一株益生芽胞杆菌的筛选及应用

摘要

本发明属于农业微生物应用领域，具体涉及一株益生芽胞杆菌的筛选及应用。本发明与反刍动物瘤胃消化相关的益生素添加剂的筛选和应用有关。本发明筛选得到一株对肉牛有显著促生长效用的副地衣芽胞杆菌菌株，经过16S rRNA基因鉴定、益生性能检测、安全性评价和抗逆性能的鉴定，验证了本发明可以作为肉犊牛饲料添加剂促生长的应用。本发明的副地衣芽胞杆菌菌株(Bacillus paralicheniformis)SN‑6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020136。所述菌株生长速度快、抗逆性强、安全和促进生长，可作为畜禽饲用微生态添加剂。

权利要求

1.一种分离筛选的副地衣芽胞杆菌（Bacillus paralicheniformis）SN‑6菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020136。

2.权利要求1所述的副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株在制备畜禽饲用微生态添加剂中的应用。

说明书

一株益生芽胞杆菌的筛选及应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业微生物应用领域，具体涉及一株益生芽胞杆菌的筛选及应用。本发明与反刍动物瘤胃消化相关的益生素添加剂的筛选和应用有关。本发明筛选得到一株对
肉牛有显著促生长效用的副地衣芽胞杆菌菌株，经过分离鉴定、益生性能检测、安全性评价
和抗逆性能的鉴定，表明本发明可以作为肉犊牛饲料添加剂促生长应用。

背景技术

[0002] 全球碳循环的一个关键步骤是水解植物细胞壁中的纤维素，纤维素是陆地上最丰富的碳源(Malhi 2003，David 2011)。纤维素资源的合理利用，能够缓解污染、解决全球能
源危机以及动物饲料资源紧张等世界性难题。微生物能够水解纤维素生成还原糖(纤维二
糖、葡萄糖等)(Vu 2012)，可提高饲料利用率、降低饲料成本、提高畜禽生产力、具有广阔的
开发前景。

[0003] 在畜牧业和饲料工业中，为了解决能量饲料短缺的问题，人们高度重视产纤维素酶和木质素酶的微生物分离筛选及纤维素酶、木质素酶的应用。纤维素分解菌被称为动物
肠道微生物的“关键物种”(苏少锋2019)。McBee等研究显示反刍动物80％以上的纤维素消
化依靠瘤胃内的微生物，且饲用微生物能够提高纤维利用率(McBee 1971)。Sun等报道，饲
喂枯草芽胞杆菌后，荷斯坦奶牛瘤胃中纤维素的消化作用提高，显著提高了犊牛断奶前的
日增重(Sun 2010)。

[0004] 肉牛饲料中粗饲料占据较大比重，但粗饲料中富含难以被消化利用的纤维素、木质素，造成资源的浪费。水牛与肉牛同属于反刍动物，均以瘤胃作为主要的饲料发酵场所，
而水牛较肉牛更耐粗饲。有理由推测：水牛的耐粗饲性与其独特的胃肠道微生物密切相关。

[0005] 目前尚未见到从水牛瘤胃中分离筛选出降解纤维素、木质素等活性强的菌株，也未见到一株兼备纤维素和木质素降解能力、对肉牛具有显著促生长作用的副地衣芽胞杆菌
的报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对粗饲料中木质素、纤维素不易被降解的技术壁垒，分离筛选一株安全、降解木质素、纤维素能力强的益生菌，利用微生物菌剂
提高肉牛对粗饲料的利用率，提高生产率且安全、高效、环保。经16S rDNA鉴定，本发明分离
得到的益生菌株为副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)，本发明对其产酶(纤
维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶)活性、安全性、益生性及作为肉牛饲料添加剂促生长的
效果进行了相关验证。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 本发明根据筛选目标和益生菌产特定酶性能为标准，从抗粗饲强的水牛瘤胃中，分离筛选得到一株候选菌株，发明人经过鉴定，将所得的候选菌株命名为副地衣芽胞杆菌
SN‑6，Bacillus paralicheniformis SN‑6，于2020年05月21日送到中国.武汉.武汉大学内
的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2020136。

[0009] 副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)SN‑6菌株的菌学特性：

[0010] 副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)SN‑6菌株为革兰氏阳性，呈单在、成双或链状排列的短杆菌，能形成芽胞。在以羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)为唯一碳源平板
上，长成白色、光滑、周边整齐、直径5mm左右的菌落(见图1A)，经刚果红染色，菌落周围产生
淡黄色水解圈(见图1B)。在木质素磺酸钠为唯一碳源平板上点种，可长成直径3cm左右的白
色菌苔(见图2)。在马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)‑愈创木酚上生长，菌
落周围产生红棕色氧化圈(见图3)。克隆其16S rRNA基因并进行测序，在NCBI进行Blast比
较，发现本发明的候选菌株16S rDNA序列与副地衣芽胞杆菌(MK517555.1)的同源性最高，
为99.65％。

[0011] 副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的繁殖能力较强，0‑4h处于迟缓期，4h后进入对数生长期，持续到8h后进入稳定期。副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株产芽胞，具有很好的稳定性。耐受人
工胃液和肠液，在pH 3的人工胃液中孵育3h，存活率为36.36％。在中性人工肠液中孵育4h，
存活率为54.29％。表明该菌株具有良好的耐受性，有利于制备成微生态制剂以及作为饲料
添加剂应用于生产。

[0012] 副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株在以羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)为唯一碳源的平板上长出的菌落，经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图1B)，说明该菌株能够水解纤维
素，外分泌纤维素酶。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)‑愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧
化圈(见图3)，提示该菌株产漆酶。在含有1％可溶性淀粉的LB平板上生长，经革兰氏碘液染
色，菌落周围形成白色褪色圈，说明该菌株产淀粉酶(见图5)，可提高能量物质淀粉的消化
利用率。

[0013] 副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99具有明显的抑菌活性(见图7)。对常用兽药如青霉素、头胞氨苄、诺氟沙星、四环素、万古霉素、氯霉素、呋喃唑酮、
复方新诺明敏感，而对头胞呋辛表现中度敏感；对苯唑西林表现耐药。用PCR方法检测毒力
基因，发现该菌株不含相关毒力基因(见图9)。小鼠饲喂试验表明，试验组小鼠与空白组相
比未见异常。表明该菌株具有良好的安全性。

[0014] 申请人将本发明的SN‑6菌株通过液体发酵方式制备成微生态制剂，用作饲料添加剂，进行了肉牛饲养试验，对肉犊牛有明显的促进生长的作用，达到了预期的效果，从而完
成了本发明的任务。

[0015] 本发明的副地衣芽胞杆菌具有如下优点：

[0016] (1)从耐粗饲的水牛瘤胃中分离的副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株降解粗纤维能力更强，提高肉牛日粮利用率的效果显著。

[0017] (2)本发明SN‑6菌株繁殖能力较强，产芽胞，稳定性强；可耐受人工胃液、肠液，在pH为3的人工胃液孵育3h，存活率为36.36％；在中性的人工肠液孵育4h，存活率为54.29％，
有利于制备成微生态制剂及作为饲料添加剂应用于生产。

[0018] (3)本发明对SN‑6菌株用分子生物学的方法及小鼠饲喂试验进行了安全性淘选，安全性更高。

[0019] (4)动物试验证明，本发明的微生态制剂对肉犊牛具有显著的促生长作用，达到了本发明最终目的。

[0020] 更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。

附图说明

[0021] 图1：是本发明分离筛选的副地衣芽胞杆菌菌株SN‑6在CMC‑Na琼脂平板上的生长状态和利用刚果红染色经生理盐水脱色后的结果。附图标记说明：图1中的图1A是本发明分
离筛选的副地衣芽胞杆菌菌株SN‑6在CMC‑Na琼脂平板上的生长状态。图1中的图1B图是刚
果红染色后经生理盐水脱色后的结果，图中显示SN‑6的菌落周围出现淡黄色水解圈。

[0022] 图2：副地衣芽胞杆菌SN‑6在木质素唯一碳源平板上的生长情况。

[0023] 图3：副地衣芽胞杆菌SN‑6在PDA‑愈创木酚平板上的生长情况。

[0024] 图4：是本发明分离筛选的副地衣芽胞杆菌SN‑6革兰氏染色结果(×1000)。

[0025] 图5：是本发明菌株SN‑6产淀粉酶检测结果。

[0026] 图6：是本发明菌株SN‑6产蛋白酶检测结果。

[0027] 图7：是本发明菌株SN‑6发酵液上清体外抑菌结果。附图标记说明：图7抑菌圈的标记6是本发明分离的SN‑6菌株。从左至右，从上至下所用的指示菌株依次为：大肠杆菌O157、
O139、K88、K99，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。

[0028] 图8：是毒力基因阳性菌株蜡样芽胞杆菌毒力因子PCR检测结果。附图标记说明：图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：nheA；泳道2：nheB；泳道3：nheC；泳道4：entFM；
泳道5：阴性对照。

[0029] 图9：是本发明菌株SN‑6相应毒力基因检测的胶图。附图标记说明：图9A：本发明菌株SN‑6毒力基因nheA PCR电泳图。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室
保存SN‑20菌株；泳道2：本发明菌株SN‑6；泳道3：本实验室保存SN‑4菌株：泳道4：本实验室
保存SN‑3菌株；泳道5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。图9B：本发明菌株SN‑6毒力基因
nheB PCR电泳图。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN‑20菌株；
泳道2：本发明菌株SN‑6；泳道3：本实验室保存SN‑4菌株：泳道4：本实验室保存SN‑3菌株；泳
道5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。图9C：本发明菌株SN‑6毒力基因nheC PCR电泳图。图
中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN‑20菌株；泳道2：本发明菌株
SN‑6；泳道3：本实验室保存SN‑4菌株：泳道4：本实验室保存SN‑3菌株；泳道5：阳性对照菌
株；泳道6：阴性对照。图9D：本发明菌株SN‑6毒力基因entFM电泳图。图中各泳道：M:DL2000 
DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN‑20菌株；泳道2：本发明菌株SN‑6；泳道3：本实验室
保存菌株SN‑4：泳道4：本实验室保存SN‑3菌株；泳道5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。

[0030] 图10：是本发明菌株副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的生长曲线。具体实施方案

[0031] 对序列表的说明：

[0032] 序列表SEQ ID NO：1是本发明分离株副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的16S rRNA基因部分序列。

[0033] 实施例1：副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的分离、鉴定

[0034] 一、菌株分离

[0035] 样品取自荆门市沙洋县湖北劲牛牧业有限公司装有瘤胃瘘管的健康水牛瘤胃，取瘤胃内容物经纱布过滤，收集滤液于厌氧袋，置于39℃(车载小型恒温箱)。取1mL采集的样
‑1 ‑6 ‑4 ‑5
品进行10 ‑10 梯度稀释(100μL培养液加入900μL灭菌水中进行梯度稀释)，取10 、10 、
‑6
10 三个稀释度培养液涂布CMC‑Na唯一碳源平板，平板置于39℃厌氧箱中培养3d后挑取单
菌落，点样到CMC‑Na唯一碳源平板，置于39℃厌氧箱中培养3d，随后用0.1％刚果红染色液
染色10‑15min，再用1.0mol/L NaCl溶液洗涤2次，观察是否产生淡黄色水解圈(张超2007)，
挑取产生水解圈的菌株进行纯培养。将纯培养菌株接种在木质素磺酸钠唯一碳源平板、
PDA‑愈创木酚平板进行依次筛选。该发明的菌株在CMC‑Na为唯一碳源平板上长成白色、光
滑、周边整齐、直径5mm左右的菌落，见图1A；经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈，
(见图1B)；在木质素磺酸钠为唯一碳源平板上长成直径3cm左右的白色菌落，见图2。在PDA‑
愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧化圈(见图3)；革兰染色呈阳性，短杆状，单个、成
双或链状排列(见图4)。

[0036] 二、菌株种属鉴定

[0037] 在上述鉴定的基础上，进一步对本发明的副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株进行16S rRNA基因序列检测，对副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株所属的种进行确证鉴定，具体步骤如下：

[0038] (一)目标菌株基因组提取：

[0039] (1)取1mL培养菌液，10000rpm离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

[0040] (2)加入200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清。

[0041] (3)加入120μL溶菌酶(20mg/mL in 10mM Tris‑HCl，pH 8.0)颠倒混匀，37℃温育30‑60min。12000rpm离心2min，弃上清后吹打重悬于180μL缓冲液RB中。

[0042] (4)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立即涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。

[0043] (5)冷却后加入100μL异丙醇，立即涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

[0044] (6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30‑60s，倒掉收集管中的废液。

[0045] (7)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

[0046] (8)加入700μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液。

[0047] (9)加入500μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液。

[0048] (10)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

[0049] (11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在67‑70℃水浴中预热)，室温放置3‑5min，12000rpm离心1min。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

[0050] (12)将DNA样品贮存于‑20℃贮存备用。

[0051] (二)16S rRNA基因的扩增：

[0052] 应用细菌通用引物扩增分离株副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株16S rRNA序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物的DNA序列如下：

[0053] 正向引物27F：5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3，

[0054] 反向引物1492R：5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3'；

[0055] PCR扩增体系见表1，扩增条件：94℃预变性5min，94℃1min，50℃30s，72℃1.5min，30个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳
检测，扩增的片段大小与预期相符，约1500bp。

[0056] 表1副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株PCR扩增体系

[0057]

[0058]

[0059] (三)构建细菌进化树确定种属：

[0060] 提取细菌基因组DNA送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast，用MEGA7.0软件通过邻接法(Neighbor‑Joining)构建细菌系统进化
树，分析结果显示菌株SN‑6为副地衣芽胞杆菌。

[0061] 实施例2：副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的益生特性检测

[0062] 一、产酶试验

[0063] (一)产淀粉酶活性检测

[0064] 将副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株点接在含有1％可溶性淀粉的LB平板上，放入37℃培养箱培养48h；向反应好的淀粉培养基中加入2mL碘液，轻旋至碘液均匀覆盖平板，静置
10min，淀粉遇碘变蓝，若产生淀粉酶，菌落周围淀粉就会分解，碘液染色的蓝紫色平板上会
出现褪色圈，染色结果如图5所示，副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株产淀粉酶活性检测结果见表2。

[0065] 表2副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株产淀粉酶的检测结果

[0066]

[0067] (二)产蛋白酶活性检测

[0068] 将副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株点接在以牛奶为唯一碳源平板上，放入37℃培养箱培养48h，若产生蛋白酶，菌落周围蛋白就会分解，平板上会出现透明圈，结果如图6所示，菌株
产蛋白酶活性检测结果见表3。

[0069] 表3副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株产蛋白酶检测结果

[0070]

[0071] 二、副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的抑菌活性试验

[0072] 以大肠杆菌O157、O139、K88、K99，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌为指示菌，以本发明菌株的发酵液上清为抑菌剂，检测菌株的体外抑菌活性，具体操作步骤如下：

[0073] (1)指示菌(大肠杆菌O157、O139、K88、K99，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌)悬液的准备：指示菌菌种平板划线，36℃培养20h；挑取单菌落于LB液体培养基，置37℃振荡培养16h，
7
复苏指示菌。将培养好的指示菌菌液调整到细菌数为1.0×10 CFU/mL。(注：在稀释过程中
需用0.01mol/L PBS进行稀释)

[0074] (2)细菌发酵液的制备和处理：将本发明菌株平板画线，37℃培养16h。挑取分离菌株于50mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养24h后作为种子液。将种子液以1％
的接种量接种到100mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养48h作为发酵液。将制
备好的发酵液10000r/min条件下离心5min，取离心后的上清液用0.22μm无菌过滤器过滤后
备用。

[0075] (3)抑菌试验：取100μL指示菌菌悬液，滴于LB平板上，涂布棒涂布均匀，直至无可见水滴，再用无菌镊子取灭菌牛津杯，轻轻放于LB固体培养基表面，每个培养基上均匀放置
3只牛津杯。用微量移液器吸取菌株发酵液上清各200μL，注入到放置平稳的牛津杯内(小心
加入，切勿滴洒牛津杯之外的培养基上)；再用灭菌陶瓷盖换掉原来的玻璃平皿盖(以吸取
培养基在后面试验过程中所蒸腾出的水分)。

[0076] (4)培养：将上述加有上清液的培养基放置4℃冰箱8h，然后再将扩散处理完全后的平皿放入37℃的恒温培养箱内，培养16h～24h后，观察并记录试验结果。

[0077] 试验结果表明本发明菌株对致病菌的抑制能力较弱，其中SN‑6对K99、金黄色葡萄球菌的抑制能力较强，结果见图7和表4。

[0078] 表4菌株发酵上清液体外抑菌试验

[0079]

[0080] 实施例3：副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的安全性评价

[0081] 一、药敏试验

[0082] 选取青霉素类、头胞类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类等15种药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限公司)进行药敏试验。试验判断标准参照世界卫生组织(WHO)提
供的NCCLS最新版本的标准进行(2018版)。具体步骤如下：

[0083] (1)菌液以1％的量接入LB液体培养基中，37℃200rpm/min摇床过夜培养。

[0084] (2)以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0.5麦氏标准比浊管浊度。若菌液浓度太浓时，可用生理盐水稀释。

[0085] (3)用灭菌棉签蘸取菌液，抵在管壁上挤去多余的菌液后涂布于LB琼脂平板上，每次将平板旋转60度，最后涂布平板内侧边缘两圈，反复几次，保证涂均匀。

[0086] (4)待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子夹取药敏纸片贴在平板表面，纸片一旦贴上就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距
平皿边缘不少于15mm。

[0087] (5)平板放置于37℃恒温培养箱培养12‑16h观察结果。

[0088] 试验结果见表5。本发明的副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株对常用兽药如青霉素、头胞氨苄、诺氟沙星、四环素、万古霉素、氯霉素、呋喃唑酮和复方新诺明敏感，对头胞呋辛表现中
度敏感，对苯唑西林表现耐药。

[0089] 表5副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株的抗生素敏感性试验结果

[0090]

[0091]

[0092] 注：S表示敏感，M表示中敏，R表示耐药。

[0093] 二、毒力基因检测试验

[0094] 以含非溶血性肠毒素Nhe基因(nheA、nheB、nheC)及肠毒素FM基因entFM的蜡样芽胞杆菌作为阳性对照菌株，进行目标菌株相关毒力基因的检测。

[0095] 分别以前述制备的目标菌株的基因组为模板，以各毒力基因的特异引物进行PCR扩增，各引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR反应条件为94℃3min；95℃
30s，58℃30s，72℃33s，35个循环；72℃10min(Rowan 2003)。毒力基因引物序列、预期PCR产
物大小见表6，毒力基因PCR扩增体系见表7。

[0096] 表6毒力基因PCR扩增引物序列

[0097]

[0098] 表7毒力基因PCR扩增体系

[0099]

[0100]

[0101] 注：阴性对照孔DNA模板用2μL ddH2O代替。

[0102] 取PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照。电泳结果显示：阳性菌株扩增出4种毒力基因nheA、nheB、nheC和entFM，扩增出来
的片段大小均与预期一致，结果见图8；菌株SN‑6未检测到肠毒素相关毒力基因，结果见图
9。

[0103] 三、小鼠安全饲喂试验

[0104] 选用三周龄昆明小鼠(雌雄各半)进行本发明菌株安全饲喂试验，试验时间为2天预饲适应期加2周的正式试验期。按照体重进行分组，每组2笼，每笼5只；试验组小鼠分别灌
8
胃目标菌液(生理盐水重悬稀释)200μL/只/天，菌数量达2‑5×10 ，空白对照组用等体积的
生理盐水灌胃，每2天进行称重，每天观察记录小鼠精神状态及健康状况。

[0105] 结果分析：观察小鼠毛色、精神状态，剖检观察小鼠内脏器官，结果与空白组相比，发现目标菌株饲喂的试验组小鼠与对照组均正常。

[0106] 上述药敏试验、毒力基因检测、小鼠饲喂试验等结果，一起证明了副地衣芽胞杆菌SN‑6是安全的。

[0107] 实施例4：益生菌株SN‑6的抗逆特性及生长特性

[0108] 一、抗逆性试验

[0109] (一)耐人工胃液试验

[0110] (1)制备人工胃液：参考《中国药典》2015配制人工胃液，准确量取质量浓度为100g/L的盐酸16.4mL，加蒸馏水稀释，调节pH值为3.0，然后加入胃蛋白酶(加入量按照1g/
100mL的质量浓度比计算)，充分溶解后，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得人工胃液备
用；

[0111] (2)制备菌液：用无菌接种环挑取少量分离保存的菌株于LB琼脂平板上划线，37℃温箱培养24h，挑取单一菌落，接种到LB液体培养基中，37℃培养至细菌对数生长期，平板计
9
数，菌液浓度为2.4×10CFU/mL，待用。

[0112] (3)菌液按体积分数1％的接种量接种到pH值为3.0的人工胃液中混匀，37℃、200r/min摇床培养，于3h后取样，计算存活率。

[0113] (二)耐人工肠液试验

[0114] (1)制备人工肠液：参考《中国药典》2015配制人工肠液，称取磷酸二氢钾KH2PO4 3.4g，加蒸馏水250mL溶解，用0.4g/100mL的NaOH溶液调节pH值至7.0，加水稀释至500mL，然
后按照1g/100mL的质量浓度比加入胰蛋白酶，充分溶解后，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除
菌，制得人工肠液备用；

[0115] (2)制备菌液：用无菌接种环挑取少量分离保存的菌株于LB琼脂平板上划线，37℃温箱培养24h，挑取单一菌落，接种到LB液体培养基中，37℃培养至细菌对数生长期，平板计
9
数，菌液浓度为2.4×10CFU/mL，待用。

[0116] (3)菌液按体积分数1％的接种量接种到pH值为7.0的人工肠液中混匀，37℃、200r/min摇床培养，于4h后取样，计算存活率。

[0117] 菌株耐人工胃液/肠液存活率按照如下公式计算：存活率(％)＝处理后的活菌数/未处理活菌数×100；结果见表8。

[0118] 表8菌株耐人工胃液/肠液检测结果

[0119]

[0120] 二、生长曲线的测定

[0121] (1)种子液的制备：挑取单菌落接种至3mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养24h，得到种子液；

[0122] (2)发酵液的制备：将种子液按1％的接种量接种至100mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养24h，得到发酵液；

[0123] (3)生长曲线的测定：将发酵液以1％的接种量接种至50mL的LB液体培养基中，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h时将细菌悬液取出，测其在OD600下的吸光
值。10倍梯度稀释后用倾注法测各菌株的生长曲线，每组试验做三个重复。以培养时间为横
坐标，OD600值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

[0124] 试验表明，本发明分离的菌株繁殖能力较强，0‑4h处于迟缓期，4h进入对数生长期持续到10h，10h后进入稳定期。该菌株繁殖能力很强，有利于工业化的大规模发酵生产，其
生长曲线见图10。

[0125] 实施例5：肉牛饲喂试验

[0126] 将本发明的益生菌株SN‑6制备成微生态制剂饲喂消化粗纤维较多的动物(牛)，具体是肉犊牛，目的是验证本发明的益生菌株对肉牛的促生长作用。

[0127] 一、试验动物与分组

[0128] 选取遗传背景一致的西门塔尔肉犊牛作为试验动物，试验开始前，对牛只按照体重进行一一配对，共计9对。每对对子之间的两头牛随机分到空白对照组和试验组。以栏为
单位进行圈养，每栏9头，试验期为33天。菌株SN‑6通过液体发酵制备成菌粉，活菌数达66.7
亿CFU/g，基础日粮包括玉米秸秆青贮料、精料补充料、酒糟和麦秸，精料补充料购自于湖北
省荆门市荆门龙谷饲料有限公司。

[0129] 二、试验过程

[0130] 肉牛饲喂试验在湖北省襄阳市襄州区石桥镇湖北良友金牛畜牧科技有限公司进行，饲喂具体时间为2020年5月22日开始到2020年6月24日结束，共33天。试验期间牛只自由
饮水和采食，每天喂料2次(为上午6:30，下午16:00)，上午青贮料和精料补充料混合饲喂，
下午只饲喂麦秸，饲料及菌粉饲喂量按照体重相应增减(以体重500斤的肉牛为例，每天饲
10
喂全价料20斤，菌粉按照每头牛每天7.5g添加，总菌量为5.0×10 /d/头)，菌粉溶于水中饲
喂肉牛。

[0131] 三、测定指标

[0132] 通过体重变化检验本发明的副地衣芽胞杆菌对肉牛生长的影响，在益生菌饲喂前空腹进行首次称重，在试验结束时空腹称重一次，计算平均日增重。

[0133] 四、结果分析

[0134] 由表9结果显示，经过33天的试验，空白对照组平均日增重为1.24kg，试验组平均日增重为1.37kg，平均日增重：试验组>空白对照组；与空白对照组相比，试验组平均日增重
差异显著(P<0.05)。

[0135] 表9肉牛生长性能比较

[0136]

[0137] 在整个试验期中，空白组相对增重率为25.36％，试验组相对增重率为27.93％。益生菌株的添加使得试验组相对日增重较空白组提高10.82％，说明日粮中添加本发明的益
生菌株SN‑6对于提高肉牛生长性能作用显著。

[0138] 参考文献

[0139] 1 MalhiYadvinder.Carbon in the atmosphere and terrestrial biosphere in the 21st century.[J].Philosophical Transactions of the Royal Society A:
Mathematical,Physical and Engineering Sciences,2003,360(1801).

[0140] 2 David B Wilson.Microbial diversity of cellulose hydrolysis[J].Current Opinion in Microbiology,2011,14(3).

[0141] 3 Vu Van Hanh,KimKeun.Improvement of cellulase activity using error‑prone rolling circle amplificationandsite‑directedmutagenesis.[J].Journal of 
Microbiology and Biotechnology,2012,22(5).

[0142] 4 苏少锋.蒙古马胃肠道细菌群落组成及纤维素分解菌的研究[D].内蒙古农业大学,2019.

[0143] 5 Richard H.McBee.Significance of Intestinal Microflora in Herbivory[J].Annual Reviews Inc.,1971,2.

[0144] 6 SUN P,WANG J Q,ZHANG H T.Effects of Bacillus subtilis natto on performance and immune function of preweaning calves[J].Journal of Dairy 
Science,2010；93(12):5851‑5855.

[0145] 7 张超,李艳宾,张磊,张琴,魏世清.纤维素―刚果红培养基鉴定产纤维素酶真菌的机理研究[J].纤维素科学与技术,2007(02):39‑44.

[0146] 8 NEIL J.ROWAN G C C G.Production of Diarrheal Enterotoxins and Other Potential Virulence Factors by Veterinary Isolates of Bacillus Species 
Associated with Nongastrointestinal Infections[J].APPLIED AND ENVIRONMENTAL 
MICROBIOLOGY,2003,69:2372‑2376.

[0147] 9 M.A.RATHER R S A J.Direct Detection of Bacillus cereus and its Enterotoxigenic Genes in Meat and Meat Products by Polymerase Chain Reaction
[J].Journal of Advanced Veterinary Research,2011,1:99‑104.

[0148] 10 HENDRIKSEN B M H A.Detection of Enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains by PCR Analysis[J].APPLIED AND ENVIRONMENTAL 
MICROBIOLOGY,2001,67:185‑189.

[0149] 11 NGAMWONGSATIT P,BUASRI W,PIANARIYANON P,et al.Broad distribution of  enterotoxin genes(hblCDA,nheABC,cytK,and entFM)among  Bacillus 
thuringiensis and Bacillus cereus as shown by novel primers[J].International 
Journal of Food Microbiology,2008,121(3):352‑356.

[0150] 12 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015。