阿糖胞苷与原癌蛋白c-FOS抑制剂在制备治疗白血病的产品中的应用

摘要

本发明公开了阿糖胞苷与原癌蛋白c‑FOS抑制剂在制备治疗白血病的产品中的应用。实验证明，阿糖胞苷联合去甲二氢愈创木酸或阿糖胞苷联合姜黄素处理白血病细胞均存在协同效应，且可以有效降低阿糖胞苷耐药株细胞与耐药共培养基中白血病细胞对阿糖胞苷的耐药反应。本发明为白血病治疗提供了一条新的克服耐药反应的途径，原癌蛋白c‑FOS有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。

权利要求

1.阿糖胞苷联合 c‑FOS抑制剂 在制备治疗白血病的产品中的应用；

所述c‑FOS抑制剂为去甲二氢愈创木酸或姜黄素；

所述白血病为急性淋巴细胞白血病；

所述阿糖胞苷与所述去甲二氢愈创木酸的摩尔比为（4‑40）nmol：1μmol；

所述阿糖胞苷与所述姜黄素的摩尔比为（4‑40）nmol：1μmol。

说明书

阿糖胞苷与原癌蛋白c‑FOS抑制剂在制备治疗白血病的产品

中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及阿糖胞苷与原癌蛋白c‑FOS抑制剂在制备治疗白血病的产品中的应用。

背景技术

[0002] 激活蛋白‑1(activating protein‑1，AP‑1)是由c‑JUN和c‑FOS组成的异二聚体，在人体细胞内发挥转录激活因子的作用。AP‑1通过调节基因的表达应对多种机体刺激，包括细胞因子、生长因子、压力、细菌和病毒表达等，因此AP‑1参与控制很多细胞进程如细胞分化、增殖和凋亡等。大量研究发现，AP‑1在许多人体肿瘤中发挥原癌蛋白的作用。尽管如此，AP‑1中的c‑JUN和c‑FOS自身发挥不同的功能。其中，c‑JUN在恶性肿瘤中呈现高表达，并通过调节细胞恶性转化、凋亡、血管形成和DNA甲基化等参与肿瘤的发生发展。相较c‑JUN，c‑FOS除了具有类似的促肿瘤作用外，其自身尚在骨细胞增殖、分化与骨髓微环境重建中发挥关键的调控作用。研究表明，在小鼠体内敲除c‑fos可引发骨重塑缺陷，导致严重的骨硬化病。

[0003] 目前在国内，c‑FOS蛋白抑制剂包括去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)和姜黄素(curcumin)。其中，去甲二氢愈创木酸是一种天然物质，广泛存在于多种含树脂的植物中；此外，化学合成该物质也已有不少报道。去甲二氢愈创木酸是一种抗氧化剂，具有多种生物学功能和治疗作用，尤其对肿瘤的增殖抑制和诱导分化具有明显作用。姜黄素是一种从姜黄中分离出的化合物，在医学上具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、抗感染等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小。科学研究表明，去甲二氢愈创木酸与姜黄素均为靶向c‑FOS的抑制剂，可有效抑制c‑FOS的激活功能。

[0004] 白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。由于分化障碍、增殖失控、凋亡受阻等机制，恶性细胞在骨髓及其他造血组织中大量增殖，引起骨髓微环境改变，从而引发严重的临床症状及并发症。其中，急性白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。我国儿童白血病发病率为4～6/10万，且发病率呈现逐年上升趋势。其中，儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是最常见的类型，约占儿童白血病的75％以上。随着联合化疗及支持疗法的应用，儿童ALL的治愈率在我国已达80％以上。尽管如此，白血病耐药和复发使得儿童ALL治疗进入瓶颈期，总体治愈率无明显提高。儿童白血病的耐药与复发率高达15％‑20％左右，已成为影响白血病患儿康复的最关键因素，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤害和不和谐因素。

[0005] 在儿童白血病化疗方案中，阿糖胞苷(cytarabine，Ara‑C)是一种作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，通过抑制细胞DNA合成干扰细胞增殖。阿糖胞苷主要用于急性白血病，对急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及急性单核细胞白血病均有疗效，并在这些疾病的治疗方案中属于诱导化疗的核心药物。尽管如此，长时间、大剂量应用阿糖胞苷容易使患儿出现耐药反应；此外，高危亚型的白血病患儿由于肿瘤恶性程度高，极易发生耐药反应与疾病复发，严重影响了白血病化疗方案的疗效与疾病转归。

发明内容

[0006] 第一方面，本发明保护阿糖胞苷和c‑FOS抑制物的新用途。

[0007] 本发明保护阿糖胞苷和c‑FOS抑制物在制备治疗白血病的产品中的应用；

[0008] 所述c‑FOS抑制物为抑制c‑FOS蛋白活性的物质或降低c‑FOS蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变c‑FOS基因的物质或抑制c‑FOS基因表达的物质。

[0009] 第二方面，本发明保护一种产品，其活性成分为阿糖胞苷和c‑FOS抑制物；

[0010] 所述c‑FOS抑制物为抑制c‑FOS蛋白活性的物质或降低c‑FOS蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变c‑FOS基因的物质或抑制c‑FOS基因表达的物质。

[0011] 上述任一所述应用或产品中，所述抑制c‑FOS蛋白活性的物质或降低c‑FOS蛋白含量的物质可为本领域技术人员公知的任一种可抑制c‑FOS蛋白合成或促进c‑FOS蛋白降解或抑制c‑FOS蛋白功能的物质，如蛋白质(如c‑FOS抗体)、多肽或小分子化合物(如c‑FOS抑制剂)等。

[0012] 所述沉默或敲除或突变c‑FOS基因的物质或抑制c‑FOS基因表达的物质可为本领域技术人员公知的任一种可使c‑FOS基因表达量降低或使c‑FOS基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的物质，如核酸分子(如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等)或CRISPR/Cas9系统等。

[0013] 在本发明的实施例中，所述抑制c‑FOS蛋白活性的物质为靶向c‑FOS的抑制剂，具体为去甲二氢愈创木酸或姜黄素。

[0014] 进一步的，所述阿糖胞苷与所述去甲二氢愈创木酸的摩尔比可为(4‑40)nmol：1μmol。

[0015] 所述阿糖胞苷与所述姜黄素的摩尔比为(4‑40)nmol：1μmol。

[0016] 更进一步的，所述阿糖胞苷与所述去甲二氢愈创木酸的摩尔比为20nmol：5μmol或200nmol：5μmol。

[0017] 所述阿糖胞苷与所述姜黄素的摩尔比为20nmol：5μmol或200nmol：5μmol。

[0018] 上述任一所述应用或产品中，所述白血病包括但不限于急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病。在本发明的实施例中，所述白血病为急性淋巴细胞白血病。

[0019] 上述任一所述应用或产品中，所述c‑FOS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列3，所述c‑FOS基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。

[0020] 本发明首先检测了小剂量阿糖胞苷(20nM)与两种c‑FOS抑制剂(去甲二氢愈创木酸或姜黄素)的联合功效。结果表明：将白血病细胞培养在含有10％FBS的RPMI‑1640培养基(普通培养基)中，采用20nM阿糖胞苷(Ara‑C)处理人B淋巴细胞白血病的细胞系Nalm‑6/Con KDBACH2 、人B淋巴细胞白血病的阿糖胞苷耐药株细胞系Nalm‑6/BACH2 ‑2和两例儿童急性B淋巴细胞白血病患儿的骨髓细胞(Pt1与Pt2)，白血病细胞的存活率分别为47.03％、
77.29％、53.15％和46.65％；以原癌蛋白c‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木酸与20nMCon KD
阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为7.88％、18.71％、12.74％和8.79％；采用5μM姜黄素与20nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/Con KD
BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为37.70％、35.77％、
43.12％和38.33％。将白血病细胞培养在耐药共培养基中，采用20nM阿糖胞苷处理Nalm‑6/Con KD
BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为90.72％、97.70％、
92.98％和91.60％；以原癌蛋白c‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木酸与20nM阿糖胞苷Con KD
联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为
31.30％、34.69％、35.68％和33.26％；采用5μM姜黄素与20nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/Con KD
BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为63.38％、61.60％、
67.54％和63.77％。

[0021] 本发明进一步检测了大剂量阿糖胞苷(200nM)与两种c‑FOS抑制剂(去甲二氢愈创木酸或姜黄素)的联合功效。结果如下：将白血病细胞培养在普通培养基中，采用200nM阿糖Con KD胞苷处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为
21.06％、50.90％、27.13％和22.85％；以原癌蛋白c‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木Con KD
酸与200nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为5.34％、9.63％、9.22％和6.79％；采用5μM姜黄素与200nM阿糖胞苷联合处理Con KD
Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为17.47％、
19.20％、22.82％和19.05％。同样，将白血病细胞培养在耐药共培养基中，采用200nM阿糖Con KD
胞苷处Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为
65.95％、79.99％、71.93％和65.16％；以原癌蛋白c‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木Con KD
酸与200nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为32.24％、34.94％、34.04％和35.68％；采用5μM姜黄素与200nM阿糖胞苷联合Con KD
处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为60.30％、
65.87％、69.05％和62.77％。

[0022] 本发明最后采用Compusyn软件分析药物联合指数(combination index，CI)分析阿糖胞苷联合去甲二氢愈创木酸或姜黄素的联合效应。实验证明，将白血病细胞培养在普Con通培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM去甲二氢愈创木酸处理Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.36与0.23，均小于1；20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素处理Con
Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.90与0.67，均小于1。同样，将白血病细胞培养在普通KD
培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM去甲二氢愈创木酸处理Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.12与0.07，均小于1；20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素处理KD
Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.06与0.12，均小于1。此外，将白血病细胞培养在耐药Con
共培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM去甲二氢愈创木酸处理Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.02与0.12，均小于1；20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素处理Con
Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.26与0.61，均小于1。同样，将白血病细胞培养在耐药KD
共培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM去甲二氢愈创木酸处理Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.01与0.08，均小于1；20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素处理KD
Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.03与0.36，均小于1。

[0023] 本发明证明阿糖胞苷联合原癌蛋白c‑FOS抑制剂(去甲二氢愈创木酸或姜黄素)在白血病细胞中可协同增加白血病细胞对化疗药物的敏感性、并降低耐药细胞对阿糖胞苷的耐药性。本发明为白血病治疗提供了一条新的克服耐药反应的途径。

附图说明

[0024] 图1为RNA干扰稳转重组白血病细胞中肿瘤抑制因子BACH2的Western Blot检测结果。其中，第一排为以BACH2单克隆抗体为一抗检测肿瘤抑制因子BACH2，第二排为以GAPDHKD单克隆抗体为一抗检测内参GAPDH。其中，BACH2 ‑1代表稳转重组白血病细胞Nalm‑6/KD KD KD Con
BACH2 ‑1；BACH2 ‑2代表稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2 ‑2；BACH2 代表稳转重组白Con
血病细胞Nalm‑6/BACH2 。

[0025] 图2为流式细胞仪检测RNA干扰稳转重组白血病细胞中的7‑AAD(‑)/Annexin V(+)与7‑AAD(+)/Annexin V(+)的细胞比例。其中，NS为生理盐水，Ara‑C为化疗药物阿糖胞苷。KD KD Con
其中，BACH2 ‑2代表稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2 ‑2；BACH2 代表稳转重组白血病Con
细胞Nalm‑6/BACH2 。

[0026] 图3为不同浓度药物处理后的稳转重组白血病细胞的存活率及药物半抑制浓度的KD统计图。其中，Ara‑C为化疗药物阿糖胞苷，红色IC50数值为BACH2 ‑2细胞的药物半抑制浓Con KD
度，黑色IC50数值为BACH2 细胞的药物半抑制浓度。其中，BACH2 ‑2代表稳转重组白血病KD Con Con
细胞Nalm‑6/BACH2 ‑2；BACH2 代表稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2 。

[0027] 图4为不同浓度药物处理后的白血病细胞的存活率及药物半抑制浓度的统计图。Con Con
其中，Ara‑C为化疗药物阿糖胞苷，BACH2 代表稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2 、KD KD
BACH2 ‑2代表稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2 ‑2，黑色IC50数值为白血病细胞在普通培养基中的药物半抑制浓度，红色IC50数值为白血病细胞在共培养基中的药物半抑制浓度。

[0028] 图5为普通培养基中采用药物处理后的白血病细胞存活率统计图。其中，Control为生理盐水(对照组)，Ara‑C为化疗药物阿糖胞苷，NDGA为原癌蛋白c‑FOS抑制剂去甲二氢愈创木酸，curcumin为原癌蛋白c‑FOS抑制剂姜黄素。其中，左侧四组数据采用20nM阿糖胞苷；右侧四组数据采用200nM阿糖胞苷。实验数据结果取平均值±标准差，其中阿糖胞苷联合去甲二氢愈创木酸与阿糖胞苷联合姜黄素组分别与阿糖胞苷处理组进行比较。普通培养基代表含有10％FBS的RPMI‑1640培养基。

[0029] 图6为共培养基中采用药物处理后的白血病细胞存活率统计图。其中，Control为生理盐水(对照组)，Ara‑C为化疗药物阿糖胞苷，NDGA为原癌蛋白c‑FOS抑制剂去甲二氢愈创木酸，curcumin为原癌蛋白c‑FOS抑制剂姜黄素。其中，左侧四组数据采用20nM阿糖胞苷；右侧四组数据采用200nM阿糖胞苷。实验数据结果取平均值±标准差，其中阿糖胞苷联合去甲二氢愈创木酸与阿糖胞苷联合姜黄素组分别与阿糖胞苷处理组进行比较。共培养基代表共培养人骨髓基质细胞系HS‑5与人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm‑6获得的培养基。

[0030] 图7为普通培养基中药物联合指数统计图。其中，A+N表示阿糖胞苷联合去甲二氢愈创木酸，A+C表示阿糖胞苷联合姜黄素，Fa表示抑制率，CI表示联合指数。普通培养基代表含有10％FBS的RPMI‑1640培养基。

[0031] 图8为共培养基中药物联合指数统计图。其中，A+N表示阿糖胞苷联合去甲二氢愈创木酸，A+C表示阿糖胞苷联合姜黄素，Fa表示抑制率，CI表示联合指数。共培养基代表共培养人骨髓基质细胞系HS‑5与人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm‑6获得的培养基。

具体实施方式

[0032] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0033] 下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值±标准差。统计分析采用t检验。*表示p值小于0.05；**表示p值小于0.01；***表示p值小于0.001。

[0034] 下述实施例中的人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm‑6是德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的产品。人骨髓基质细胞系HS‑5是北京北纳创联生物技术研究院的产品。上述细胞系均通过细胞STR鉴定确认。

[0035] 下述实施例中的慢病毒介导的shRNA质粒Lenti‑BACH2‑shRNA‑1、Lenti‑BACH2‑shRNA‑2与Lenti‑NS‑shRNA均是美国GE Dharmacon公司的产品。其中，Lenti‑BACH2‑shRNA‑1与Lenti‑BACH2‑shRNA‑2的克隆号(Clone ID)分别为V3LHS_363286和V3LHS_409004。
V3LHS_363286的成熟反义链序列：AAATTCTGAATACAGTCCA。V3LHS_409004的成熟反义链序列：ACTTCGGAACAGTATTGCT。

[0036] 下述实施例中的慢病毒包装质粒pMD2.G与psPAX2均是美国Invitrogen公司的产品。

[0037] 下述实施例中的急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗药物阿糖胞苷(Ara‑C)是赛德萨生产的注射用阿糖胞苷，生产批号为7ND5121。去甲二氢愈创木酸(NDGA)是Sigma‑Aldrich公司的产品，货号为74540‑1G。姜黄素(curcumin)是Sigma‑Aldrich公司的产品，货号为8203540010。

[0038] 下述实施例中的RPMI‑1640培养基是Thermo Fisher Scientific的产品，货号为C11875500BT。

[0039] 下述实施例中的DMEM培养基是Biological Industries公司的产品，货号为06‑1055‑57‑1ACS。

[0040] 下述实施例中的肿瘤抑制因子BACH2的氨基酸序列为序列表中的序列1，编码基因序列为序列表中的序列2。

[0041] 下述实施例中的原癌蛋白c‑FOS的氨基酸序列为序列表中的序列3，编码基因序列为序列表中的序列4。

[0042] 下述实施例中的半抑制浓度(IC50)是指50％肿瘤细胞生长受到抑制时的药物浓度。

[0043] 下述实施例中的药物联合指数CI是指在联合化疗时，对某一效应测量终点定量测定药物相互作用的程度。如果CI小于1，说明药物之间存在协同效应；如果CI等于1，说明药物之间的存在叠加作用；如果CI大于1，说明药物之间存在对抗作用。

[0044] 实施例1、供试细胞及培养基的制备

[0045] 一、临床样本的收集、采集及处理

[0046] 1、临床标本的收集

[0047] 收集从2018年11月期间在北京儿童医院住院治疗的两例白血病患儿的初诊骨髓标本。

[0048] 2、白血病初诊患儿诊断分型

[0049] 两例白血病患儿经过临床、形态学、细胞化学染色及免疫学方法确诊为普通B‑ALL(common B lineage ALL，c‑B‑ALL)。诊断分型标准按全国统一标准(小儿急性白血病诊疗建议.中华儿科杂志.1999,137(5):305‑307)。采用多重巢式反转录PCR方法检测上述两例ALL患儿初诊骨髓标本中29种染色体结构畸变形成的基因，检测结果呈阴性。患儿详细信息如表1所示。

[0050] 表1、ALL患儿初诊骨髓标本临床资料

[0051]编号 性别 初诊年龄(岁) 免疫分型 染色体易位 融合基因
1 女 2.6 c‑B‑ALL － －
2 女 3.3 c‑B‑ALL － －

[0052] 3、骨髓标本的采集

[0053] 在无菌条件下，抽取ALL患儿的骨髓2ml(从不同部位抽取，如胸骨或髂骨)，加入乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝。收集骨髓标本要求：EDTA抗凝，骨髓量大于2ml，无血凝块，标本存放时间小于24小时。

[0054] 4、提取单个核细胞

[0055] 从采集的骨髓中提取单个核细胞，具体操作步骤如下：

[0056] A.裂解红细胞：取2ml骨髓标本，放入提取管中，往提取管中加入10ml红细胞裂解液(EDTA钠盐20mg、氯化铵4.2g、碳酸氢钾0.5g，加蒸馏水定容至500ml)，与骨髓充分混合，室温放置3分钟，1000rpm常温离心3分钟。离心结束，弃去上层液体。

[0057] B.观察提取管底层提取的单个核细胞，如其中混有较多红细胞，可重复步骤A 1‑2次，去除多余红细胞。

[0058] C.洗涤裂解液：取10ml生理盐水放入提取管中，用吸管吹打底层细胞，使其与生理盐水充分混合，1000rpm常温离心3分钟，离心结束，弃去上层液体。

[0059] D.向提取管中加入少量生理盐水，用吸管吹打，使其与底层细胞混合，转移至1.5mL EP储存管中，4000rpm常温离心5秒钟，弃去上层生理盐水，提取的单个核细胞数应在
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10个数量级。

[0060] E.将提取好的单个核细胞标本存放于‑80℃冰箱，备用。

[0061] 二、肿瘤抑制因子BACH2的RNA干扰稳定转染细胞系的构建

[0062] 1、肿瘤抑制因子BACH2的RNA干扰慢病毒的包装与制备

[0063] 1)转染用细胞的培养

[0064] 转染前24小时，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基在100mm培养皿、37℃和5％CO2条件下培养人肾上皮细胞系293T达到60％～70％时进行转染。

[0065] 2)慢病毒的包装与制备

[0066] 将靶向肿瘤抑制因子BACH2的慢病毒shRNA质粒Lenti‑BACH2‑shRNA‑1和Lenti‑BACH2‑shRNA‑2，及非沉默对照的shRNA质粒Lenti‑NS‑shRNA分别转染步骤1)培养的细胞，获得表达Lenti‑BACH2‑shRNA‑1、Lenti‑BACH2‑shRNA‑1与Lenti‑NS‑shRNA的病毒液。

[0067] 上述转染的具体方法如下：

[0068] 取两个无菌1.5ml EP管，其中一个EP管中加入300μl无血清DMEM培养基稀释12μg的Lenti‑BACH2‑shRNA‑1或Lenti‑BACH2‑shRNA‑2或Lenti‑NS‑shRNA质粒、6μg的包装质粒一pMD2.G及6μg的包装质粒二psPAX2；另一个EP管中加入300μl无血清DMEM培养基，加入72μl的Lipofectamine 2000试剂。将两管充分混匀，室温静置5分钟。将600μl的混合液逐滴加入100mm细胞培养皿中，轻轻摇动平皿混匀后转移至37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养。转染48小时后收集含有慢病毒的上清液，采用0.45μm滤器将上清液过滤至50ml无菌离心管中。采用4℃超速离心机，25000rpm离心90分钟后小心去除上清液，保留管底的病毒颗粒。在管底加入1ml预冷的1×PBS缓冲液，4℃冰箱过夜。次日，将溶解的病毒液分装冻存于‑80℃低温冰箱供后续感染细胞使用。

[0069] 2、肿瘤抑制因子BACH2的RNA干扰稳定转染细胞系的筛选与建立

[0070] 将步骤1获得的病毒液分别感染人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm‑6，建立稳转重组KD KD Con白血病细胞系Nalm‑6/BACH2 ‑1、Nalm‑6/BACH2 ‑2，及对照细胞系Nalm‑6/BACH2 。具体步骤如下：

[0071] 1)感染用细胞的培养

[0072] 用含有10％FBS的RPMI‑1640培养基在T‑25透气细胞培养瓶、37℃和5％CO2条件下培养B淋巴细胞白血病细胞系Nalm‑6。

[0073] 2)慢病毒感染

[0074] 计数步骤1)培养的Nalm‑6细胞密度，取含2×106个细胞的培养液，1000rpm离心5分钟，去除培养基。采用10ml含有10％FBS的RPMI‑1640培养基在100mm培养皿中重悬细胞。在细胞悬液中加入8μg/ml聚凝胺(polybrene)，放置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。1小时后取出细胞，加入300μl病毒液，室温2500rpm离心1小时，将细胞转移至T‑25透气细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养24小时。

[0075] 3)稳定转染(稳转)重组白血病细胞系的筛选与建立

[0076] 取出步骤2)中培养的细胞系，去除培养基，加入10ml新鲜的含有10％FBS的RPMI‑1640培养基重悬细胞，继续放置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。48小时后，将T‑25培养瓶中的细胞转移至T‑75透气细胞培养瓶中，补充10ml新鲜的含有10％FBS的RPMI‑1640培养基继续培养。24小时后，去除培养基，更换20ml新鲜培养基重悬细胞，同时加入2μg/ml嘌呤霉素(puromycin)对细胞株进行筛选，每隔2‑3天更换培养基，筛选10‑14天。

[0077] 3、Western Blot检测稳转重组白血病细胞系中肿瘤抑制因子BACH2的表达[0078] 取步骤2建立的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/BACH2KD‑1、Nalm‑6/BACH2KD‑2及ConNalm‑6/BACH2 ，分别提取总蛋白，以甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，进行Western blot检测。检测肿瘤抑制因子BACH2的一抗为BACH2(分子量130KDa)单克隆抗体(购自美国Cell Signaling Technology公司)，检测内参GAPDH的一抗为GAPDH单克隆抗体(购自美国Cell Signaling Technology公司)，结果如图1所示。

[0079] 结果表明：采用Lenti‑BACH2‑shRNA‑1质粒建立的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/KDBACH2 ‑1与采用Lenti‑BACH2‑shRNA‑2质粒建立的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/KD
BACH2 ‑2中的BACH2蛋白表达水平均明显低于对照Lenti‑NS‑shRNA慢病毒建立的稳转白血Con
病细胞系Nalm‑6/BACH2 。

[0080] 上述提取总蛋白的具体方法如下：

[0081] 90g离心5分钟收集稳定表达的白血病细胞，用预冷1×PBS缓冲液洗两遍，加150～300μl RIPA缓冲液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm离心30min；吸取上清，利用Bradford法进行蛋白定量；各取20μg总蛋白进行Western blot检测。

[0082] 上述Western blot检测的具体方法如下：

[0083] 1)电泳及转膜：对待测蛋白样品进行SDS‑PAGE电泳，先在电压80V下电泳30分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120V继续电泳约1‑1.5小时，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，400m A，2小时。

[0084] 2)封闭膜：用PBS‑T溶液洗(1×PBS缓冲液中加入2ml Tween‑20，定容至1L)NC膜10‑15分钟。将NC膜放入含5％BSA的PBS‑T溶液中，室温封闭1小时。

[0085] 3)免疫杂交A、一抗孵育：将BACH2(分子量130KDa)单克隆抗体(或GAPDH单克隆抗体)按1:1000稀释于PBS‑T溶液中，4℃冷室中与NC膜在脱色摇床上孵育过夜，用5ml PBS‑T溶液洗NC膜10分钟，重复3次。

[0086] B、二抗孵育：将结合辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体按1:5000稀释在PBS‑T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约45分钟，用5ml PBS‑T溶液洗NC膜10分钟，重复3次。

[0087] 4)ECL试剂显色：使用ECL蛋白杂交检测试剂盒(美国BioRad公司)，参照操作说明进行NC膜显色反应。

[0088] 三、共培养基的制备

[0089] 1、所用细胞的培养

[0090] 用含有10％FBS的DMEM培养基在100mm培养皿、37℃和5％CO2条件下培养人骨髓基质细胞系HS‑5；用含有10％FBS的RPMI‑1640培养基(普通培养基)在T‑25透气细胞培养瓶、37℃和5％CO2条件下培养人B淋巴细胞白血病的细胞系Nalm‑6。

[0091] 2、共培养基的制备

[0092] 待步骤1中培养的HS‑5细胞形成单层贴壁细胞后，加入2×106个步骤1培养的Nalm‑6悬浮细胞，得到共培养体系，此时共培养体系中的培养基为将含有10％FBS的DMEM培养基和含有10％FBS的RPMI‑1640培养基按照体积比为1:1的比例混匀后得到的混合培养基。将共培养体系置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，共培养48小时后收集培养基，室温10000rpm离心去除悬浮细胞与细胞碎片后获得共培养基，供后续使用。

[0093] 实施例2、供试细胞和培养基的耐药性检测

[0094] 一、化疗药物处理的稳转重组白血病细胞的凋亡水平检测

[0095] 取实施例1步骤二中建立的稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2KD‑2与Nalm‑6/ConBACH2 作为供试细胞，分别培养在3mL含有10％FBS的RPMI‑1640培养基的6孔板中，细胞密
5
度为5×10 个/孔，分别加入临床上常用的急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗药物阿糖胞苷(Ara‑C)20nM及生理盐水(NS)，48小时后收获细胞，采用流式细胞仪对细胞进行凋亡检测。
细胞凋亡检测试剂盒为美国BD Biosciences公司的7‑AAD/Annexin V细胞凋亡试剂盒。结果如图2所示。

[0096] 结果表明：经Ara‑C处理后，稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2KD‑2及Nalm‑6/ConBACH2 的早期凋亡比例分别为25.63％和35.24％；晚期凋亡比例分别为12.19％和
25.44％；总体凋亡比例分别为37.82％和60.68％。经NS处理后，稳转重组白血病细胞Nalm‑KD Con
6/BACH2 ‑2及Nalm‑6/BACH2 的早期凋亡比例分别为1.85％和2.17％；晚期凋亡比例分别为1.45％和3.44％，总体凋亡比例分别为3.3％和5.61％。

[0097] 二、化疗药物处理的白血病细胞存活率的检测

[0098] 取实施例1步骤二中建立的稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2KD‑2与Nalm‑6/ConBACH2 作为供试细胞，分别培养在1mL含有10％FBS的RPMI‑1640培养基的24孔板中，细胞
4
密度为5×10 个/孔，分别加入不同药物浓度的Ara‑C(0、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、
100nM、200nM、500nM和1000nM)，48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的CellTiter‑Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率并计算药物的半抑制浓度(IC50)。结果如图3所示。

[0099] 结果表明：经不同浓度Ara‑C处理后，稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2KD‑2细胞KD Con对Ara‑C的敏感性明显下降；稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2 ‑2及Nalm‑6/BACH2 对Ara‑C的IC50分别为191.44nM与22.68nM。说明干扰肿瘤抑制因子BACH2的表达可抑制B‑ALL细胞发生凋亡，并降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，增加白血病细胞对化疗药物的耐KD
药性。本发明构建的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/BACH2 ‑2具有明显的阿糖胞苷耐药性，供后续评价联合化疗药物疗效使用。

[0100] 三、化疗药物处理的普通培养基和共培养基中的白血病细胞存活率比较[0101] 取实施例1步骤二中建立的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/BACH2KD‑2与Nalm‑6/ConBACH2 作为供试细胞，分别培养在1mL含有普通培养基(含有10％FBS的RPMI‑1640培养基)
4
与实施例1步骤三中制备的共培养基的24孔板中，细胞密度为5×10个/孔，加入不同药物浓度(0、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM)的阿糖胞苷Ara‑C，48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的CellTiter‑Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率并计算药物的半抑制浓度(IC50)。结果如图4所示。

[0102] 结果表明：在普通培养基中经Ara‑C处理后，稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/KD ConBACH2 ‑2及Nalm‑6/BACH2 的IC50分别为191.44nM与22.68nM；在共培养基中经Ara‑C处理KD Con
后，稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/BACH2 ‑2及Nalm‑6/BACH2 的IC50分别为1237.42nM与
688.99nM。说明共培养基具有明显的阿糖胞苷耐药性，并将其命名为耐药共培养基，供后续评价联合化疗药物疗效使用。

[0103] 实施例3、联合化疗药物处理的白血病细胞存活率和药物联合指数的检测[0104] 一、联合化疗药物处理的白血病细胞存活率检测

[0105] 1、取实施例1步骤一中制备的两例患儿骨髓的单个核细胞样本Pt1与Pt2、步骤二KD Con中建立的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/BACH2 ‑2及Nalm‑6/BACH2 作为供试细胞，培养
4
在1mL含有普通培养基的24孔板中，细胞密度为5×10 个/孔，每种供试细胞根据加入药物的不同又分为如下各处理组：

[0106] 处理组1：20nM阿糖胞苷Ara‑C。

[0107] 处理组2：20nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM去甲二氢愈创木酸(NDGA)。

[0108] 处理组3：20nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM姜黄素(curcumin)。

[0109] 处理组4：200nM阿糖胞苷Ara‑C。

[0110] 处理组5：200nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM去甲二氢愈创木酸(NDGA)。

[0111] 处理组6：200nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM姜黄素(curcumin)。

[0112] 同时以未进行药物处理的供试细胞作为对照(Control)。

[0113] 处理48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的CellTiter‑Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率。结果如图5所示。

[0114] 2、取实施例1步骤一中制备的两例患儿骨髓的单个核细胞样本Pt1与Pt2、步骤二KD Con中建立的稳转重组白血病细胞系Nalm‑6/BACH2 ‑2及Nalm‑6/BACH2 作为供试细胞，培养
4
在1mL含有耐药共培养基的24孔板中，细胞密度为5×10个/孔，每种供试细胞根据加入药物的不同又分为如下各处理组：

[0115] 处理组1：20nM阿糖胞苷Ara‑C。

[0116] 处理组2：20nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM去甲二氢愈创木酸(NDGA)。

[0117] 处理组3：20nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM姜黄素(curcumin)。

[0118] 处理组4：200nM阿糖胞苷Ara‑C。

[0119] 处理组5：200nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM去甲二氢愈创木酸(NDGA)。

[0120] 处理组6：200nM阿糖胞苷Ara‑C+5μM姜黄素(curcumin)。

[0121] 同时以未进行药物处理的供试细胞作为对照(Control)。

[0122] 处理48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的CellTiter‑Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率。结果如图5所示。

[0123] 结果表明：在普通培养基中，采用20nM阿糖胞苷处理Nalm‑6/BACH2Con、Nalm‑6/KDBACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为47.03％、77.29％、53.15％和46.65％；采Con KD
用5μM去甲二氢愈创木酸与20nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为7.88％、18.71％、12.74％和8.79％；采用5μM姜黄素与Con KD
20nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为37.70％、35.77％、43.12％和38.33％。

[0124] 在耐药共培养基中，采用20nM阿糖胞苷处理Nalm‑6/BACH2Con、Nalm‑6/BACH2KD‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为90.72％、97.70％、92.98％和91.60％；以原癌蛋白Conc‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木酸与20nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑KD
6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为31.30％、34.69％、35.68％和33.26％；
Con KD
采用5μM姜黄素与20nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为63.38％、61.60％、67.54％和63.77％。

[0125] 在普通培养基中，采用200nM阿糖胞苷处理Nalm‑6/BACH2Con、Nalm‑6/BACH2KD‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为21.06％、50.90％、27.13％和22.85％；以原癌蛋白Conc‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木酸与200nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、KD
Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为5.34％、9.63％、9.22％和Con KD
6.79％；采用5μM姜黄素与200nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为17.47％、19.20％、22.82％和19.05％。

[0126] 在耐药共培养基中，采用200nM阿糖胞苷处理Nalm‑6/BACH2Con、Nalm‑6/BACH2KD‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为65.95％、79.99％、71.93％和65.16％；以原癌蛋白Conc‑FOS为靶点，采用5μM去甲二氢愈创木酸与200nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、KD
Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为32.24％、34.94％、34.04％和Con KD
35.68％；采用5μM姜黄素与200nM阿糖胞苷联合处理Nalm‑6/BACH2 、Nalm‑6/BACH2 ‑2、Pt1与Pt2，白血病细胞的存活率分别为60.30％、65.87％、69.05％和62.77％。

[0127] 二、药物联合指数的检测

[0128] 取实施例1步骤二中建立的稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2Con与Nalm‑6/KDBACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在普通培养基中，分别加入不同浓度的阿糖胞苷Ara‑C(0、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、500nM与1000nM)处理细胞；同步取Nalm‑6/Con KD
BACH2 与Nalm‑6/BACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在普通培养基中，分别加入不同浓度的去甲二氢愈创木酸NDGA(0、5nM、50nM、500nM、5000nM与25000nM)处理细胞；再取Nalm‑6/Con KD
BACH2 与Nalm‑6/BACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在普通培养基中，分别加入不同浓度的姜黄素curcumin(0、5nM、50nM、500nM、5000nM与25000nM)处理细胞；最后取Nalm‑6/Con KD
BACH2 与Nalm‑6/BACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在普通培养基中，分别加入不同药物组合(20nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM去甲二氢愈创木酸NDGA、200nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM去甲二氢愈创木酸NDGA、20nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM姜黄素curcumin、200nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM姜黄素curcumin)联合处理细胞；48小时后分别收获上述处理细胞，采用美国Promega公司的CellTiter‑Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率。

[0129] 取实施例1步骤二中建立的稳转重组白血病细胞Nalm‑6/BACH2Con与Nalm‑6/KDBACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在耐药共培养基中，分别加入不同浓度的阿糖胞苷Ara‑C(0、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、500nM与1000nM)处理细胞；同步取Nalm‑6/Con KD
BACH2 与Nalm‑6/BACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在耐药共培养基中，分别加入不同浓度的去甲二氢愈创木酸NDGA(0、5nM、50nM、500nM、5000nM与25000nM)处理细胞；再取Nalm‑Con KD
6/BACH2 与Nalm‑6/BACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在耐药共培养基中，分别加入不同浓度的姜黄素curcumin(0、5nM、50nM、500nM、5000nM与25000nM)处理细胞；最后取Nalm‑6/Con KD
BACH2 与Nalm‑6/BACH2 ‑2作为供试细胞，分别培养在耐药共培养基中，分别加入不同药物组合(20nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM去甲二氢愈创木酸NDGA、200nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM去甲二氢愈创木酸NDGA、20nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM姜黄素curcumin、200nM阿糖胞苷Ara‑C与5μM姜黄素curcumin)联合处理细胞；48小时后分别收获上述处理细胞，采用美国Promega公司的CellTiter‑Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率。将上述各组数据输入Compusyn软件计算药物联合指数CI，计算公式为：

[0130]

[0131] 其中，n代表联合药物的数量；(Dx)i代表i药物单独抑制x％的剂量；(D)i代表i药物在联合治疗中抑制x％时的剂量。CI小于1说明药物之间存在协同效应；如果CI等于1说明药物之间的存在叠加作用；CI大于1说明药物之间存在对抗作用。

[0132] 结果如图7和图8所示。

[0133] 结果表明：将白血病细胞培养在普通培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μConM去甲二氢愈创木酸NDGA处理Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.36与0.23，均小于1；
Con
20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素curcumin处理Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.90与0.67，均小于1。同样，将白血病细胞培养在普通培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷KD
分别联合5μM去甲二氢愈创木酸NDGA处理Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.12与0.07，KD
均小于1；20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素curcumin处理Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.06与0.12，均小于1。

[0134] 此外，将白血病细胞培养在耐药共培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μMCon去甲二氢愈创木酸NDGA处理Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为0.02与0.12，均小于1；20nMCon
与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素curcumin处理Nalm‑6/BACH2 细胞的CI值分别为
0.26与0.61，均小于1。同样，将白血病细胞培养在耐药共培养基中，20nM与200nM阿糖胞苷KD
分别联合5μM去甲二氢愈创木酸NDGA处理Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.01与0.08，KD
均小于1；20nM与200nM阿糖胞苷分别联合5μM姜黄素curcumin处理Nalm‑6/BACH2 ‑2细胞的CI值分别为0.03与0.36，均小于1。

[0135] 以上结果表明，联合阿糖胞苷与原癌蛋白c‑FOS抑制剂在白血病细胞中可协同增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，可有效降低阿糖胞苷耐药株细胞与耐药共培养基中白血病细胞对化疗药物的耐药性。

[0136] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。