检测基因甲基化水平的传感器及其制备、检测方法转让专利
申请号 : CN202010884105.3
文献号 : CN112014446B
文献日 : 2021-11-02
发明人 : 王芳 , 杨红梅 , 陈子林
申请人 : 武汉大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器,其特征在于:所述电化学传感器以玻碳电极为基底电极,以金纳米粒子为电极修饰材料经修饰得到修饰电极,利用末端标记策略使待测基因的5'端修饰上巯基,通过共价键相互作用使待测基因直接固定在修饰电极表面,利用抗体与抗原的相互作用,使识别待测基因中甲基化位点的特异性抗体结合到待测基因的甲基化位点,再通过一抗和二抗的相互作用,使标记有HRP的二抗结合到特异性抗体上,HRP催化过氧化氢和对苯二酚的氧化还原反应,产生信号,实现对待测基因甲基化水平的检测。
2.一种权利要求1所述的基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤1:采用末端标记策略在待测甲基化基因的5'端修饰上巯基;
步骤2:玻碳电极用0.05μm的氧化铝抛光粉抛光后,分别用乙醇、水超声清洗,然后氮气吹干;将处理好的玻碳电极浸入氯金酸溶液中,采用恒电位法电沉积金纳米粒子在玻碳电极表面;超纯水冲洗晾干后,得到金纳米粒子修饰的玻碳电极;
步骤3:将步骤1得到的巯基化修饰的待测甲基化基因滴涂到步骤2得到的金纳米粒子修饰的电极表面,过夜孵育;PBS溶液清洗后,滴加MCH溶液,封闭1h,接着再滴加BSA溶液孵育半小时;冲洗后,滴加抗体溶液在37℃下孵育1h,再滴加标记有HRP的二抗溶液在37℃下孵育1h;PBS冲洗晾干后,即得电化学传感器。
3.如权利要求2所述的基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器的制备方法,其特征在于:所述步骤1具体包括:将T4多聚核苷酸激酶、腺苷5'‑[γ‑硫代]三磷酸盐及待测甲基化基因溶于70mM的Tris‑HCl缓冲液中,过夜反应;其中,所述Tris‑HCl缓冲液pH为7.6,且含有10mM MgCl2和5mM DTT。
4.如权利要求2所述的基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器的制备方法,其特征在于:所述步骤2中,氯金酸溶液浓度为3mM,恒电位为‑0.2V。
5.如权利要求2所述的基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器的制备–12 ‑7
方法,其特征在于:所述步骤3中,待测甲基化基因浓度为10 ~10 M。
6.一种权利要求2所述方法制备的基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器的检测方法,其特征在于:将所述电化学传感器置于含有过氧化氢和对苯二酚的磷酸盐缓冲液中,采用差分脉冲伏安法进行检测。
说明书 :
检测基因甲基化水平的传感器及其制备、检测方法
技术领域
背景技术
的调节过程中扮演着重要的角色,异常的基因甲基化通常与多种基因疾病以及肿瘤的产生
有很大关系。因此,有效检测基因甲基化水平对于早期肿瘤的诊断、遗传信息控制机理的研
究等具有重要的意义。
获识别。通过这种方式制备的电化学传感器有一个弊端,就是难以应用到实际基因组中进
行检测。因为公司合成的DNA探针均为固定的碱基序列,这决定了该探针只能捕获与它碱基
序列互补的基因链。然而,在实际基因组中,甲基化基因的碱基序列有多种多样,这就限制
了电化学传感器在基因甲基化检测中的应用。因此,亟需一种不使用DNA探针,不受基因碱
基序列影响的电化学传感器。
发明内容
宽、重复性高的优点,在临床研究和实际应用中具有很大的潜力。
修饰电极,利用末端标记策略使待测基因的5'端修饰上巯基,通过共价键相互作用使待测
基因直接固定在修饰电极表面,然后利用抗体与抗原的相互作用,使识别待测基因中甲基
化位点的特异性抗体结合到待测基因的甲基化位点,再通过一抗和二抗的相互作用,使标
记有HRP的二抗结合到特异性抗体上, HRP催化过氧化氢和对苯二酚的氧化还原反应,产生
信号,实现对待测基因甲基化水平的检测。
碳电极表面;超纯水冲洗晾干后,得到金纳米粒子修饰的玻碳电极;
液孵育半小时;冲洗后,滴加抗体溶液在37℃下孵育 1h,再滴加标记有HRP的二抗溶液在37
℃下孵育1h;PBS冲洗晾干后,即得电化学传感器。
过夜反应。
用差分脉冲伏安法进行检测。
基因可以直接固定到修饰了金纳米粒子的玻碳电极表面,不需要经过DNA探针的捕获过程,
基因甲基化水平的检测也不受碱基序列的影响。此外,抗体对待测基因中甲基化位点的特
异性识别结合,可以实现特定碱基甲基化的针对性检测,极大地提高了传感器的选择性。金
纳米粒子和HRP在传感器制备中的应用,不仅放大了信号,还提高了传感器的灵敏度。该电
化学传感器具有宽的检测范围、高的重复性,在临床研究和实际应用中具有很大的潜力。
附图说明
d为空白;
具体实施方式
中,过夜反应;
育2h;离心收集沉淀,用70%乙醇清洗,空气晾干后加入一级水得到提纯后的巯基化修饰的
待测甲基化基因。
及其检测DNA中6mA修饰水平的示意图。首先,玻碳电极打磨清洗好后,将金纳米粒子在‑
0.2V的恒电位下电沉积在玻碳电极表面,然后将末端标记策略处理好的DNA‑6mA滴涂在修
饰电极表面,过夜孵育; PBS溶液清洗后,滴加MCH溶液,封闭1h,接着再滴加BSA溶液孵育半
小时;冲洗后,滴加6mA抗体溶液在37℃下孵育1h,再滴加标记有HRP的二抗溶液在37℃下孵
育1h;PBS冲洗晾干后,获得电化学传感器。具体如下:
电极表面;超纯水冲洗晾干后,得到金纳米粒子修饰的玻碳电极 (修饰电极);
孵育半小时;冲洗后,滴加抗体溶液在37℃下孵育1h,再滴加标记有HRP的二抗溶液在37℃
下孵育1h;PBS冲洗晾干后,即得电化学传感器。
化基因浓度为10 ~10 M。
端,使得待测基因的5'端带有巯基基团;通过Au‑S的共价相互作用,待测基因可以直接固定
到金纳米粒子修饰的玻碳电极表面;抗体能特异性识别待测基因中的甲基化位点,并与其
结合;接着,标记有HRP的二抗又能与抗体特异性结合;HRP是一种辣根过氧化物酶,能够催
化过氧化氢和对苯二酚的氧化还原反应,产生电子转移,此过程能够被电化学工作站监测
到,并且转化为可以定量检测的电信号;待测基因中甲基化位点越多,电信号就越大,从而
可以实现基因甲基化水平的电化学检测。
子修饰的玻碳电极上,过夜孵育;然后将修饰电极分别置入铁氰化钾溶液中进行循环伏安
测量,结果如图2所示,经过处理的待测基因对应的曲线 c信号响应最小,这是因为待测基
因经过处理带上巯基基团后可以大量固定在修饰电极表面,从而阻碍了电子传递,造成电
流响应最小。未经过处理的待测基因对应的曲线a和空白对应的曲线b相差无几,表明所采
取的末端标记策略可以有效应用于待测基因的巯基化修饰。
曲线a信号响应最大,其他状态的待测基因与空白的信号响应相差不大,表明所构建的电化
学传感器对于甲基化基因的检测具有高选择性,并且该传感器可以有效应用于甲基化基因
的检测。
图4可知,随着DNA‑6mA浓度的增加,电信号响应值也在不断增大,且在10 M到10 M呈现出
良好的线性关系。
也应视为本发明的保护范围。