2.6μl/份于200μl PCR管中，分出10份用于下步反应。

[0143] (4)将步骤(3)的DNA在95℃反应5分钟，立即置于冰上2分钟待用。

[0144] (5)反应：如下表2‑1所示配制进行“5’测序接头”连接反应的混合液，在25℃温浴15 分钟，使用17μl Beckman Ampure XP磁珠回收连接后DNA，再加入26μl无酶水洗脱，得到PCR扩增前文库。

[0145] 表2‑1

[0146]

[0147] (6)按照实施例1所描述的方法检测PCR扩增前文库的摩尔浓度。

[0148] 实验结果：如表2‑2所示，DNA底物与5’测序接头比例为1∶100时构建的PCR扩增前文库浓度最低，为0.0210nM，1∶4000时构建的PCR扩增前文库浓度最高，为0.0836 nM。

[0149] 结论：DNA底物与5’测序接头比例为1∶100到1∶4000均能有效的对亚硫酸氢盐处理后的DNA实施甲基化文库的构建。

[0150] 表2‑2

[0151] DNA底物：5’测序接头比例 1∶100 1∶500 1∶1000 1∶2000 1∶4000 文库浓度(nM) 0.0210 0.0499 0.0641 0.0693 0.0836

[0152] 实施例3.不同线性扩增循环数对甲基化PCR扩增前文库构建的影响

[0153] (1)接头制备：按照实施例1中接头制备方法制备控尾接头(001/002，如表2所示)以及3’末端悬7个N的“5’测序接头”(012/015，如表3所示)。

[0154] (2)使用亚硫酸氢盐处理试剂盒对20ngλ‑DNA进行亚硫酸氢盐处理。

[0155] (3)使用聚焦超声仪(Covaris，目录号S220)将步骤(2)的DNA产物片段化至300bp，待用。

[0156] (4)按照表3‑1所示制备DNA去磷酸化反应混合液，在37℃温浴30分钟后，95℃处理 5分钟，之后立即插入冰上并孵育2分钟后待用。

[0157] 表3‑1

[0158]

[0159] (5)按照表3‑2所示制备加尾和连接反应混合液，将反应混合液在37℃混浴30分钟后，

[0160] 95℃处理5分钟，然后保持在4℃，待反应完成后，将反应混合液平均分成4份，每份10μl，待用。

[0161] 表3‑2

[0162]

[0163]

[0164] (6)制备如表3‑3所示的线性扩增的反应混合液，按照表3‑4所示的PCR扩增程序运行，其中95℃，30秒，60℃，30秒，68℃，1分钟的反应循环数分别使用4、6、8和12；均使用166μl 1∶6稀释的Beckman Ampure XP磁珠(1体积的Beckman Ampure XP 磁珠加上5体积的SB缓冲液)和280μl的1.8∶1稀释的SB缓冲液(1.8体积的SB 缓冲液加上1体积的无酶水)纯化回收线性扩增产物，再加入12.5μl EB缓冲液洗脱，四种线性扩增循环数的12.5μl洗脱液都分成5μl/份于200μl PCR管中，都分出2份用于下步反应。

[0165] 表3‑3

[0166]

[0167] 表3‑4

[0168]

[0169] (7)将步骤(6)制备得到的DNA在95℃反应5分钟，立即置于冰上2分钟待用。

[0170] (8)按照如表3‑5所示制备四种“5’测序接头”连接的反应混合液，分别在25℃温浴15 分钟，分别使用17μl Beckman Ampure XP磁珠回收连接后DNA，再加入26μl无酶水洗脱，得到PCR扩增前文库。

[0171] 表3‑5

[0172]

[0173] (9)按照实施例1所描述的方法检测PCR扩增前文库的摩尔浓度。

[0174] 实验结果：如表3‑6所示，线性扩增循环数为4、6、8和12，PCR扩增前文库的摩尔浓度分别为0.0553nM、0.0947nM、0.131nM和0.199nM，线性扩增循环数为12时构建的文库浓度最高。

[0175] 表3‑6

[0176]线性扩增使用循环数 4个 6个 8个 12个
文库浓度(nM) 0.0553 0.0947 0.131 0.199

[0177] 结论：对加尾的脱氧多核苷酸底物进行线性扩增，线性扩增4‑12个循环，然后连接悬7N“5’测序接头”，均能得到有效的甲基化文库。

[0178] 实施例4.NGS检测不同线性扩增循环数对甲基化测序文库构建的影响

[0179] 材料：

[0180] 2 x高保真热启动PCR混合液(KAPA Biosystems，目录号KK2602)

[0181] 方法：

[0182] (1)接头制备：按照实施例1中所描述的方法制备带随机分子标签的控尾接头(006/029，如表4所示)，以及3’末端悬7个N的“5’测序接头”(012/015，如表3所示)。

[0183] (2)甲基化测序文库制备：按照实施例3中所描述的方法构建甲基化测序文库至“5’测序接头”连接反应后；使用17μl Beckman Ampure XP磁珠回收连接后DNA，再加入 20μl无酶水洗脱；取2μl洗脱液于18μl无酶水中稀释10倍，得到10倍稀释液，再取2μl 10倍稀释液于18μl无酶水中稀释10倍，得到100倍稀释液，依次进行稀释得到10000倍稀释液，取10000倍稀释液5.34μl，待用。

[0184] (3)如表4‑1所示制备PCR扩增反应混合液，按照表4‑2所示的PCR扩增程序运行；使用80μl Beckman Ampure XP磁珠回收PCR产物，再加入50μl无酶水洗脱，再使用 40μl Beckman Ampure XP磁珠回收50μl洗脱产物，最后加入25μl EB缓冲液洗脱，得到最终测序文库。

[0185] 表4‑1

[0186]

[0187] 表4‑2

[0188]

[0189] (4)使用安捷伦2100生物分析仪(Agilent Technologies，目录号G2939BA)和安捷伦高灵敏DNA试剂盒(Agilent Technologies，目录号5067‑4626)检测文库片段分布；使用文库定量试剂盒(KAPA Biosystems，目录号KK4808)以及DNA定量标准品和预混引物试剂盒(KAPA Biosystems，目录号KK4808)检测文库摩尔浓度。

[0190] (5)使用Illumina‑NS500测序仪对步骤(3)得到的文库进行75PE模式测序，利用软件 Cutadapt(v112)去除接头序列；采用软件Bwa‑Meth(v0.2.0)对甲基化测序序列进行基因组比对；利用软件包Sambamba(v0.5.4)标记重复序列；最后，利用软件包bedtods (v2.25.0)对测序深度进行统计。

[0191] 实验结果如下表4‑3所示，线性扩增循环数为4、6、8和12时，构建的甲基化测序文库的浓度分别为32.22nM，54.90nM，134.24nM和139.95nM。高通量测序结果显示的测序数据量为4Mb时，建库效率分别为30.35％，48.36％，70.36％和92.63％，变异系数分别为0.455，0.275，0.999和0.637。

[0192] 其中，从1000个模板λ‑DNA基因组起始建库，通过测序，最终在每个λ‑DNA基因组位点上平均得到100个独一无二的测序片段，即称为建库效率10％。对每个λ‑DNA 基因组位点上得到的独一无二的测序片段数进行统计，计算其平均值及标准差，以标准差除以平均值，得“变异系数”。变异系数代表建库方法的均一性，越低则均一性越好。建库效率指代建库方法的有效性，越高越好。

[0193] 结论：线性扩增循环数为4、6、8和12均能有效的完成线性扩增，并对亚硫酸氢盐处理后的DNA构建甲基化测序文库；线性扩增循环数为12时，建库效率最高，达 92.63％。

[0194] 表4‑3

[0195]

[0196]

[0197] 实施例5

[0198] 比较本发明方法与传统方法以及Swift方法在构建甲基化测序文库上效率的差异[0199] 材料：

[0200] 10 x末端修复缓冲液(New England Biolabs，目录号B6052S，50mM Tris‑盐酸、10mM 氯化镁、10mM二硫苏糖醇、1mM三磷酸腺苷、0.4mM dATP、0.4mM dCTP、0.4mM dGTP、
0.4mM dTTP，pH 7.5)

[0201] T4 DNA聚合酶(Enzymatics，目录号P7080L，3U/μL)

[0202] T4多聚核苷酸激酶(Enzymatics，目录号Y9040L，10U/μL)

[0203] 10 x dA加尾缓冲液(New England Biolabs，目录号B6059S，10mM Tris‑盐酸、10mM氯化镁、50mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.2mM dATP，pH 7.9)

[0204] Klenow大片段(Exo‑)(Enzymatics，目录号P7010‑LC‑L，10U/μL)

[0205] (1)利用本发明方法构建λ‑DNA甲基化测序文库

[0206] (1‑1)接头制备：按照实施例1中接头制备方法制备控尾接头(001/002，如表2所示)以及 3’末端悬7个N的“5’测序接头”(012/015，如表3所示)。

[0207] (1‑2)使用亚硫酸氢盐处理试剂盒对20ngλ‑DNA进行亚硫酸氢盐处理。

[0208] (1‑3)使用聚焦超声仪(Covaris，目录号S220)将步骤(1‑2)DNA产物片段化至300bp，均分成两份(即两个平行)，待用。

[0209] (1‑4)按照表5‑1所示制备DNA去磷酸化反应混合液，在37℃温浴30分钟后，95℃处理5分钟，之后立即插入冰上并孵育2分钟后待用。

[0210] 表5‑1

[0211]

[0212]

[0213] (1‑5)按照表5‑2所示制备加尾和连接反应混合液，将反应混合液在37℃混浴30分钟后，95℃处理5分钟，然后保持在4℃，待用。

[0214] 表5‑2

[0215]

[0216] (1‑6)制备如表5‑3所示的线性扩增的反应混合液，按照表5‑4所示的PCR扩增程序运行，反应完成后使用166μl 1∶6稀释的Beckman Ampure XP磁珠(1体积的Beckman Ampure XP磁珠加上5体积的SB缓冲液)和280μl的1.8∶1稀释的SB缓冲液(1.8体积的SB缓冲液加上1体积的无酶水)纯化回收线性扩增产物，用6.6μl EB缓冲液洗脱。

[0217] 表5‑3

[0218]

[0219]

[0220] 表5‑4

[0221]

[0222] (1‑7)将步骤(1‑6)的DNA洗脱液在95℃反应5分钟，立即置于冰上2分钟待用。

[0223] (1‑8)按照如表5‑5所示制备“5’测序接头”连接的反应混合液，在25℃温浴15分钟，使用17μl Beckman Ampure XP磁珠回收连接后DNA，再加入100μl无酶水洗脱；取2 μl洗脱液于18μl无酶水中稀释10倍，得到10倍稀释液，再取2μl 10倍稀释液于18μl 无酶水中稀释10倍，得到100倍稀释液，依次进行稀释得到10000倍稀释液，取10000 倍稀释液5.34μl，待用。

[0224] 表5‑5

[0225]

[0226] (1‑9)如表5‑6所示制备PCR扩增反应混合液，按照表5‑7所示的PCR扩增程序运行；使用80μl Beckman Ampure XP磁珠回收PCR产物，再加入50μl无酶水洗脱，再使用 40μl Beckman Ampure XP磁珠回收50μl洗脱产物，最后加入25μl EB缓冲液洗脱，得到最终测序文库。

[0227] 表5‑6

[0228]

[0229]

[0230] 表5‑7

[0231]

[0232] (1‑10)文库浓度检测方法同实施例4.

[0233] (1‑11)使用Illumina‑Nova测序仪对步骤(1‑9)得到的文库进行150PE模式测序，分析方法同实施例4中的步骤(5)。

[0234] (2)利用传统方法构建λ‑DNA甲基化测序文库(建库流程示意图如图4)

[0235] (2‑1)接头制备，按照实施例1中接头制备方法制备“传统甲基化测序接头”(016/017，如表5所示)。

[0236] (2‑2)取20ngλ‑DNA，使用聚焦超声仪将DNA片段化至300bp，均分成两份(即两个平行)，待用。

[0237] (2‑3)如表5‑8所示配制末端修复反应混合液，在20℃下反应30分钟，然后加入45μl Beckman Ampure XP磁珠回收修复后DNA，使用26μl无酶水洗脱。

[0238] 表5‑8

[0239]

[0240]

[0241] (2‑4)如表5‑9所示配制dA加尾反应混合液，在37℃下反应30分钟，然后加入45μl Beckman Ampure XP磁珠回收完成dA加尾的DNA，使用12μl无酶水洗脱。

[0242] 表5‑9

[0243]

[0244] (2‑5)如表5‑10所示配制接头连接反应混合液，在25℃下反应15分钟，然后加入21μl Beckman Ampure XP磁珠回收完成接头连接的DNA，使用20μl无酶水洗脱。

[0245] 表5‑10

[0246]

[0247] (2‑6)使用亚硫酸氢盐处理试剂盒对DNA(来自步骤(2‑5))进行亚硫酸氢盐处理，使用100 μl无酶水洗脱；取2μl洗脱液按照步骤(1‑8)所描述的稀释方法进行稀释，得到10000倍稀释液，取10000倍稀释液5.34μl，待用。

[0248] (2‑7)如表5‑11所示制备PCR扩增反应混合液，按照表5‑12所示的PCR扩增程序运行；使用40μl Beckman Ampure XP磁珠回收PCR产物，再加入50μl无酶水洗脱，再使用40μl Beckman Ampure XP磁珠回收50μl洗脱产物，最后加入25μl EB缓冲液洗脱，得到最终测序文库。

[0249] 表5‑11

[0250]

[0251] 表5‑12

[0252]

[0253] (2‑8)文库浓度检测方法同实施例4.

[0254] (2‑9)使用Illumina‑Nova测序仪对步骤(2‑7)得到的文库进行150PE模式测序，分析方法同实施例4中的步骤(5)。

[0255] (3)利用Swift方法构建λ‑DNA甲基化测序文库(建库流程示意图如图5)[0256] (3‑1)使用亚硫酸氢盐处理试剂盒对20ngλ‑DNA进行亚硫酸氢盐处理。

[0257] (3‑2)使用聚焦超声仪将步骤(3‑1)产物片段化至300bp，均分成两份(即两个平行)，待用。

[0258] (3‑3)按照Swift DNA甲基化建库试剂盒(Swift Biosciences，目录号30024)的建库步骤对来自步骤(3‑2)的DNA进行甲基化文库的构建，不同之处在文库构建至5’测序接头连接完纯化后(Index PCR之前)用100μl无酶水洗脱；取2μl洗脱液按照步骤1‑8所描述的稀释方法进行稀释，得到10000倍稀释液，取10000倍稀释液5.34μl，补无酶水14.66 μl至终体积为20μl，待用。

[0259] (3‑4)按照Swift DNA甲基化建库试剂盒(Swift Biosciences，目录号30024)中的Index PCR步骤对来自步骤(3‑3)的DNA进行PCR扩增，使用的Index为Index试剂盒(Swift Biosciences，目录号36024)中的I16或I19，不同之处在PCR扩增循环数为28。

[0260] (3‑5)按照步骤(2‑7)所示的PCR产物纯化方法对来自步骤(3‑4)的PCR产物进行纯化回收，得到最终测序文库。

[0261] (3‑6)按照实施例4所描述的方法检测文库摩尔浓度。

[0262] (3‑7)使用Illumina‑Nova测序仪对步骤(2‑7)得到的文库进行150PE模式测序，分析方法同实施例4中的步骤(5)。

[0263] 实验结果如表5‑13所示，分别用本发明方法，Swift方法和传统建库方法，构建的甲基化测序文库的浓度分别为18.684nM，1.641nM和0.146nM。测序数据量为4Mb 时，建库效率分别为56.1％，22％和3.92％，变异系数分别为0.463，8.49，和3.73。

[0264] 表5‑13

[0265]

[0266] 结论：使用本发明方法能够高效的对少量基因组DNA进行甲基化测序文库构建，建库效率和建库方法的均一性都远远优于Swift方法和传统方法。