米根霉、菌剂、麸曲及其制备方法以及它们的应用、酒及其制备方法

摘要

本发明涉及微生物和酿造工艺领域，具体地涉及米根霉、菌剂、麸曲及其制备方法以及它们的应用、酒及其制备方法。该米根霉（Rhizopus oryzaeAC01）的保藏编号为CGMCC No.20247。本发明提供的米根霉具有能够显著提高和稳定麸曲糖化酶活力的作用，对于开发具有高糖化力麸曲产品具有重要意义，利用该米根霉制备而成的麸曲应用于发酵食品生产时具有糖化力高、产蜜香等特点。

权利要求

1.一株米根霉Rhizopus oryzae BC 70107，其特征在于，该米根霉的保藏编号为CGMCC No.20247。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的米根霉Rhizopus oryzae  BC 

70107。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其中，所述菌剂以小曲、麸曲、麦曲、菌丝体和孢子悬液中的至少一种的形式存在。

4.一种麸曲的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的米根霉Rhizopus oryzae BC 70107接种到麸曲培养基中进行培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述米根霉BC 70107以孢子悬浮液的形式进行接种，接种量为107-108个孢子/g麸曲培养基。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述麸曲培养基包含麸皮和水；

其中，所述麸曲培养基中，麸皮的含量为50-70重量%。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法，其中，所述培养的条件包括：温度为28-30℃，时间为40-90 h。

8.根据权利要求4-7中任意一项所述的方法制得的麸曲。

9.如权利要求1所述的米根霉、权利要求2或3所述的菌剂，或者权利要求8所述的麸曲在生产发酵食品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述发酵食品为酒、醋、酱油、腐乳、醪糟或豆豉。

11.一种酿酒的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求8所述的麸曲接种到酿酒熟料中进行酿酒。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，以酿酒熟料的重量为基准，所述麸曲的接种量为3-6重量‰。

13.根据权利要求11或12所述的酿酒的方法酿制的酒。

说明书

米根霉、菌剂、麸曲及其制备方法以及它们的应用、酒及其制

备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一株米根霉、一种菌剂、一种麸曲及其制备方法，米根霉、菌剂和麸曲在生产发酵食品中的应用，一种酒及其制备方法。

背景技术

[0002] 相对于传统小曲，纯种根霉曲具有糖化发酵力高、制作周期短、生产成本低等显著优势，现已有部分使用小曲的酒厂在使用纯种根霉曲进行白酒的生产。种曲，顾名思义就是制作酒曲的种子，即将试管菌种在培养料上进行扩大培养的过程，其在纯种制曲领域的地位至关重要。在日本，其清酒酿造工业中就需使用米曲霉种曲，而且已经实现了专业化、规模化生产。在国内，一些酒厂采用纯种米根霉曲替代所用小曲，不仅提高糖化程度及缩短糖化时间，还为酒体的风味带来有益改观。

[0003] 米根霉（Rhizopus oryzae）常被用于东亚及东南亚地区的食品发酵中，含有丰富的糖化型淀粉酶，能将糯米淀粉结构中的α-1,4键和α-1,6键切断，使绝大部分淀粉转化为可发酵性糖，如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。米根霉在发酵过程中产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇、3-甲基丁醇、乙醛等芳香性风味物质。米根霉细胞中还含有少量产生乳酸等有机酸的酶系，从而可使米根霉发酵出的酒具有独特风味。此外，米根霉还可用于印尼豆豉（Tempeh）、腐乳、食醋等调味品的发酵。

[0004] 所以筛选糖化酶活力高的霉菌，特别是筛选发酵性能良好的霉菌菌株，是提高酿酒用麸曲糖化酶活力、为生产适合不同酿造环境的麸曲以及稳定和提升酿酒品质主要措施之一。然而，目前白酒酿造业使用的麸曲存在菌株组成复杂、香气不好、糖化力有待提高等问题，阻碍了麸曲产品在白酒酿造业大规模应用和规模化生产。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了克服白酒酿造业使用的麸曲存在菌株组成复杂、香气不好、糖化力有待提高等问题，提供一株米根霉、一种菌剂、一种麸曲及其制备方法，米根霉、菌剂和麸曲在生产发酵食品中的应用，一种酒及其制备方法。本发明提供的米根霉具有能够显著提高和稳定麸曲糖化酶活力的作用，利用该米根霉制备的麸曲用于白酒酿造时具有糖化力高和产蜜香的优点。

[0006] 为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株米根霉（Rhizopus oryzae  BC 70107），该米根霉的保藏编号为CGMCC No.20247。

[0007] 本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107）。

[0008] 本发明第三方面提供一种麸曲的制备方法，该方法包括：将如上所述的米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107）接种到麸曲培养基中进行培养。

[0009] 本发明第四方面提供如上所述的方法制得的麸曲。

[0010] 本发明第五方面提供如上所述的米根霉、菌剂或麸曲在生产发酵食品中的应用。

[0011] 本发明第六方面提供一种酿酒的方法，该方法包括：将如上所述的麸曲接种到酿酒熟料中进行酿酒。

[0012] 本发明第七方面提供如上所述的酿酒的方法酿制的酒。

[0013] 本发明提供的米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107），具有糖化力高、产蜜香的特点，对于开发具有高糖化力、有产香要求的麸曲产品具有重要意义。

[0014] 生物保藏

[0015] 本发明的菌株米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107），于2020年08月26日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20247。

附图说明

[0016] 图1是本发明所述的米根霉的外观形态图；

[0017] 图2是本发明所述的米根霉的显微镜图；

[0018] 图3是本发明实施例3所述的不同米根霉麸曲酿酒发酵实验感官评价的雷达图。

具体实施方式

[0019] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0020] 本发明第一方面提供一株米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107），该米根霉的保藏编号为CGMCC No.20247。

[0021] 根据本发明，可以通过包含以下步骤的方法进行筛选获得性能更好的菌株。具体地，所述筛选的方法包括：（1）采集酿酒过程中不同发酵阶段的样品，经过分离、纯化和初筛获得具有糖化功能的菌株；（2）将步骤（1）得到的具有糖化功能的菌株通过发酵试验进行二筛，选取糖化酶活力高的米根霉菌株；（3）将步骤（2）二筛得到的糖化酶活力高的米根霉菌株通过发酵原料发酵进行复筛，从中选取风味好、产蜜香的米根霉菌株。

[0022] 根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（1）中，为了确保分离纯化效果，所述纯化培养可以根据实际情况进行多次重复。

[0023] 其中，所述分离和纯化可以在本领域常规使用的固体培养基中进行，优选地，所述固体培养基为孟加拉红固体培养基。

[0024] 在所述分离和纯化过程中，挑选具有典型霉菌菌落特征的单菌落。

[0025] 根据本发明，所述米根霉（Rhizopus oryzae  BC 70107）分离自酿酒过程的物料。采集酿酒过程中不同酿酒阶段的酿酒物料，无菌条件下取适量将其粉碎，准确称量5g酿酒-1
物料，置于装有45mL生理盐水的无菌容器内，室温震荡10min，制成10 的样品均匀液，将其沿管壁缓慢注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，逐级稀释到10-2，10-3，10-4，10-5。无菌操作下梯度稀释涂布于孟加拉红培养基中，于28℃培养箱中静置培养2-3天，随机选取具有典型霉菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2-3次，获得单个纯种菌落，镜检确定为霉菌后，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面保存备用。

[0026] 在本发明中，初筛的方式可以是本领域常规的方式，优选地，将分离获得的霉菌菌株采用点种法接种于糖化酶活筛选培养基平板上，用透明圈法进行高产糖化酶活性霉菌的初筛。

[0027] 其中，糖化酶活筛选培养基的本领域常规使用的筛选具有糖化功能菌株的培养基，优选地，其组成包括：可溶性淀粉5-20 g/L，酵母浸粉0.5-3 g/L，NaNO3 0.5-3 g/L，K2HPO4 0.5-3 g/L，NaCl 0.5-2 g/L，MgSO4 0.5-2 g/L，FeSO4 0.001-0.03 g/L，琼脂10-40 g/L。

[0028] 其中，通过比较透明圈的大小来进行初筛，透明圈大的菌株为糖化酶活性高的菌株。

[0029] 在本发明的一种优选的实施方式中，采用点接法，用无菌接种针将霉菌菌株依次点接于糖化酶活筛选培养基上，在25-35℃下正置培养48-84h，然后向培养皿中加入碘液，2-8min后，测量透明圈直径，透明圈大的菌株为糖化酶活性高的菌株。

[0030] 根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（2）中，所述发酵试验包括：麸曲的制备和糖化力测定以及可选的感官测定。

[0031] 其中，所述麸曲的制备方法优选包括将米根霉接种到麸曲培养基中进行培养。

[0032] 所述麸曲培养基可以为本领域常规的麸曲培养基，优选地，所述麸曲培养基包含麸皮和水。

[0033] 优选地，所述麸曲培养基中，麸皮的含量为50-70重量%。

[0034] 所述麸曲培养基的制备方法可以为本领域常规的方法，比如，所述麸曲培养基的制备包括：称取30-50g麸皮，装入500mL三角瓶中，厚度约为2-4cm，加水使得麸曲培养基中麸皮的含量为50-70重量%（优选为55-65重量%）。高温高压灭菌处理。灭菌完成后，趁热轻轻摇动，打散结块，瓶壁冷凝水及麸皮均落入培养基内，待冷却至30-35℃后备用。

[0035] 所述米根霉的接种方式可以为本领域常规的接种方式，比如可以以孢子悬浮液的形式接种，或者从米根霉斜面上挑取一环菌种进行接种。

[0036] 优选地，所述米根霉以孢子悬浮液的形式进行接种，接种量为107-108个孢子/g麸曲培养基。

[0037] 根据本发明的优选实施方式，所述培养的条件包括：温度范围为25-35℃，时间40-90 h。更优选地，所述培养的条件包括：温度28-32℃，时间48-72 h。

[0038] 为了对麸曲进行感官评价，在本发明的一种优选的实施方式中，将所述米根霉接种到麸曲培养基中，混匀后25-35℃培养48-72h，而后扣瓶（菌丝体布满麸皮培养基，将麸皮连接成饼状后，进行扣瓶，以增加空气接触的面积）继续培养20-24h。然后，在35-40℃烘干20-24h，使得得到的麸曲中水分含量在12%以下，菌体停止生长。

[0039] 本发明所述的米根霉BC 70107制备得到的麸曲感官评价结果包括：麸曲结块紧实富有弹性，无烧心和干皮，没有黑色孢子，无异杂味。

[0040] 根据本发明，按照QB/T4257—2011测定麸曲的糖化力和感官评价。

[0041] 根据检测结果，选取得到糖化酶活力高的米根霉菌株。

[0042] 根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵原料发酵的步骤包括：制备麸曲、制备发酵培养基和发酵。然后，通过对发酵产物进行感官评价，筛选出风味好、产蜜香的米根霉菌株。

[0043] 其中，麸曲的制备方法可以参见如上所述的内容，在此不再赘述。

[0044] 根据本发明，所述发酵培养基的制备方法优选包括：淀粉质原料浸泡后蒸煮，得到发酵培养基。

[0045] 所述淀粉质原料可以为本领域常用的淀粉质原料，包括但不限于高粱、大米、糯米、玉米、小麦等，优选地，所述淀粉质原料选自高粱、大米、糯米、玉米和小麦中的至少一种。

[0046] 其中，浸泡的时间可以在较宽的范围内选择，不同的淀粉质原料其浸泡时间不同，比如，高粱浸泡的时间为12-36h，糯米、大米、玉米等浸泡的时间为0.2-3 h。

[0047] 其中，根据淀粉质原料的种类不同，蒸煮的时间不同。比如，高粱蒸煮的时间为4-5 h，糯米、大米、玉米等蒸煮的时间为1-2 h。

[0048] 可以选择上述淀粉质原料的一种或多种制备发酵培养基，当选择多种淀粉质原料时，可以根据种类的差别分别对淀粉质原料进行浸泡和蒸煮，然后将蒸煮好的淀粉质原料混合均匀后，即得到发酵培养基。

[0049] 所述发酵的方法可以为本领域常规的方法，优选地，所述发酵的方法包括：将制备的麸曲接种到发酵培养基中进行发酵。

[0050] 优选地，以发酵培养基的重量为基准，所述麸曲的接种量为3-6重量‰。

[0051] 优选地，所述发酵的条件包括：温度为25-40℃，时间为14-48 h。更优选地，所述发酵的条件包括：温度为30-37℃，时间为24-40 h。

[0052] 在本发明的一种优选的实施方式中，将经淘洗的糯米与蒸馏水按照重量比为1:0.5-3混合，确保米要分摊均匀，蒸煮30-90 min。蒸煮后损失的重量使用冷开水补足。待米饭温度降到30-35℃时，将麸曲样品均匀撒在米饭上并拌匀，麸曲的添加量为米饭的0.3-
0.6重量%。将米饭拨至饭盒的一边，均匀压成斜面，进行搭窝操作，以增加酒饭和空气的接触面，利于糖化。盖上盖子后放入30-37℃恒温培养箱，培养24-40h后取出。

[0053] 根据本发明，采用GB 5009.7-2016方法测定还原糖含量。根据还原糖含量，选取糖化能力高的米根霉菌株。

[0054] 可以对发酵产物进行香气、口味口感等方面组织进行感官评价。所述感官评价的标准可以参见GB 12313-1990。

[0055] 通过上述筛选，得到糖化能力高、发酵风味好和产蜜香的米根霉菌株。

[0056] 根据本发明，糖化力是指对麸曲进行糖化力评价，参考QB/T4257-2011；糖化能力是检测菌株对淀粉质原料的糖化能力，通过还原糖含量的大小进行表征。

[0057] 对通过筛选得到的菌株进行鉴定，鉴定的方法可以包括形态鉴定和分子鉴定（ITS1序列测定）。

[0058] 其中，所述形态鉴定的方式可以包括：将得到的糖化酶活性高的菌株在孟加拉红培养基中在28℃条件下静置培养，观察其培养特征，并在光学显微镜观察分离纯化的菌株的菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态。菌落为绒毛状、最初呈白色，后变为灰褐色，干燥，大而疏松，不透明，菌丝相互缠绕，易挑起，铺满整个平板（图1所示为培养72h时的形态）。如图2所示，米根霉的形态在显微镜（400倍）下呈现匍匐爬行，假根发达，分枝呈现根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍有弯曲，孢囊孢子成椭圆形或球状，大小不一致。

[0059] 所述分子鉴定的方式可以包括：应用CTAB法提取基因组DNA，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行分子鉴定，将测序结果通过NCBI数据库进行同源性比对分析，根据其结果确定为米根霉。

[0060] 本发明的米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107）的ITS1序列如SEQ ID NO:1所示：

[0061] CTGCGGAAGGATCATTAATTATGTTAAAGCGCCTTACCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTGATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTTTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGTAACTTTCAAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATC。

[0062] 其中，孟加拉红培养基和PDA培养基可以通过商购获得，本领域技术人员可以按照本领域常规的制备方法制备固体培养基。

[0063] 本发明所述的米根霉BC 70107具有糖化力高和产蜜香的特点。

[0064] 本发明的菌株米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107），于2020年08月26日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20247。

[0065] 本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107）。

[0066] 所述菌剂的形态可以为本领域常见的菌剂形态，比如固体或液体菌剂。优选地，所述菌剂以小曲、麸曲、麦曲、菌丝体和孢子悬液中的至少一种的形式存在。

[0067] 小曲、麸曲和麦曲的制备方法可以参见本领域常规的制备方法进行制备，在此不再赘述。其中，麦曲包括生麦曲和熟麦曲。

[0068] 所述菌丝体和孢子悬液的制备方法可以为本领域常规的制备方法，在此不再赘述。

[0069] 本发明第三方面提供一种麸曲的制备方法，该方法包括：将如上所述的米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107）接种到麸曲培养基中进行培养。

[0070] 其中，所述麸曲的制备方法可以参见第一方面所述的内容，在此不再赘述。

[0071] 本发明第四方面提供如上所述的方法制得的麸曲。

[0072] 本发明第五方面提供如上所述的米根霉、菌剂或麸曲在生产发酵食品中的应用。

[0073] 所述发酵食品可以是任意能够用米根霉发酵制得的发酵食品，所述发酵食品包括但不限于酒（包括白酒、黄酒、米酒等）、醋、酱油、腐乳、醪糟、豆豉等发酵食品。

[0074] 在本发明的一种优选的实施方式中，通过本发明所述的米根霉制备得到的麦曲制备黄酒，所述麦曲为熟麦曲。

[0075] 优选地，所述熟麦曲的制备方法包括：小麦粒通过轧麦机轧碎，每粒轧成3-4片，然后与水混合，水的加入量使得所述熟麦曲中水的含量为10-30重量%。接种米根霉BC 70107制备的麸曲，麸曲的接种量为小麦的3-15重量‰，然后培养24-48小时，即可得到熟麦曲。

[0076] 所述培养可以在曲池中进行，曲池应在使用前采用硫熏法或甲醛法来彻底杀菌。

[0077] 优选地，黄酒的酿造方法包括：取糯米浸泡8-24h，沥干，蒸煮至熟而不粘、内无生芯，得到熟米饭。冷却后落缸，熟麦曲添加量为熟米饭的10-30重量%，落缸温度控制在20-30℃。之后再经过开耙、后发酵、压滤和煎酒制备得到黄酒。

[0078] 本领域技术人员可以根据本领域常规的方法生产发酵食品，在此不再赘述。

[0079] 本发明第六方面提供一种酿酒的方法，该方法包括：将如上所述的麸曲接种到酿酒熟料中进行酿酒。

[0080] 其中，麸曲的制备方法可以参见如上所述的内容，在此不再赘述。

[0081] 根据本发明，所述酿酒熟料的制备方法优选包括：淀粉质原料浸泡后蒸煮，得到酿酒熟料。

[0082] 所述淀粉质原料可以为本领域常用的淀粉质原料，包括但不限于高粱、大米、糯米、玉米、小麦等，优选地，所述淀粉质原料选自高粱、大米、糯米、玉米和小麦中的至少一种。

[0083] 所述淀粉质原料中各组分的含量可以在较宽的范围内选择。

[0084] 根据本发明的优选实施方式，所述淀粉质原料包含高粱、大米、糯米和可选的玉米，其中，所述淀粉质原料中，高粱的含量为60-80重量%，大米的含量为10-25重量%，大米的含量为5-15重量%，玉米的含量为0-10重量%。

[0085] 浸泡和蒸煮的时间可参见第一方面，在此不再赘述。

[0086] 可以选择上述淀粉质原料的一种或多种制备酿酒熟料，当选择多种淀粉质原料时，可以根据种类的差别对淀粉质原料进行浸泡和蒸煮，然后将蒸煮好的淀粉质原料混合均匀后，即得到酿酒熟料。

[0087] 优选地，以酿酒熟料的重量为基准，所述麸曲的接种量为3-6重量‰。

[0088] 所述酿酒的温度可以根据酒的种类不同而有所差别，比如，当酿制的酒为白酒时，所述酿酒的温度可以为5-45℃，更优选15-25℃。

[0089] 所述酿酒的时间可以在较宽的范围内选择，本领域技术人员可以根据需要选择合适的酿酒时间。

[0090] 本发明第七方面提供如上所述的酿酒的方法酿制的酒。

[0091] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0092] 以下实施例中，若无特别说明，使用的原料和试剂均通过商购获得。

[0093] 在以下实施例中，分离和纯化使用的培养基为孟加拉红培养基，其配置方法为：称取36.6 g合成培养基，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌20min即可。

[0094] 糖化酶活筛选培养基：可溶性淀粉10g/L，酵母浸粉1.5g/L，NaNO3 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，琼脂20g/L。

[0095] ITS测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

[0096] 按照QB/T4257-2011标准进行感官评价和糖化力测定。

[0097] 参照GB 12313-1990标准进行酿酒感官评价。

[0098] 酿酒酵母购自安琪酵母股份有限公司。

[0099] 实施例1

[0100] 本实施例用于说明本发明提供的米根霉菌株的分离、纯化、筛选和鉴定。

[0101] （1）分离、纯化和初筛

[0102] 采集不同酿酒原料发酵阶段的酿酒物料，无菌条件下取适量将其粉碎，准确称量5 g酿酒过程样品，置于装有45mL生理盐水的无菌容器内，室温震荡10min，制成10-1的样品均匀液，将其沿管壁缓慢注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，逐级稀释到10-2，10-3，10-4，10-5。无菌操作下梯度稀释涂布于孟加拉红培养基中，于28℃培养箱中静置培养2天，随机选取具有典型霉菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化3次，获得单个纯种菌落，镜检确定为霉菌后，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面保存备用。

[0103] 采用点接法，用无菌接种针将霉菌菌株依次点接于糖化酶活筛选培养基上（三个平行），在28℃下正置培养72小时，然后向培养皿中加入4mL稀碘液，5min后，测量透明圈直径，透明圈大的菌株为糖化酶活性高的菌株。斜面保存备用。

[0104] （2）二筛

[0105] 配制麸皮培养基：称取45g麸皮，装入500mL三角瓶中，加入蒸馏水30g，121℃高压灭菌30 min，待冷却至30±2℃后，打散备用。

[0106] 使用接种环从斜面挑取一环，接种于麸皮培养基，混匀。30℃条件下培养3天，无菌条件下装入无菌牛皮纸袋中，于干燥箱内40℃烘干24 h，水分含量控制在10%左右。对得到的麸曲进行感官评价，并根据以下标准进行筛选：麸曲结块紧实富有弹性，无烧心和干皮，没有黑色孢子，无异杂味。对得到麸曲进行糖化力测定，并根据结果选取得到糖化酶活力高的米根霉菌株。

[0107] （3）复筛

[0108] 称取适量糯米，淘洗两次后用漏盆将水滤干。在无菌铝盒中加入淘洗好的生米和蒸馏水，生米与蒸馏水重量比为1:1.5，确保米要分摊均匀，蒸煮60min。蒸煮后损失的重量使用冷开水补足。称取蒸好的米饭40g置于无菌铝盒中。待米饭温度下降到30-35℃时，将麸曲分别均匀撒在米饭上并拌匀，麸曲的添加量为米饭的0.5重量%。将米饭拨至饭盒的一边，均匀压成斜面，盖上盖子后放入30℃恒温培养箱，培养24h后取出。对发酵产物的混合物（发酵后的糯米和汁液的混合物）进行糖分检测。根据检测结果，选取得到糖化能力高的米根霉菌株。并根据感官评价，选取风味好的菌株。

[0109] （4）鉴定

[0110] 将糖化酶活性高的菌株进行菌株鉴定，其中，所述鉴定方法包括形态鉴定和分子鉴定（ITS1序列测定）。

[0111] 形态鉴定：将步骤（3）筛选得到的风味好、糖化能力高的菌株在孟加拉红培养基中在28℃条件下静置培养，观察其培养特征，并在光学显微镜观察分离纯化的菌株的菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态。菌落为绒毛状、最初呈白色，后变为灰褐色，干燥，大而疏松，不透明，菌丝相互缠绕，易挑起，铺满整个平板（图1所示为培养72h时的形态）。如图2所示，米根霉的形态在显微镜（400倍）下呈现匍匐爬行，假根发达，分枝呈现根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍有弯曲，孢囊孢子成椭圆形或球状，大小不一致。

[0112] ITS序列测定：霉菌DNA提取应用CTAB法提取基因组DNA。DNA送生工生物工程（上海）股份有限公司进行分子鉴定，采用对ITS1进行测序，将测序结果通过NCBI数据库进行同源性比对分析，根据其结果确定为米根霉。

[0113] 本发明的菌株米根霉（Rhizopus oryzae BC 70107），于2020年08月26日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20247。

[0114] 本发明所述的米根霉BC 70107制备得到的麸曲感官评价结果包括：麸曲结块紧实富有弹性，无烧心和干皮，没有黑色孢子，无异杂味。

[0115] 本发明所述的米根霉BC 70107具有糖化力高和风味好的特点。

[0116] 实施例2

[0117] 本实施例用于说明本发明提供的米根霉菌株的糖化力测定。

[0118] 使用实施例1分离筛得到的米根霉BC 70107进行麸曲培养，并对不同培养时间获得的麸曲进行糖化力和糖化能力评价。

[0119] （1）配制麸皮培养基：称取45g麸皮，装入500mL三角瓶中，加入蒸馏水30g，121℃高压灭菌30 min，待冷却至30±2℃后，打散备用。

[0120] （2）使用接种环从米根霉斜面挑取一环，接种于麸皮培养基，混匀。30℃条件下分别培养3天、5天、7天，无菌条件下装入无菌牛皮纸袋中，于干燥箱内40℃烘干24h，水分含量控制在10%左右。

[0121] 检测培养不同时间的麸曲糖化力，测试结果见表1。

[0122] （3）发酵能力评价：

[0123] 称取适量糯米，淘洗两次后用漏盆将水滤干。在无菌铝盒中加入淘洗好的生米和蒸馏水，生米与蒸馏水重量比为1:1.5，确保米要分摊均匀，蒸煮60min。蒸煮后损失的重量使用冷开水补足。称取蒸好的米饭40g置于无菌铝盒中。待米饭温度下降到30-35℃时，将步骤（2）中制得的不同培养时间的麸曲分别均匀撒在米饭上并拌匀，麸曲的添加量为米饭的0.5重量%。将米饭拨至饭盒的一边，均匀压成斜面，盖上盖子后放入30℃恒温培养箱，培养
24 h后取出。

[0124] 观察发酵产物的外观，并对发酵产物的混合物（发酵后的糯米和汁液的混合物）进行糖分检测和感官评价，结果见表2。

[0125] 表1

[0126]

[0127] 表2

[0128]

[0129] 实施例3

[0130] 本实施例用于说明使用本发明提供的米根霉BC 70107制备的麸曲进行白酒酿造的方法和对酿酒料的评价。

[0131] （1）淀粉质原料选择：所述淀粉质原料中含有70 %重量的高粱、10重量%的大米、15重量%的糯米和5重量%的玉米。

[0132] （2）原料预处理：将高粱浸泡24h后，蒸煮5h；将糯米、大米、玉米混合浸泡后2h蒸煮2 h；将蒸煮完毕的各物料混合均匀即为酿酒熟料。

[0133] （3）接种麸曲和酿酒：将酿酒熟料平均分成4份，分别接种由实施例2中得到培养3天的米根霉BC 70107麸曲、商业麸曲（购自贵州立高轻工科技发展有限公司的笑仙甜酒曲）以及其他两种糖化力较好的纯种米根霉（米根霉AC31和米根霉AC07，与米根霉BC 70107同批次筛选得到）麸曲，接种量为酿酒熟料的5重量‰。

[0134] 在温度为30℃的条件下发酵，时间为48h。

[0135] 对麸曲的糖化力进行测定，结果见表3。

[0136] （4）感官评价：对发酵过程和发酵结束后的酿酒料，进行感官评价，结果见表3。

[0137] 并具体针对粮香、蜜香、酯香、曲香等风味维度，根据强度大小进行感官评价（参见GB/T 12313-1990），结果见图3。图3示出了不同米根霉麸曲酿酒发酵实验感官评价的雷达图，从图3可以看出，本发明所述的米根霉BC 70107蜜香突出。

[0138] 表3

[0139]

[0140] 实施例4

[0141] 本实施例用于对米根霉BC 70107麸曲初始水分含量进行优化，具体方法如下：

[0142] 1）分别向装有45g麸皮的500 mL三角瓶中，加入蒸馏水配制麸皮培养基，蒸馏水的加入量使得麸皮培养基中水分含量为40重量%、45重量%、50重量%、55重量%、60重量%、65重量%、70重量%，121℃高压灭菌30min，待冷却至32±2℃后，打散备用。

[0143] 2）将筛选出得到的米根霉BC 70107制得孢子悬浮液，分别按0.5重量%的接种量接7 8
入不同初始水分的麸皮培养基（10-10个孢子/mL），混匀，30℃培养72 h。扣瓶，继续培养
24h。于干燥箱内40℃烘干24h。

[0144] 不同水分含量的麸曲培养基制备得到的麸曲的糖化力结果见表4。

[0145] 表4

[0146]

[0147] 实施例5

[0148] 本实施例用于说明本发明所述的米根霉麸曲在黄酒酿造中的应用

[0149] （1）使用实施例2培养3天得到的米根霉BC 70107麸曲制备熟麦曲。

[0150] （2）熟麦曲制备：清理干净的小麦通过轧麦机轧碎，每粒轧成3-4片，之后加入21重量%的水。接种米根霉BC 70107制备的麸曲，麸曲的接种量为小麦重量的3-15‰，充分混合搅拌。混合好的麦曲入曲池培养36小时，即可得到熟麦曲。曲池应在使用前采用硫熏法或甲醛法来彻底杀菌。

[0151] （3）黄酒酿造：称取1000 g糯米浸泡12 h，沥干，蒸煮至熟而不粘、内无生芯，冷却后落缸。熟麦曲添加量为米饭的18重量%，落缸温度控制在20-30℃。之后再经过开耙、后发酵、压滤、煎酒等工艺步骤制备黄酒。

[0152] 酿造得到的黄酒的检测（参见GB/T 13662-2018）结果见表5。

[0153] 感官评价结果：酒体呈淡黄色，有黄酒特色浓郁醇香，醇厚，无异味，酒体协调。

[0154] 表5

[0155]

[0156] 实施例6

[0157] 本实施例用于应用该米根霉BC 70107麸曲在米酒酿造中的应用

[0158] 称取500g糯米浸泡12h，沥干，蒸煮至熟而不粘，取适量水将糯米饭打散，装入烧杯中，向糯米饭中接种米根霉麸曲和酿酒酵母，使用无菌的玻璃棒搅拌均匀，保鲜膜封口，戳孔，30℃培养3天。其中，米根霉麸曲的接种量为糯米饭的5重量‰，酿酒酵母的接种量为糯米饭的10重量%。

[0159] 酿造得到的米酒的糖度、酒精度、酸度以及感官评价的结果见表6。

[0160] 表6

[0161]

[0162] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。