粪便核酸提取试剂盒

摘要

本发明提供一种粪便核酸提取试剂盒，包括以下成分：裂解液、结合液、磁珠悬液、洗涤液A、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液、蛋白酶K、溶液A。本发明从100mg‑1g粪便样本提取总DNA，提取量＞2μg。本发明可用于手动操作，亦可采用设备自动化操作。提取的DNA可用于下游检测，包括幽门螺旋杆菌检测，结直肠癌检测等。

权利要求

1.粪便核酸提取试剂盒，其特征在于，所述粪便核酸提取试剂盒包括以下成分：裂解液、结合液、磁珠悬液、洗涤液A、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液、蛋白酶K、溶液A；

所述裂解液是20mM的Tris‑HCl，pH8.0，含2M GuSCN，1MNaCl，0.5％肌氨酸钠，0.1‑5％PVP，0.1‑5％CTAB，10mM EDTA；

所述结合液是4M GuHCl+3‑15％PEG8000，pH5.8；

所述磁珠悬液为50mg/ml的二氧化硅表面磁珠；

所述洗涤液A是3.5M GuSCN+0.5M NaCl+2％PEG8000+5％IPA+10mM EDTA+20mM Tris‑HCl，pH6.2；

所述洗涤液B是1M GuHCl+0.5M NaCl+1.5％Tween‑20，加50％IPA；

所述洗涤液C是10mM Tris‑HCl，加4倍体积无水乙醇，pH8.0；

所述洗脱液是10mM Tris‑HCl，pH 8.0；

所述溶液A是5mM Tris‑HCl，pH 8.0，含1.5mM氯化钙。

说明书

粪便核酸提取试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及化学检测领域，尤其是一种粪便核酸提取试剂盒。

背景技术

[0002] 粪便总DNA提取试剂盒(磁珠法)适用于从粪便样本中快速、高效地提取人和肠道菌群基因组DNA。提取过程采用超顺磁性微球，使用预制的缓冲液可对样本进行直接提取，且可根据加入的样本量来调整反应体系。

[0003] 传统的提取方法包括氯仿抽提法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB法)、离心吸附柱试剂盒法，其中氯仿抽提和CTAB法由于涉及的步骤繁琐、耗费的时间长、核酸得率低等问题渐渐被淘汰。目前被市场接受的方法是离心吸附柱法，但该方法不能进行高通量的操作。

发明内容

[0004] 为解决上述问题，本发明提供一种粪便核酸提取试剂盒。本发明既可以进行手动操作，也适合于用自动化工作站进行高通量操作，提取的产物可用于PCR扩增、测序等后续实验。

[0005] 为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

[0006] 粪便核酸提取试剂盒，包括以下成分：裂解液、结合液、磁珠悬液、洗涤液A、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液、蛋白酶K、溶液A。

[0007] 其中，所述裂解液是20mM Tris‑HCl，pH8.0，所述裂解液含2M GuSCN，1M NaCl，0.5％肌氨酸钠，0.1‑5％PVP，0.1‑5％CTAB，10mM EDTA。

[0008] 其中，所述结合液是4M GuHCl+3‑15％PEG8000，pH5.8。

[0009] 其中，所述磁珠悬液为50mg/ml的二氧化硅表面磁珠。

[0010] 其中，所述洗涤液A是3.5M GuSCN+0.5M NaCl+2％PEG8000+5％IPA+10mM EDTA+20mM Tris‑HCl，pH6.2。

[0011] 其中，所述洗涤液B是1M GuHCl+0.5M NaCl+1.5％Tween‑20，加50％IPA。

[0012] 其中，所述洗涤液C是10mM Tris‑HCl，加4倍体积无水乙醇，pH8.0。

[0013] 其中，所述洗脱液是10mM Tris‑HCl，pH 8.0。

[0014] 其中，所述溶液A是5mM Tris‑HCl，pH 8.0，含1.5mM氯化钙。

[0015] 本发明中所用试剂名称解释如下：

[0016] GuSCN：异硫氰酸胍

[0017] PVP：聚乙烯吡咯烷酮

[0018] CTAB：十六烷基三甲基溴化铵

[0019] GuHCl：盐酸胍

[0020] EDTA：乙二胺四乙酸

[0021] PEG8000：聚乙二醇8000

[0022] IPA：异丙醇

[0023] 本发明采用磁珠法提取核酸，裂解缓冲液根据磁珠法进行匹配，本发明还可以用于自动化操作，操作简便，核酸得率高。

附图说明

[0024] 图1是实施例1的提取结果。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

[0026] 粪便核酸提取试剂盒，包括以下成分：裂解液、结合液、磁珠悬液、洗涤液A、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液、蛋白酶K、溶液A。

[0027] 其中，所述裂解液是20mM Tris‑HCl，pH8.0，含2M GuSCN，1M NaCl，0.5％肌氨酸钠，0.1‑5％PVP，0.1‑5％CTAB，10mM EDTA。

[0028] 其中，所述结合液是4M GuHCl，3‑15％PEG8000，pH5.8。

[0029] 其中，所述磁珠悬液为50mg/ml的二氧化硅表面磁珠。

[0030] 其中，所述洗涤液A是3.5M GuSCN+0.5M NaCl+2％PEG8000+5％IPA+10mM EDTA+20mM Tris‑HCl，pH6.2。

[0031] 其中，所述洗涤液B是1M GuHCl+0.5M NaCl+1.5％Tween‑20，加50％IPA。

[0032] 其中，所述洗涤液C是10mM Tris‑HCl，加4倍体积无水乙醇，pH8.0。

[0033] 其中，所述洗脱液是10mM Tris‑HCl，pH 8.0。

[0034] 其中，所述溶液A是5mM Tris‑HCl，pH 8.0，含1.5mM氯化钙。

[0035] 实施例1 粪便总DNA提取

[0036] 粪便核酸提取试剂盒，组成及保存、使用方法如下：

[0037]

[0038] 1.样本采集

[0039] (1)用刀片切取180mg～220mg粪便样本到2mL离心管中。

[0040] 2.裂解

[0041] (1)在上述2mL离心管中加入600μL的裂解液(①用前65℃水浴5～10min)，再加入20μL的蛋白酶K(⑧)〔检查是否已加入溶液A(⑨)〕，调整合适的转速漩涡振荡1min，使其充分混合，再将离心管置于70℃加热20min，90℃加热10min，期间震荡混匀三次。

[0042] (2)13000rpm离心3min，取300μL上清至一个新的1.5mL EP管中。(若为1g粪便样本体系，取上清1.5mL至新的15mL EP管中)

[0043] 3.结合

[0044] 在上述1.5mL离心管中加入300μL结合液(②)，200μL异丙醇，20μL磁珠悬液(③)，震荡混匀30s，室温结合5min，期间颠倒混匀两次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

[0045] 注：此步骤磁性分离时间应不少于2min。

[0046] 4.洗涤

[0047] (1)加入800μL洗涤液A(④)，震荡混匀30s，室温下静置1min，期间上下颠倒混匀一次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

[0048] (2)加入800μL洗涤液B(⑤)(检查是否已加入异丙醇)，震荡混匀30s，室温下静置1min，期间上下颠倒混匀一次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

[0049] (3)加入800μL洗涤液C(⑥)(检查是否已加入无水乙醇)，震荡混匀30s，室温下静置1min，期间上下颠倒混匀一次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

[0050] (4)重复步骤(3)一次(若为1g粪便样本体系，该步仅加入1mL洗涤液C，震动混匀后转移至1.5mLEP管中)。

[0051] 注：步骤(4)应尽量除尽洗涤液。

[0052] 5.干燥

[0053] 保持离心管于磁力架上，将其置于超净工作台中风干至磁珠表面无明显光泽(5～7min)。

[0054] 6.洗脱

[0055] 加入50μL 65℃预热的洗脱液(⑦)，震荡混匀30s，于65℃加热5min后，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的基因组DNA，可保存于‑20℃。

[0056] 提取结果见图1，可见采用本发明提取粪便中基因组DNA的得率高于同类试剂盒。

[0057] 本发明从100mg‑1g粪便样本提取总DNA，提取量＞2μg。本发明可用于手动操作，亦可采用设备自动化操作。提取的DNA可用于下游检测，包括幽门螺旋杆菌检测，结直肠癌检测等。

[0058] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明的内容作为等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。